High Throughput Screening Assessment van het genereren van reactieve zuurstofsoorten (ROS) met behulp van dihydroethidium (DHE) fluorescentiekleurstof
Summary
Dit protocol beschrijft een nieuwe methode om intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te kwantificeren met behulp van dihydroethidium (DHE) als fluorescentiekleurstofsonde met behulp van een high-throughput screeningbenadering. Het protocol beschrijft de methoden voor kwantitatieve beoordeling van intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de drie verschillende hepatocellulaire carcinoomcellijnen.
Abstract
Reactieve zuurstofsoorten (ROS) spelen een sleutelrol bij de regulatie van het cellulaire metabolisme in fysiologische en pathologische processen. Fysiologische ROS-productie speelt een centrale rol in de ruimtelijke en temporele modulatie van normale cellulaire functies zoals proliferatie, signalering, apoptose en senescentie. Chronische ROS-overproductie daarentegen is verantwoordelijk voor een breed spectrum aan ziekten, zoals onder andere kanker, hart- en vaatziekten en diabetes. Het kwantificeren van ROS-niveaus op een nauwkeurige en reproduceerbare manier is dus essentieel voor het begrijpen van de normale cellulaire functionaliteit. Op fluorescentiebeeldvorming gebaseerde methoden om intracellulaire ROS-soorten te karakteriseren is een veelgebruikte benadering. Veel van de ROS-protocollen voor beeldvorming in de literatuur gebruiken 2′-7′-dichloordihydrofluoresceïnediacetaat (DCFH-DA) kleurstof. Deze kleurstof heeft echter aanzienlijke beperkingen in het gebruik en de interpreteerbaarheid. Het huidige protocol demonstreert het gebruik van een dihydroethidium (DHE) fluorescentiesonde als een alternatieve methode om de totale ROS-productie in een high-throughput omgeving te kwantificeren. Het high throughput imaging platform, CX7 Cellomics, werd gebruikt om de ROS-productie te meten en te kwantificeren. Deze studie werd uitgevoerd in drie hepatocellulaire kankercellijnen – HepG2, JHH4 en HUH-7. Dit protocol geeft een diepgaande beschrijving van de verschillende procedures die betrokken zijn bij de beoordeling van ROS in de cellen, waaronder: bereiding van DHE-oplossing, incubatie van cellen met DHE-oplossing en meting van DHE-intensiteit die nodig is om de ROS-productie te karakteriseren. Dit protocol toont aan dat DHE fluorescerende kleurstof een robuuste en reproduceerbare keuze is om intracellulaire ROS-productie op een high-throughput manier te karakteriseren. Benaderingen met een hoge doorvoer om de ROS-productie te meten, zijn waarschijnlijk nuttig in een verscheidenheid aan onderzoeken, zoals toxicologie, drugsscreening en kankerbiologie.
Introduction
Reactieve zuurstofsoorten (ROS) zijn een groep van natuurlijk voorkomende, zeer reactieve en tijdelijk onstabiele chemische radicalen die worden gevormd als onderdeel van het normale cellulaire metabolisme in cellen. ROS speelt een belangrijke en essentiële rol bij de modulatie van normale fysiologische en biochemische processen die plaatsvinden in cellen 1,2. De belangrijkste bron van ROS-productie in cellen is afkomstig van de mitochondriale elektronentransportketen (ETC)-route als onderdeel van de normale bio-energetische cyclus. Belangrijke aanvullende bronnen van ROS-productie zijn enzymatische reacties zoals cellulaire NADPH-oxidasen in cellen. Het metabolisme van voedselmoleculen (bijv. glucose) vindt plaats via de oxidatieve fosforyleringsroute in de mitochondriale matrix. Een basisniveau van ROS-productie is essentieel om normale fysiologische celsignaleringsprocessen te reguleren. Van veel belangrijke eiwitmoleculen die deel uitmaken van de glucosemetabole signaleringsroutes (bijv. Akt en PTEN) is bekend dat ze reageren op intracellulaire ROS-niveaus. Bovendien worden ROS geproduceerd door verschillende intracellulaire enzymen zoals xanthine-oxidase, stikstofmonoxidesynthase en peroxisomale bestanddelen als onderdeel van de cellulaire enzymatische routes 1,2. In tegenstelling tot de natuurlijke bronnen van ROS, leiden bepaalde omgevingsfactoren, zoals xenobiotica, infectieuze agentia, UV-licht, vervuiling, het roken van sigaretten en straling, ook tot overmatige productie van ROS, die een belangrijke oorzaak zijn van intracellulaire oxidatieve stress 1,3. Verhoogde cellulaire oxidatieve stress kan schade veroorzaken aan natuurlijke biomoleculen in een cel, zoals lipiden, eiwitten en DNA, en verschillende ziekten veroorzaken, zoals kanker, diabetes, hart- en vaatziekten, chronische ontstekingen en neurodegeneratieve aandoeningen 1,3,4. Daarom zijn nauwkeurige metingen van ROS essentieel om de cellulaire mechanismen te begrijpen die betrokken zijn bij de pathofysiologie van oxidatieve stress-geïnduceerde ziekten.
Vanwege de korte tijdschalen van ROS-productie en -eliminatie in cellen, blijven kwantitatieve metingen van verschillende ROS-radicalen een uitdaging. Methoden zoals elektronenparamagnetische resonantie (EPR)5, hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) en beeldvorming op basis van fluorescentiesondes worden gebruikt om de verschillende cellulaire ROS6 te meten. Hoewel methoden zoals EPR en HPLC kwantitatief nauwkeurige schattingen opleveren, omvatten deze methoden de vernietiging van de cellulaire ruimtelijke morfologie en zijn ze meestal in de vorm van globale en bulkmetingen van een monster. Daarentegen behouden op beeldvorming gebaseerde methoden, zoals op fluorescentiesondes gebaseerde methoden, de cellulaire morfologie en ruimtelijke context van de ROS-generatie. De specificiteit van verschillende fluorescentiesondes voor verschillende soorten ROS-radicalen is echter niet goed vastgesteld 7,8. Verschillende fluorescerende sondes zoals dihydroethidium (DHE), dichloordihydrofluoresceïnediacetaat (DCFH-DA), dihydrorhodamine (DHR), dimethylantraceen (DMA), 2,7-dichloordihydrofluresceïne (DCFH), 1,3-difenylisobenzofuraan (DPBF) en MitoSox zijn commercieel beschikbaar voor ROS-detectie. In de afgelopen decennia zijn DHE, MitoSox en DCFH-DA de meest gebruikte fluorescerende kleurstoffen om ROS in cellen en weefsels te meten 8,9. DCFH-DA is een veelgebruikte kleurstof voor het detecteren van intracellulaireH2O2 en oxidatieve stress. Ondanks de populariteit van DCFH-DA, hebben meerdere eerdere onderzoeken aangetoond dat het niet betrouwbaar kan worden gebruikt om intracellulaire H2O2 en andere ROS-niveaus 8,9,10,11,12,13,14 te meten.
De fluorescerende sonde dihydroethidium (DHE) daarentegen vertoont een specifieke respons op de intracellulaire superoxideradicaal (O2–). Hoewel het superoxideradicaal een van de vele ROS-soorten is die in cellen worden waargenomen, is het een belangrijk radicaal dat betrokken is bij de vermindering van overgangsmetalen, omzetting in peroxynitraat en de vorming van hydroperoxiden, naast andere intracellulaire effecten. DHE wordt snel opgenomen door de cellen en heeft een fluorescentie-emissie in het rode golflengtebereik15. Bij reactie met specifiek superoxideradicaal vormt DHE een rood fluorescerend product, 2-hydroxy-ethidium (2-OH-E+). DHE kan dus worden beschouwd als een specifieke sonde voor de detectie van superoxide. DHE kan echter ook niet-specifieke oxidatie ondergaan met ONOO- of OH., H2O2 en cytochroom c om een tweede fluorescentieproduct te vormen, ethidium E+, dat de gemeten 2-OH-E+-niveaus kan verstoren. Deze 2-OH E+ en E+ producten, in combinatie, vertegenwoordigen echter een groot deel van de totale cellulaire ROS-soorten die in een cel worden waargenomen wanneer ze worden gekleurd met DHE. E+ intercaleert in DNA, waardoor de fluorescentie ervan aanzienlijk wordt verbeterd 8,9,10,11,13,14,15,16. Aangezien de fluorescentiespectra van ethidium en 2-hydroxyethidium slechts in geringe mate verschillen, kan de meerderheid van de ROS-niveaus die worden waargenomen in een cel secundair aan superoxideproductie worden gedetecteerd en gemeten met behulp van DHE-fluorescentieproducten. Deze ROS-soorten worden geïdentificeerd met behulp van 480 nm golflengte-excitatie en 610 nm golflengte-emissie 15,16,17.
Naast het kiezen van een specifieke fluorescerende ROS-detectiesonde, is het belangrijk om een gevoelige detectiemethode te kiezen om intracellulaire ROS te meten. Nauwkeurige beoordeling van intracellulaire ROS-niveaus is dus de sleutel tot het identificeren van verstoorde redoxbalanstoestanden die optreden in zieke cellen of cellen die zijn blootgesteld aan verschillende omgevingsstressoren zoals straling, toxicologische verbindingen en genotoxische agentia18. Aangezien ROS een veel voorkomend fenomeen is in cellen dat verantwoordelijk is voor het reguleren van een verscheidenheid aan celsignaleringsactiviteiten, zijn robuuste detectiemethoden van ROS essentieel. Om een dergelijke high-throughput evaluatie van de ROS-productie in cellen mogelijk te maken, maakt dit protocol gebruik van een high-content screening (HCS)-platform om de ROS-soorten te meten. Het huidige protocol maakt de high-throughput analyse van intracellulaire ROS-productie mogelijk, wat van cruciaal belang is in veel toxicologische studies19. Dit protocol heeft tot doel een eenvoudige en veelzijdige oplossing te bieden voor het detecteren en meten van intracellulaire ROS in aanhangende hepatocellulaire carcinoomcellen. De chemische reagentia vanH2O2 en menadion worden gebruikt als krachtige ROS-stimulatoren om de relatieve niveaus van ROS-productie te meten in een gecontroleerde omgeving met hoge doorvoer. Dit protocol kan worden verfijnd om de ROS-productie in aanhangende en niet-aanhangende cellen onder passende omstandigheden te meten, indien nodig.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie werd een protocol opgesteld om de productie van superoxide-gedreven intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te beoordelen met behulp van dihydroethidium (DHE) fluorescentiekleurstof op een screeningsysteem met een hoog gehalte. Een meerderheid van de huidige protocollen die in de literatuur beschikbaar zijn, gebruiken de DCFH-DA als een fluorescentiebeeldvormingssonde om ROS-soorten te kwantificeren. Meerdere onderzoeken hebben echter aangetoond dat de DCFH-DA geen ideale sonde is voor het meten va…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RK en RRG werden ondersteund door een subsidie van het UNM Center for Metals in Biology and Medicine (CMBM) via NIH NIGMS-subsidie P20 GM130422. RRG werd ondersteund door een pilotprijs van de NM-INSPIRES P30-subsidie 1P30ES032755. De ondersteuning van de beeldvormingskern voor het CX7 Cellomics-instrument werd geleverd via de AIM-centrumkernen die werden gefinancierd door NIH-subsidie P20GM121176. We willen Dr. Sharina Desai en Dr. Li Chen bedanken voor hun onschatbare hulp bij technische problemen met betrekking tot het gebruik van het CX7 Cellomics-beeldvormingsplatform.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | VWR | 20170-038 | |
| 96- well plate | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| Collagen | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE (Dihydroethidium) | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.0 | |
| HepG2 cell line | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 cell line | ATCC | ||
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 88597 | |
| JHH4 cell line | ATCC | ||
| Menadione | Sigma | M5625 |
References
- Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642 (2021).
- Magnani, F., et al. Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases. Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).
- Collin, F. Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 20 (10), 2407 (2019).
- Uttara, B., et al. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).
- Dikalov, S. I., et al. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
- Wang, Q., et al. Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels. Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).
- Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
- Gomes, A., et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Halliwell, B., et al. . Free radicals in biology and medicine. , (2015).
- Cho, S., et al. Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence. Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).
- Dikalov, S. I., et al. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).
- Kalyanaraman, B., et al. Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling. Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).
- Zielonka, J., et al. Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine. Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).
- Nazarewicz, R. R., et al. Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy. J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
- Ameziane-El-Hassani, R., et al. Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence. Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).
- Abraham, , et al. High content screening applied to large-scale cell biology. Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).
- Criddle, D. N., et al. Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells. J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).
- Goffart, S., et al. The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells. Cells. 10 (5), 1075 (2021).
- Kurutas, E. B. The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutr J. 15 (1), 71 (2015).
- Shad, K. F., Das, T. K. Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy. Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).
