Dihydroethidium(DHE) 형광 염료를 사용한 활성 산소종(ROS) 생성의 고처리량 스크리닝 평가
Summary
이 프로토콜은 고처리량 스크리닝 접근 방식을 사용하여 형광 염료 프로브로 디하이드로에티듐(DHE)을 사용하여 세포 내 활성 산소종(ROS)을 정량화하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 세 가지 서로 다른 간세포 암종 세포주에서 세포 내 활성 산소종(ROS)의 정량적 평가 방법을 설명합니다.
Abstract
활성산소종(ROS)은 생리학적 및 병리학적 과정에서 세포 대사를 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 생리적 ROS 생산은 증식, 신호 전달, 세포 사멸 및 노화와 같은 정상적인 세포 기능의 공간적, 시간적 조절에 중심적인 역할을 합니다. 대조적으로, 만성 ROS 과잉 생산은 암, 심혈관 질환 및 당뇨병과 같은 광범위한 질병의 원인이 됩니다. 따라서 ROS 수준을 정확하고 재현 가능한 방식으로 정량화하는 것은 정상적인 세포 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 세포 내 ROS 종을 특성화하기 위한 형광 이미징 기반 방법은 일반적인 접근 방식입니다. 문헌에 있는 많은 이미징 ROS 프로토콜은 2′-7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA) 염료를 사용합니다. 그러나 이 염료는 사용법과 해석 가능성에 상당한 제한이 있습니다. 현재 프로토콜은 고처리량 설정에서 총 ROS 생산량을 정량화하기 위한 대체 방법으로 디하이드로에티듐(DHE) 형광 프로브를 사용하는 방법을 보여줍니다. 고처리량 이미징 플랫폼인 CX7 Cellomics를 사용하여 ROS 생산량을 측정하고 정량화했습니다. 이 연구는 HepG2, JHH4 및 HUH-7의 세 가지 간세포암 세포주에서 수행되었습니다. 이 프로토콜은 DHE 용액 준비, DHE 용액을 사용한 세포 배양 및 ROS 생산을 특성화하는 데 필요한 DHE 강도 측정을 포함하여 세포 내 ROS 평가와 관련된 다양한 절차에 대한 심층적인 설명을 제공합니다. 이 프로토콜은 DHE 형광 염료가 고처리량 방식으로 세포 내 ROS 생산을 특성화하기 위한 강력하고 재현 가능한 선택임을 보여줍니다. ROS 생산을 측정하기 위한 고처리량 접근법은 독성학, 약물 스크리닝 및 암 생물학과 같은 다양한 연구에 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
활성산소종(ROS)은 세포의 정상적인 세포 대사의 일부로 형성되는 자연적으로 발생하고 반응성이 높으며 일시적으로 불안정한 화학 라디칼 그룹입니다. ROS는 세포 1,2에서 발생하는 정상적인 생리학적 및 생화학적 과정의 조절에 핵심적이고 필수적인 역할을 합니다. 세포에서 ROS 생산의 주요 원천은 정상적인 생체 에너지 주기의 일부인 미토콘드리아 전자 수송 사슬(ETC) 경로에서 비롯됩니다. ROS 생산의 중요한 추가 소스에는 세포 내 세포 NADPH 산화효소와 같은 효소 반응이 포함됩니다. 식품 분자(예: 포도당)의 대사는 미토콘드리아 기질의 산화적 인산화 경로를 통해 발생합니다. ROS 생산의 기본 수준은 정상적인 생리적 세포 신호 전달 과정을 조절하는 데 필수적입니다. 포도당 대사 신호 전달 경로(예: Akt 및 PTEN)의 일부인 많은 주요 단백질 분자는 세포 내 ROS 수준에 반응하는 것으로 알려져 있습니다. 또한 ROS는 세포 효소 경로의 일부로서 크산틴 산화효소, 산화질소 합성효소 및 과산화솜 성분과 같은 다양한 세포 내 효소에 의해 생성됩니다 1,2. ROS의 천연 공급원과 달리 생체 이물, 감염원, 자외선, 오염, 흡연 및 방사선과 같은 특정 환경 요인은 세포 내 산화 스트레스의 핵심 동인인 ROS의 과도한 생성을 유발합니다 1,3. 세포 산화 스트레스가 증가하면 지질, 단백질, DNA와 같은 세포 내부의 생체 분자가 손상되어 암, 당뇨병, 심혈관 질환, 만성 염증 및 신경 퇴행성 질환과 같은 다양한 질병을 유발할 수 있습니다 1,3,4. 따라서 ROS의 정확한 측정은 산화 스트레스 유발 질병 병태생리학과 관련된 세포 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.
세포 내에서 ROS 생성 및 제거의 짧은 시간 척도로 인해 다양한 ROS 라디칼의 정량적 측정은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 전자 상자성 공명(EPR)5, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 형광 프로브 기반 이미징과 같은 방법을 사용하여 다양한 세포 ROS6를 측정합니다. EPR 및 HPLC와 같은 방법은 정량적으로 정확한 추정치를 산출하지만, 이러한 방법은 세포 공간 형태학의 파괴를 수반하며 일반적으로 샘플의 전체 및 대량 측정 형태입니다. 대조적으로, 형광 프로브 기반 방법과 같은 이미징 기반 방법은 ROS 생성의 세포 형태 및 공간적 맥락을 유지합니다. 그러나 다양한 유형의 ROS 라디칼에 대한 다양한 형광 프로브의 특이성은 잘 확립되지 않았습니다 7,8. 디하이드로에티듐(DHE), 디클로로디하이드로플루오레세인 다이아세테이트(DCFH-DA), 디하이드로로로다민(DHR), 디메틸 안트라센(DMA), 2,7 디클로로디하이드로플루레세인(DCFH), 1,3-디페닐이소벤조푸란(DPBF) 및 MitoSox와 같은 여러 형광 프로브를 ROS 검출에 상업적으로 사용할 수 있습니다. 지난 수십 년 동안 DHE, MitoSox 및 DCFH-DA는 세포 및 조직에서 ROS를 측정하는 데 일반적으로 사용되는 형광 염료입니다 8,9. DCFH-DA는 세포 내 H2O2 및 산화 스트레스를 검출하는 데 널리 사용되는 염료입니다. DCFH-DA의 인기에도 불구하고, 이전의 여러 연구에서는 세포 내 H2O2 및 기타 ROS 수준 8,9,10,11,12,13,14를 측정하는 데 안정적으로 사용할 수 없다는 것을 보여주었습니다.
대조적으로, 형광 프로브 디하이드로에티듐(DHE)은 세포 내 과산화물 라디칼(O2–)에 대한 특이적 반응을 나타낸다. 과산화물 라디칼은 세포에서 관찰되는 많은 ROS 종 중 하나이지만, 다른 세포 내 효과 중에서도 전이 금속의 환원, 과산화질산염으로의 전환, 하이드로퍼옥사이드의 형성에 관여하는 중요한 라디칼입니다. DHE는 세포에 의해 빠르게 흡수되고 적색 파장 범위15의 형광 방출을 갖습니다. 과산화물 라디칼과 특이적으로 반응하면 DHE는 적색 형광 생성물인 2-하이드록시 에티듐(2-OH-E+)을 형성합니다. 따라서, DHE는 과산화물 검출을 위한 특정 프로브로 간주될 수 있다. 그러나 DHE는 ONOO- 또는 OH., H2O2 및 시토크롬 c와 함께 비특이적 산화를 거쳐 두 번째 형광 생성물인 에티듐 E+를 형성할 수 있으며, 이는 측정된 2-OH-E+ 수준을 방해할 수 있습니다. 그러나 이러한 2-OH E+ 및 E+ 산물은 DHE로 염색할 때 세포 내에서 관찰되는 전체 세포 ROS 종의 주요 부분을 나타냅니다. E+는 DNA에 삽입되어 형광 8,9,10,11,13,14,15,16을 크게 향상시킵니다. 에티듐과 2-하이드록시 에티듐의 형광 스펙트럼은 약간만 다르기 때문에 과산화물 생산에 이차적인 세포에서 볼 수 있는 대부분의 ROS 수준은 DHE 형광 제품을 사용하여 검출 및 측정할 수 있습니다. 이러한 ROS 종은 480nm 파장 여기 및 610nm 파장 방출 15,16,17을 사용하여 식별됩니다.
특정 형광 ROS 검출 프로브를 선택하는 것 외에도 세포 내 ROS를 측정하기 위해 민감한 검출 방법을 선택하는 것이 중요합니다. 따라서 세포 내 ROS 수준의 정확한 평가는 방사선, 독성 화합물 및 유전 독성 물질과 같은 다양한 환경 스트레스 요인에 노출된 병든 세포 또는 세포에서 발생하는 교란된 산화 환원 균형 상태를 식별하는 데 중요합니다18. ROS는 다양한 세포 신호 전달 활동을 조절하는 세포에서 흔히 발생하는 현상이기 때문에 ROS를 검출하는 강력한 방법이 필수적입니다. 세포 내 ROS 생산에 대한 이러한 고처리량 평가를 가능하게 하기 위해 이 프로토콜은 HCS(High-Content Screening) 플랫폼을 사용하여 ROS 종을 측정합니다. 현재 프로토콜은 세포 내 ROS 생산의 고처리량 분석을 가능하게 하며, 이는 많은 독성학 연구에서 매우 중요합니다19. 이 프로토콜은 부착성 간세포 암종 세포에서 세포 내 ROS를 검출하고 측정하기 위한 쉽고 다양한 솔루션을 제공하는 것을 목표로 합니다. H2O2 및 메나 디온의 화학 시약은 강력한 ROS 자극제로 사용되어 제어 된 높은 처리량 설정에서 ROS 생산의 상대적 수준을 측정합니다. 이 프로토콜은 필요에 따라 적절한 조건에서 부착 및 비부착 세포의 ROS 생성을 측정하도록 미세 조정될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서는 디하이드로에티듐(DHE) 형광 염료를 사용하여 과산화물 구동 세포 내 활성 산소종(ROS) 생산을 평가하는 프로토콜을 고함량 스크리닝 시스템에 설정했습니다. 문헌에서 사용할 수 있는 대부분의 현재 프로토콜은 ROS 종을 정량화하기 위한 형광 이미징 프로브로 DCFH-DA를 사용합니다. 그러나 여러 연구에 따르면 DCFH-DA는 세포 내 ROS 측정에 이상적인 프로브가 아닙니다. 프로브로서 DCFH-DA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RK와 RRG는 NIH NIGMS 보조금 P20 GM130422를 통해 UNM CMBM(Center for Metals in Biology and Medicine)의 보조금으로 지원되었습니다. RRG는 NM-INSPIRES P30 보조금 1P30ES032755의 파일럿 상을 지원받았습니다. CX7 Cellomics 기기에 대한 이미징 코어 지원은 NIH 보조금 P20GM121176 자금을 지원하는 AIM 센터 코어를 통해 제공되었습니다. CX7 Cellomics 이미징 플랫폼 사용과 관련된 기술적 문제에 대해 귀중한 도움을 주신 Sharina Desai 박사와 Li Chen 박사님께 감사드립니다.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | VWR | 20170-038 | |
| 96- well plate | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| Collagen | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE (Dihydroethidium) | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.0 | |
| HepG2 cell line | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 cell line | ATCC | ||
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 88597 | |
| JHH4 cell line | ATCC | ||
| Menadione | Sigma | M5625 |
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