Summary
Vi præsenterer en ny tilgang til to-fotonmikroskopi af tumorlevering af fluorescerende mærkede jernoxidnanopartikler til glioblastom i en musemodel.
Abstract
Leveringen af intravenøst administreret kræftterapi til hjernetumorer er begrænset af blod-hjerne-barrieren. En metode til direkte at afbilde akkumulering og distribution af makromolekyler i hjernetumorer in vivo ville i høj grad forbedre vores evne til at forstå og optimere lægemiddelafgivelse i prækliniske modeller. Denne protokol beskriver en metode til realtids in vivo-sporing af intravenøst administrerede fluorescerende mærkede nanopartikler med to-foton intravital mikroskopi (2P-IVM) i en musemodel af glioblastom (GBM).
Protokollen indeholder en flertrinsbeskrivelse af proceduren, herunder anæstesi og analgesi af forsøgsdyr, oprettelse af et kranievindue, GBM-celleimplantation, placering af en hovedstang, gennemførelse af 2P-IVM-undersøgelser og postkirurgisk pleje til langsigtede opfølgningsundersøgelser. Vi viser repræsentative 2P-IVM-billedbehandlingssessioner og billedanalyse, undersøger fordele og ulemper ved denne teknologi og diskuterer potentielle applikationer.
Denne metode kan let ændres og tilpasses til forskellige forskningsspørgsmål inden for in vivo præklinisk hjernebilleddannelse.
Introduction
To-foton intravital mikroskopi (2P-IVM) er en fluorescensbilleddannelsesteknik, der muliggør visualisering af levende væv1.
Først udviklet i 1990'erne er 2P-IVM blevet brugt til in vivo-analyse af nethinden2, nyre3, tyndtarmen4, cochlea5, hjerte6, luftrøret7 og hjernen i forskellige prækliniske modeller 8,9. Inden for neurovidenskab har 2P-IVM fået betydning som en teknik til realtidsbilleddannelse af den sunde hjerne hos vågne dyr10 samt undersøgelse af sygdomme i nervesystemet som Alzheimers11, Parkinsons12 og glioblastom (GBM) 13,14,15,16.
2P-IVM tilbyder en elegant løsning til at studere tumormikromiljøet under udviklingen af GBM. Mens nogle tidligere undersøgelser fokuserede på in vitro17 og ex vivo modeller18, implementerede andre ortopiske19 og xenotropic20 in vivo modeller til undersøgelse af GBM. Madden et al. udførte native imaging af CNS-1 rottegliomcellelinje i en musemodel13. Ved hjælp af en ortopisk GL261-DsRed murinmodel udførte Ricard et al. en intravenøs administration af en fluorofor for at forbedre blodkarrene i tumorområdet i 2P-IVM14.
Her anvender vi 2P-IVM til sporing af tumorlevering af fluorescerende mærkede jernoxidnanopartikler (NP) i en ortopisk musemodel af GBM. Ved hjælp af et kranievindue giver denne metode os mulighed for at studere den rumlige tidsmæssige fordeling af NP'er i realtid i hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den dyreprocedure, der er beskrevet i denne protokol, er i overensstemmelse med kravene fra Det Administrative Panel for Laboratoriedyrs Pleje (APLAC).
1. Cellekultur
- Forberedelse af hætte
- Vask hænder, brug handsker og en laboratoriefrakke. Tænd for det biologiske sikkerhedsskab, og indstil rammeniveauet til en passende åbningshøjde. Lad emhætten rense i 3-5 min. Sprøjt emhætteområdet med 70% ethanol og tør det af med silkepapir.
- Sprøjt alle reagenser med 70% ethanol og tør ned med silkepapir. Flyt reagenserne ind i emhætten. Læg ikke genstande på grillen. Hvis der opstår spild i emhætten, skal du dække den med klude, sprøjte den med 70% ethanol og tørre igen.
- Efter eksperimentet skal du forsigtigt lukke lågene på hvert emne, tørre alle materialer af, fjerne genstande fra emhætten og overføre dem til deres oprindelige placering. Spray 70% ethanol i emhætten og tør den af. Luk rammen og sluk for det biologiske sikkerhedsskab.
- Fremstilling af et vækstmedium
- Tilsæt 50 ml 100% føtalt bovint serum (FBS) til 500 ml Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM). Tilsæt 5 ml antibiotika-antimykotisk opløsning (100x).
- Alle reagenserne ledes gennem en steril 500 ml filtreringsflaske (0,22 μm filter).
- Optøning af kryopræserverede celler
- I en laminar strømningshætte tilsættes 20 ml vækstmedium til en T75-kolbe. Kolben mærkes med navnet på cellerne, dato og passagenummer på kolben. I denne undersøgelse blev klæbende C6-gliomceller brugt.
- Cellerne tøs hurtigt op i et 37 °C vandbad. Må ikke hvirvel cellerne. Optø og brug straks cellerne.
- De optøede celler overføres til T75-kolben ved hjælp af en pipettespids på 1 ml. Pas på ikke at indføre bobler under overførselsprocessen, og undgå mellemstore rester i kolbens hals. Dette kan øge risikoen for mulig kontaminering.
- Ændring af mediet
- Skift substrat dagen efter optøning for at fjerne eventuelle resterende trypsin eller dimethylsulfoxid (DMSO) (trin 1.6). Derefter skal du ændre mediet mindst to gange om ugen eller mere, afhængigt af cellesammenløbsniveauet. Mediet skal ændres en dag efter passage for at eliminere trypsin.
- For at skifte medium skal du tænde aspirationsapparatet, fastgøre aspirationsglasrøret og aspirere alt mediet.
- Der tilsættes 20 ml vækstmedium (trin 1.2).
- Passerer cellerne
- Læg emhætten med de ting, der er nødvendige i løbet af eksperimentet.
- Brug en aspirationsglaspipet og sug alle medier væk, og sørg for, at glaspipetten er på kolbens ikke-celleside. I dette trin anbringes T75-kolben lodret.
- Tilsæt ~ 10 ml stuetemperatur (RT) fosfatbufret saltvand (PBS, Ca ++ og Mg ++ fri) eller Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS, Ca ++ og Mg ++ fri) på ikke-cellesiden. Cellerne vaskes kortvarigt med PBS ved at placere T75-kolben vandret med cellesiden nedad.
- Kolben anbringes straks lodret, og PBS/HBSS suges til mig. Gentag denne vask og aspirering 3 gange.
- Der tilsættes 2 ml trypsin (rekombinant eller animalsk afledt) på cellesiden (T75-kolben vandret, cellesiden nedad). Der inkuberes i en standard vævskulturinkubator (37 °C, 5% CO2) i 4 minutter. Triturer det en gang efter 2 minutter ved hjælp af en 5 ml pipette.
- Efter 4 minutters total inkubation overføres opløsningen til et 15 ml konisk rør. Tilsæt 8 ml vækstopløsning til det koniske rør (2 ml trypsiniserede celler + 8 ml medium = 10 ml i alt).
- Brug et andet tomt 15 ml konisk rør med et filter og overfør cellerne via en 25 ml pipette for at opnå individuelle celler.
- 1/10 (1 ml) af opløsningen (celle + medier + Tryp-LE) overføres til en T75-kolbe med 20 ml medier. Alternativt kan du tælle cellerne (trin 1.7). Skift mediet næste dag for at få en ikke-trypsin-medieløsning.
- Frysning af mediet og cellerne
- Optø 100% FBS i et 4 °C køleskab. Brug ikke vandbad eller varme, da dette kan beskadige proteinerne i FBS.
- For at forberede 50 ml frysemedier blandes 45 ml DMEM, 5 ml FBS og 5 ml DMSO. Aliquot det til 1-2 ml beholdere for at forhindre intermitterende optøning og proteinskader. Opbevar dem i -20 ° eller -80 °C fryser.
- For de resterende 9 ml opløsning (trin 1.5) tilsættes 1 ml medium for at nå 10 ml i alt. Centrifuger ved 300 x g i 4 min.
- Supernatanten fjernes og resuspenderes i 1 ml frysemedium (se ovenfor). Anbring cellerne i en frysebeholder i -80 °C fryser. Flyt cellerne til flydendeN2 til langtidsopbevaring efter 1 eller 2 dage.
- Tælling af cellerne
- For de resterende 9 ml (trin 1,5) skal du tilføje 1 ml medier for at nå 10 ml i alt. Centrifuger ved 300 x g i 4 min.
- Supernatanten fjernes og resuspenderes i 4 ml HBSS. Resuspender 10 μL celler i 80 μL HBSS + 10 μL 0,4% trypanblåt, fortyndingsfaktor = 10.
- Tag 17 μL af opløsningen og tæl fire 4 x 4 firkanter i et hæmocytometer. Gennemsnit tæller for de fire 4 x 4 kvadrater og gang med 104x fortyndingsfaktor for at få celler / ml.
2. Kirurgi
BEMÆRK: Det anbefales at udføre operationen af to forskere, hvor den ene person er ansvarlig for at forberede cellerne, blande tandcementen og generelt hjælpe med proceduren, mens den anden person fokuserer på at forblive steril. At have en anden manipulator til at hjælpe med den kirurgiske procedure reducerer sandsynligheden for, at der opstår kontaminering, betydeligt. At følge bedste kirurgiske praksis ville reducere chancerne for postoperative komplikationer. Figur 1A giver et overblik over kranievinduets komponenter.
- Generelle præparater
- Bekræft, at proceduren er godkendt af de lokale retningslinjer for dyrevelfærd, inden du starter.
BEMÆRK: Denne undersøgelse brugte 5 måneder gamle kvindelige NSG-mus (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) (n = 5). - Før operationen skal du autoklave alle kirurgiske instrumenter og sikre, at alle nødvendige forsyninger er tilgængelige. Udskriv anæstesi- og kirurgioptegnelserne.
- Sørg for, at dyrene ved ankomsten har mindst 1 uges akklimatisering til husdyrholdsrummet for at reducere yderligere postoperativ nød.
- På operationsdagen skal du sikre dig, at alle enheder (mikroskop, varmepude, sterilisator, bor, vakuum osv.) Bekræft, at anæstesimaskinen indeholder nok isofluran, og genopfyld om nødvendigt. For nye brugere kan kranievinduesproceduren tage op til 2 timer pr. Dyr; Derfor er det afgørende at have nok isofluran.
- Placer glasvinduerne og hovedstængerne i alkohol og forbered en beholder med saltvand. Dette vil sikre en jævn arbejdsgang uden større brud på steriliteten og holde tiden under anæstesi for hvert dyr så kort som muligt.
- Åbn alle kirurgiske materialer på en steril overflade på arbejdsstationen. For eksempel kan indersiden af en steril gasbindemballage anvendes til dette formål. Brug teknikken, der kun indeholder tips. Når du ikke bruger kirurgiske instrumenter, skal du placere spidserne på en steril overflade, såsom indersiden af emballagen til sterilt gasbind.
- Når du udfører flere operationer, skal du placere alle kirurgiske instrumenter i sterilisatoren mellem operationer for at desinficere dem. Når du udfører operationer på mere end 5 dyr, skal du bruge et nyt sæt autoklaverede instrumenter. Skift borespidsen ud, når den bliver stump for en ny for at undgå vævstraumer.
- Bekræft, at proceduren er godkendt af de lokale retningslinjer for dyrevelfærd, inden du starter.
- Anæstesi og præparater til kirurgi
BEMÆRK: Anæstesiopsætningen er identisk for operationen såvel som for billeddannelse.- Bedøv musen ved hjælp af isofluran (3% -5% til induktion) i et bedøvelseskammer. Efter at have sikret tilstrækkelig bedøvelsesdybde ved at teste pedaludtagningsrefleksen (fodpudeklemme på begge bagfødder), overføres dyret til en forberedelsesarbejdsstation. Bevar anæstesi over en næsekegle (1% -2%). Her påføres en øjensalve for at forhindre hornhindeskader. Kontroller regelmæssigt tabet af reflekser under operationen ved at kontrollere poterefleksen.
- Hvis der kræves identifikation af dyret, skal du bruge et ørestanseværktøj eller en saks til at markere ørerne eller bruge en markør til at markere halen.
- Fjern pelsen, der dækker kraniet mellem ørerne og øjnene med en hårfjerningscreme. Lad cremen stå så længe som angivet (30-60 s) af producenten for at undgå hudirritation. Sørg for, at cremen kommer i kontakt med hårrødderne ved at anvende den mod hårvækstretningen. Undgå at hårfjerningscremen kommer i kontakt med øjnene. Fjern eventuelle creme- og hårrester ved at rengøre området med saltvand. Alternativt kan du bruge klippere.
- For at undgå intra- og postoperativ smerte, infektion eller hævelse skal du administrere ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler (NSAID'er), opioider, antiinflammatoriske midler og antibiotika. Administrer carprofen (5-20 mg / kg, subkutan [SQ]), buprenorphin - vedvarende frigivelse (1 mg / kg SQ), cefazolin (20 mg / kg SQ) og dexamethason (0,2 mg / kg SQ) før operationen. Administrer ca. 0,3 ml 0,9% saltvand SQ for at undgå dehydrering.
- Derefter skrubbe området ved skiftevis at swabbing povidon-jod og isopropylalkohol tre gange i cirkulære bevægelser fra midten af kraniet til periferien.
- Kraniotomi procedure
- Overfør dyret til operationsbordet og læg det i ventral liggende på en varmepude (~ 37 ° C) for at sikre isotermiske forhold under proceduren. Hypotermi hos gnavere reducerer overlevelsesraten betydeligt og forlænger den postoperative genopretningsfase.
- Placer hovedet i den stereotaktiske ramme ved at placere ørestængerne og fortænderne. For ørestængerne skal du finde den zygomatiske bue og indsætte stængerne bag buerne. Start med at fastgøre den kontralaterale stang med den dominerende hånd (f.eks. Fastgør den venstre stang med din højre hånd, hvis du er højrehåndet) og fastgør derefter den modsatte side. Juster øre- og forænderstængernes positioner ved at dreje skruerne, hvis det er nødvendigt.
- Påfør øjensalve igen, hvis det er nødvendigt, og brug et stykke aluminiumsfolie til at dække øjnene. Dette forhindrer skader forårsaget af det lyse mikroskoplys og UV-lys, der bruges til at hærde cyanoacrylatlimmen senere (trin 2.5).
- Før snit skal du igen kontrollere for tåklemmerefleks; Juster om nødvendigt anæstesi i overensstemmelse hermed. Tilslut dyret til anæstesiovervågningsenheden ved at placere sensoren på bagpoten. Måling af hjertefrekvens og iltkoncentration i blodet ville hjælpe med at reducere dødeligheden og forbedre postoperativ restitution. Derudover erhverver respirationsfrekvensen ved visuelt at inspicere brystbevægelsen.
- Dæk dyrets krop med et drapering for at undgå hypotermi og forurening. Udfør en sidste povidon-jod vatpind, før operationen påbegyndes.
- Tag handsker på og en ren laboratoriefrakke.
BEMÆRK: Brug af sterile handsker anbefales på grund af procedurens invasivitet og for at mindske risikoen for postoperativ infektion og betændelse, der resulterer i sygelighed og tab af billedkvalitet i 2P-IVM (afsnit 5). - Løft huden på kraniet og skab et snit ved at holde saksen mellem højre øje og øre og skære mod venstre side af kraniet efter snitmærkerne. Fjern den resulterende runde hudklap.
BEMÆRK: Afhængigt af interesseområdet i hjernen og vinduesstørrelsen kan snitstedet og diameteren variere. Snittets størrelse skal være større end hovedets diameter for at give plads til montering (trin 2.5). Hvis det er nødvendigt, kan huden omkring snittet forsigtigt dissekeres for at skabe mere plads. - Fjern periosteum ved forsigtigt at ridse kraniets overflade med et skalpelblad eller en mikrocurrette. Vær forsigtig, når du fjerner periosteum omkring kraniesuturerne, da disse områder er skrøbelige og mere tilbøjelige til blødning. Brug saltvand og et vakuum til at holde det kirurgiske område rent for snavs. Skrab periosteum for at sikre bedre vedhæftning til cyanoacrylatlim og tandcement (trin 2.5)
- Identificer det område af hjernen, der skal udføre celleinjektionen. Til dette skal du bruge et atlas over de stereotaktiske koordinater for musehjernen. I henhold til hjernekoordinaterne skal du markere kranievinduets position ved hjælp af en biopsistans i samme diameter som vinduet, en kirurgisk pen eller en autoklaveret blyant.
- Hold boret i den dominerende hånd og ethvert andet instrument (sprøjte, tang) i den ikke-dominerende hånd. Undgå langvarig boring på samme sted. Boret skal bruges i udbrud for at undgå overophedning. I løbet af disse pauser skal du anvende koldt saltvand på calvarium for at holde det kirurgiske syn rent og for at forhindre overophedning. Brug den sensoriske feedback fra borespidsen til at registrere, hvornår kraniet er blevet perforeret fuldstændigt.
- Brug koldt saltvand i kombination med et vakuum til at rengøre kraniets overflade. Brug ikke gaze eller en applikator til bomuldsspids efter åbning af calvarium, da rester af bomuldstråde kan føre til en fremmedlegemereaktion ved forsegling af hjernevinduet.
- Under boringen skal du sikre dig, at banen og diameteren er af samme størrelse som glasdækslets. Gør dette ved at placere glasdækslet oven på kraniet og bekræfte, at glasdækslet passer nøjagtigt ind i kranievinduet.
- Når det er muligt at trykke kranieklappen ned ved forsigtigt at trykke på den, skal du bruge tang til forsigtigt at fjerne fragmentet fra det kirurgiske felt (figur 1B, venstre). Hvis det endnu ikke er muligt at trykke kraniet, skal du fortsætte med at bore i de områder af kranialvinduet, der stadig er forbundet med resten af kraniet og revurdere.
- Hvis der opstår mindre blødning, skal du bruge en hæmostatisk svamp kombineret med let tryk eller alternativt iskold saltvand for at reducere blodtab.
- Celleimplantation
- Forbered og tæl de celler, der skal implanteres, som beskrevet i (trin 1.7). Sørg for, at cellenummeret er 200.000 celler / μL.
BEMÆRK: Det anbefales at suspendere cellerne i en membranmatrix, der størkner ved RT. Dette vil forbedre succesraten for implanterede celler i hjernens parenchyma. - Overfør cellerne i en beholder med is til operationsrummet. Brug en gastæt mikroliter sprøjte. Før aspiration skal sprøjten opbevares på is for at undgå temperaturforskelle.
- Efter opsugning af 1 μL anbringes sprøjten inde i den stereotaktiske ramme.
BEMÆRK: En automatiseret stereotaktisk koordinatenhed, der viser positionerne i X-, Y- og Z-akserne, kan bruges til at spare tid. Det er også muligt manuelt at beregne positionerne baseret på lambda. Det anbefales ikke at injicere mere end 1,5 μl. Dette vil sikre, at det injicerede område ikke overfyldes, hvilket forårsager mislykket implantation, vækst uden for hjernens parenchyma eller metastaser. - Udfør implantation i V2MM-regionen (visuel cortex 2, mediomedial del) i hjernen, hvilket svarer til omtrent medial til lateral (M-L): -1,2 til -1,6 mm og dorsal til ventral (D-V): -2,6 til -3,5 mm koordinater.
- For to-foton billeddannelse (trin 4.6), implantere cellerne i de overfladiske hjerneområder, så tumormassen kan visualiseres gennem kraniale vindue senere. Injicer 0,5 μL (100.000 celler) ved anterior til posterior (A-P): 0,8 mm dybde. Bevæg nålen langsomt og trinvist, når du kommer ind i hjernen, og vent i 30 sekunder efter injektionen (figur 1B, midterste kolonne).
- Brug den samme fremgangsmåde, når du trækker nålen tilbage og forlader hjernevævet. Undgå at injicere tæt på ventriklerne, da cerebrospinalvæsken kan tilskynde til metastase i det centrale og perifere nervesystem.
- Forbered og tæl de celler, der skal implanteres, som beskrevet i (trin 1.7). Sørg for, at cellenummeret er 200.000 celler / μL.
- Lukning af kranievinduet
- Flyt hovedstangen og glasdækslet fra alkohol til en saltopløsning. Brug en vakuumspids eller tang til at navigere disse komponenter til det kirurgiske sted.
- Placer glasdækslet inde i kranievinduet, og læg en lille mængde cyanoacrylatlim mellem kraniet og glasdækslet. UV-aktiveret cyanoacrylatlim reducerer hærdetiden og undgår utilsigtet forskydning. Hvis der spildes lim på glasdækslet, skal du fjerne det med en applikator til bomuldsspids eller ved forsigtigt at ridse det af med den stumpe side af en skalpel, før det hærder helt.
FORSIGTIG: UV-lys er skadeligt for øjne og hud. Undgå øjen- og hudkontakt, mens limen hærdes. - Når du har fastgjort glasdækslet i kranievinduet, skal du anvende hovedstangen. Bland den to-komponent tandcement, placer hovedstangen, og påfør cementen på det omgivende område, hvilket sikrer kontakt mellem kraniet og hovedstangen. Rengør forsigtigt overflødig cement med spidsen af en sprøjte, en skalpel eller en borespids.
BEMÆRK: Dentalcement størkner meget hurtigt, så det anbefales at anvende det rettidigt. - Efter forsegling af kranievinduet skal du identificere, om der stadig er kranieområder mellem tandcement og hud. Hvis det er tilfældet, skal du anvende kirurgisk lim for at dække kraniet ved at lukke huden. Alternativt kan du udføre en enkelt sutur med et absorberbart suturmateriale.
3. Postkirurgisk genopretning og tumorvækst
- Opsving
- Overvåg dyret på en opvarmet pude i et genopretningsbur, indtil det genvinder fuld bevidsthed. Opbevar dyrene separat efter operationen for at reducere risikoen for skade.
- Administrer en restitutionsdiæt, såsom kommercielt tilgængelige vandgeler med elektrolytter eller sukkerarter. Alternativt kan du levere fugtet standard lab chow for at sikre nem ernæring og undgå dehydrering og hypoglykæmi.
- Overvågning
- Efter genopretning skal du overvåge dyret dagligt for tegn på smerte, nød eller infektion. Hvis det er nødvendigt, administrere smertestillende midler, antiinflammatoriske lægemidler eller antibiotika. Hvis et dyr når undersøgelsens endepunkt, skal du aflive det humant. Efter den sidste billeddannelsessession aflives musen ved kuldioxidkvælning efterfulgt af cervikal dislokation.
BEMÆRK: Eksempler på tidlige eutanasikriterier omfatter, men er ikke begrænset til, betydeligt vægttab (>20%), neurologiske lidelser, dyspnø, overdreven blødning under operationen eller udtalt stereotyp adfærd. Undersøg kranievinduet og rengør det med saltvand eller alkohol, når det er nødvendigt. - For at spore tumorvækst og planlægge billeddannelsestidspunkterne skal du udføre helkropsbioluminescensbilleddannelse (BLI). Til dette injiceres 150 mg/kg D-luciferin intraperitonealt og dyret afbildes efter 5-15 minutter.
- Efter genopretning skal du overvåge dyret dagligt for tegn på smerte, nød eller infektion. Hvis det er nødvendigt, administrere smertestillende midler, antiinflammatoriske lægemidler eller antibiotika. Hvis et dyr når undersøgelsens endepunkt, skal du aflive det humant. Efter den sidste billeddannelsessession aflives musen ved kuldioxidkvælning efterfulgt af cervikal dislokation.
4. Nanopartikel syntese
- Partikelpræparation
- Der tilsættes 11,17 ml Ferumoxytol (6 mmol Fe i alt) til en opløsning indeholdende 50 ml 5 M NaOH, 20 ml deioniseret vand (DI-vand) og 20 ml epichlorhydrin. Overhold faseadskillelse på dette stadium. Inkuber blandingen ved RT under forsigtig omrystning i 24 timer.
- Efter 24 timer bliver opløsningen ensartet. Fjern overskydende epichlorhydrin ved hjælp af dialyserør (12.000-14.000 Da cutoff) mod vand i 3 dage.
- Efter dialyse overføres den resterende opløsning i røret til en glasflaske (samlet volumen ~ 110 ml). Der tilsættes 30 ml ammoniakhydroxid, og blandingen omrøres ved 37 °C i 18-20 timer.
- Efter omrøring gentages dialyse mod vand i 3 dage. Overfør den resterende opløsning i dialyseslangen til en ny glasflaske med et samlet volumen ~ 110 ml.
- Fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugering
- Tag 27,5 ml aminfunktionaliserede partikler ud til FITC-konjugering. Koncentrer partiklerne ved hjælp af et 10 kDa ultracentrifugeringsfilter og vask med en buffer på pH 9 (Na2CO3/NaHCO3) ved 5752 x g ved 25 °C i 10 minutter.
- Der tilsættes 4 ml opløsning i filteret, og røret ultracentrifugeres ved 5752 x g ved 25 °C i 10 minutter. Kassér filtratet, og genopfyld filteret med buffer til en anden vaskerunde med samme protokol.
- Filtratet kasseres, og opløsningen opsamles i filteret ved hjælp af en pipet. Anslå den molære koncentration af partiklen ved massekoncentrationen af Ferumoxytol, forudsat at diameteren af hver partikel er 5 nm.
- FITC opløses i vandfrit dimethylsulfoxid (DMSO) ved 10 mg/ml. Tilsæt langsomt 1,4 ml DMSO-opløst FITC i den koncentrerede aminfunktionaliserede partikel. Det molære forhold mellem FITC: partikel er 20: 1. Derefter inkuberes opløsningen ved 4 °C i 8 timer i mørke.
- Sluk reaktionen ved at tilføje overskydendeNH3. H2O(den endelige koncentration afNH3. H2O er 50 mM), og lad derefter opløsningen forblive ved 4 °C i mørke i 2 timer. Overskydende FITC vaskes væk med Na2CO3 / NaHCO3 (pH 9) buffer gennem et 10 kDa filter ved 5752 x g ved 25 °C i 10 minutter. Opløsningens endelige pH justeres til 7,4 ved anvendelse af HCl vandig opløsning.
5. 2P-IVM
BEMÆRK: Til 2P-IVM-sessionerne blev der brugt et Prairie Ultima IV-mikroskop med et brugerdefineret trin (figur 2 og supplerende kodningsfil 1), der gør det muligt at justere kranievinduets position vandret og lodret. Fiji-software blev brugt til efterbehandling og billedanalyse. På denne måde kan laserstrålen justeres til at ramme glasset i en 90 ° vinkel, hvilket reducerer artefakter og forbedrer billedkvaliteten.
- Billedbehandling
- Tænd for Ti-Safir-laseren. Tænd for hovedsystemkontakten og Prairie View-softwaren.
- Bedøv dyret som beskrevet ovenfor (trin 2.2). Udfør billedbehandlingssessioner i op til 2 timer pr. dyr. Hold billedbehandlingstiden på et minimum for at reducere risikoen for anæstesikomplikationer og tilhørende sygelighed eller dødelighed.
- Immobiliser musen under to-fotonmikroskopet ved hjælp af et brugerdefineret trin (figur 1B, højre kolonne). Placer dyret i en udsat position på en opvarmet pude designet til gnaverkirurgi og fastgør den let ved hjælp af tape, mens du er opmærksom på ikke at indsnævre brystkassen. Placer en dråbe vand på kraniale vinduet og juster fokus.
- Få puls og iltning af blodet for at overvåge dyrenes vitale parametre. Placer sensoren på bagpoten, og hold overvågningsenheden uden for to-fotonbilleddannelseskammeret.
- Når dyret er på mikroskopstadiet, skal du justere hovedpositionen. Brug kikkerten og widefield fluorescerende belysning til at indstille RFP-filteret (Red Fluorescent Protein) og finde det ønskede billeddannelsesfelt (figur 1B, højre kolonne).
- Når prøvens retning og synsfelt er bestemt, skal du skifte mikroskopet fra widefield-tilstand til lysscanningsmikroskopitilstand (LSM).
- Sørg for, at Ti-Safir-laseren er låst ved 920 nm, og at alle skodder er åbne. Bring GaAsP fotomultiplikatorrørdetektorer (PMT) spændinger op til 500-600 V. Brug to PMT'er med filtersæt med båndpassager ved 595/50 (RFP) og 525/50.
- Tryk på Live Image , og rediger langsomt pockelcellen for at øge lasereffekten ved prøven, indtil et billede er synligt.
- Når et klart billede er opnået, skal du bruge softwaren og det motoriserede trin til at indstille toppen og bunden af en billedstak inden for det ønskede prøveområde. Pas på trinstørrelsen, og tag højde for, at Z-aksen justerer objektivets dybde.
- Med stigende dybde bliver billederne mørkere. Forøg pockels / PMT-forstærkningen langsomt for at holde billedet lyst. Pas på ikke at bruge for meget strøm, da det kan føre til fototoksicitet og vævsskade.
- Indstil en gemmesti, og start Z-serien. Det krydser automatisk til start- og slutpositionerne ved hjælp af de indstillede pockel / PMT-indstillinger. Når stakken er færdig, skal du bruge afspilningen til at se over stakken efter kvalitet. Når anskaffelsen af de nødvendige billeder er færdig, skal du slukke for Ti-Safir-laseren.
- Flyt dyret til et genopretningsbur som beskrevet ovenfor (trin 3.1).
- Afslut Prairie-visning, og sørg for, at alle data gemmes / overføres. Luk computeren, og luk al hardware.
- Efterbehandling med FIJI
BEMÆRK: Fiji er en open source-software med fokus på biologisk billedanalyse21.- Download FIJI med hensyn til operativsystemet. Udpak mappens indhold, og kør .exe filen.
- Træk .env-filen, der er indsamlet fra to-foton-billeddannelsen, til dialogboksen. Opdel kanalerne i forskellige billedfelter. Dette vil skabe to forskellige billeder med forskellige kanaler, det ene indeholder cellesignalet og det andet partikelsignalet.
- Kopier et af billederne, og klik på Filer > nyt > internt udklipsholder for at oprette et andet billede. Omdøb et af billederne til Kilde og det andet til Kopier.
- Brug kopibilledet, og klik på Behandl > Forbedr kontrast i dialogboksen. Klik på Normaliser og OK, og behandl derefter > jævn. Dette billede bruges til at oprette en maske og ikke til analyse. Klik på Billede > Juster > tærskel i dialogboksen. Brug den glideskala og metode, der er relevant at udtrække, og klik derefter på Anvend.
- Brug Process > Binary > Erode til at ødelægge enkelte pixel i baggrunden, og klik på Behandl > binær > Spile for at føje pixel til billedet igen.
- Klik på Behandl > billedberegner i dialogboksen, vælg kildebilledet som det første, og vælg det andet billede som kopi. Brug AND til at oprette skæringspunktet mellem begge billeder. Gentag det samme trin for det andet kanalbillede.
- Til signalanalyse uden for det vaskulære område skal du åbne et uændret kopieret billede og slette signalets vaskulære område med værktøjet Frihånds-ROI.
- Indstil ønskede parametre ved at gå til Analysér > Indstil målinger. Sørg for , at Areal, Integreret tæthed og Gennemsnitlig grå værdi er markeret.
- Analysér nu ved at analysere > måle. Et vindue med målingerne vises. Kopiér dataene til et regneark.
- Vælg nu et lille område af billedet, der ikke har fluorescens. Dette vil være baggrunden.
- Klik på Analysér > måling for det pågældende område. Kopiér data til et regneark.
- Gem det resulterende billede som File > Save as > Analyze-filtype til genmålinger eller publikationsformål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her udførte vi kranievindueskirurgi og indpodede C6-celler i en NSG-musemodel af GBM (n = 5). En korrekt forsegling mellem alle komponenter, der er involveret i oprettelsen af vinduet (figur 1A), vil sikre vinduernes holdbarhed til langvarig billeddannelse og desuden reducere sygeligheden. Ved hjælp af scenen tilpasset in vivo 2P-IVM (figur 2) kunne vi afbilde dyr under anæstesi i op til 2 timer uden større bevægelsesartefakter. Ca. 10 minutter efter intravenøs påføring af nanopartiklerne i GBM-bærende mus viser 2P-IVM det grønne, fluorescerende signal fra kar i tumorområdet, i overensstemmelse med intravaskulær lokalisering af de FITC-mærkede nanopartikler. Kun en lille mængde grøn-fluorescerende signal noteres uden for blodkarrene, hvilket indikerer begyndelsen ekstravasation af NP'er (figur 3A). Der ses en stigning i FITC-signalet, der stammer fra det ekstravaskulære rum, hvilket er i overensstemmelse med avanceret ekstravasation (figur 3B).
Figur 1. Placering af kranievinduer, kraniotomi, implantation og billeddannelse. (A) Tværsnit af den anatomiske placering af et kranievindue. Da hovedstangen er metalfri, er det muligt at udføre magnetisk resonansbilleddannelse eller magnetisk partikelbilleddannelse ud over to-foton intravital mikroskopi. (B) Oversigt (øverste række) og en detaljeret visning (nederste række) af kraniotomi (venstre), celleimplantation (midten) og 2-foton intravital mikroskopi (højre). Ved åbning af kraniet opstår overfladisk blødning (venstre) og absorberes hurtigt (midten). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Computerassisteret design (CAD) af scenen. CAD af det trin, der anvendes til in vivo 2-foton intravital mikroskopi, herunder en bidestang, stabilisering af hovedstangen og skruer til højde- og vinkeljusteringer. 3D CAD-filen findes i Supplemental Coding File 1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. In vivo 2-foton intravital mikroskopi billeder. Billeder erhvervet (A) 10 min og (B) 24 timer efter intravenøs nanopartikeladministration. Mens GBM-cellerne udsender fluorescerende signaler i det røde spektrum (venstre), visualiseres nanopartiklerne i hjernevævet i grønt (højre). # angiver ekstravaserede NP'er, * angiver et blodkar. Kun et begrænset antal partikler har gennemgået ekstravasation og er synlige i nærheden af tumorcellerne 10 minutter efter NP-administration. En overflod af partikler er synlig i området af GBM-celler, hvilket tyder på ekstravasation 24 timer efter NP-administration. Nanopartiklerne består af fluoresceinisothiocyanat (FITC) og jernoxidnanopartikler (Ferumoxytol). Skalabjælkerne repræsenterer 100 μm. Forkortelser: 2P-IVM: 2-foton intravital mikroskopi, RFP: rødt fluorescerende protein, GBM: glioblastom, FITC: fluoresceinisothiocyanat, NP: nanopartikler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende kodningsfil 1: 3D CAD-fil af scenen. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi præsenterer en metode til realtids in vivo NP-sporing ved hjælp af 2P-IVM gennem et kranievindue for at evaluere tumorleveringen af fluorescerende mærkede jernoxid-NP'er. Den kirurgiske teknik til denne procedure kræver en rolig hånd og avancerede eksperimentelle kirurgiske færdigheder. Det er tilrådeligt at øve sig i at bruge slagtekroppe eller fantomer, før du går videre til levende dyreoplevelse. Som et alternativ implementerede Hoeferlin et al. en robotboremaskine for at reducere termisk skade, minimere kirurgisk teknikvariation og standardisere kirurgi22.
Vinduets størrelse repræsenterer en anden kritisk parameter. Et større vindue ville muliggøre billeddannelse af en større del af tumoren med 2P-IVM. I litteraturen er størrelser mellem 3-7 mm beskrevet23. Større vinduer kan dog ikke rumme hjernens krumning, hvilket kan føre til øget regionalt pres24. For at overvinde denne tilbageholdenhed kan et såkaldt "glaskranium" bruges i stedet25. I sammenligning med traditionelle glasvinduer bruger denne metode buet glas, der imødekommer hjernens krumning og dermed giver mulighed for at skabe større vinduer, samtidig med at brændviddet på cortex reduceres. Denne type buet glas er ikke kommercielt tilgængeligt, og det har kun begrænsede anvendelser i 2P-IVM, da den buede overflade forårsager refleksionsartefakter, hvilket begrænser det område af vinduet, der kunne afbildes. Et andet alternativ er et siliciumbaseret vindue24. På den ene side giver denne metode mere fleksibilitet med hensyn til størrelsen og formen af det vindue, der skal oprettes. Derudover er der rapporteret sammenlignelige resultater med hensyn til vinduessvigt og betændelsesrater for klassiske glasvinduer. På den anden side har 2-foton-billedkvaliteten i polymerbaserede vinduer vist sig at falde hurtigere end i glasvinduer, hvilket gør det umuligt til langsigtede applikationer26. Et tyndt kranievindue repræsenterer et andet alternativ. Selvom det er mindre invasivt end det klassiske glasvindue, tillader det ikke GBM-celleimplantation ved hjælp af den samme teknik som beskrevet her. Derudover er det vanskeligt at opnå en ensartet kranietykkelse, og som følge heraf kan dette forårsage betydelige artefakter i 2P-IVM27.
Cellelinjen og mængden af GBM-celler, der implanteres, er andre vigtige overvejelser, når du planlægger undersøgelsens tidslinje. C6-rottegliomcellelinjen er en af de mest anvendte cellelinjer i GBM-forskning. Hos rotter og mus er der rapporteret celletal mellem 5 x 104 og 5 x 106 for intrakranielle implantationer 27,28,29,30,31. Som hovedregel kan der forventes hurtigere tumorvækst ved implantering af et højere antal celler. I denne protokol blev 1 x 105 celler implanteret, og billeddannelse blev udført på dag 11 og 12 efter implantation. Xin et al. implanterede 1 x 105 C6-celler i BALB/c nøgne mus og rapporterede påvisning af avanceret GBM i MR på dag 7 efter implantation og en øget dødelighed efter 15 dage30. Til sammenligning brugte Jia et al. et højere antal celler (1 x 106) og den samme musestamme og påviste en lille tumormasse på dag 7 i MR med en let forstyrret blod-hjerne-barriere (BBB), som påvist ved en lys Evans-blå plet i GBM-vævet32. På dag 14 var Evans blå plet stærkere end på dag 7, hvilket indikerer, at BBB var stærkt forstyrret. Til gengæld påvirker tumorvæksten også, hvor længe dyrene kan holdes i forsøget. Dette er en vigtig overvejelse af dyrevelfærd for langsgående billeddannelsesundersøgelser. Kroniske kranievinduer er rapporteret at være egnede til billeddannelse i op til 6 måneder efter implantation26.
De nanopartikler, der anvendes i denne protokol, består af jernoxid- og fluoroforkomponenter. Mulige anvendelser omfatter undersøgelse af tumorlevering af nye terapeutiske lægemidler, cellulær terapi og interventioner på tumorvaskulaturen og tumormikromiljøet. Forskellige lægemiddelkandidater og kombinationsterapier kan evalueres på cellulært og molekylært niveau. Jernoxidkomponenten i NP'erne muliggør multimodal billeddannelse med MR eller magnetisk partikelbilleddannelse ud over 2P-IVM. Mens MR repræsenterer en klinisk relevant billeddannelsesmodalitet, er dens anatomiske opløsning ringere end den for intravital mikroskopi33.
Denne metode har også visse begrænsninger. Hjernekoordinaterne i henhold til et musehjerneatlas er standardiseret for C57BL/6J-mus og skal justeres afhængigt af musestamme, køn og alder. Desuden kan der med to-foton-billeddannelse kun opnås en begrænset dybde på ca. 450 μm9. Derfor er kun delvis karakterisering af tumoren mulig med 2P-IVM, og regionale forskelle i tumoregenskaberne kunne gå glip af. Derudover blev kun to tidspunkter efter NP-administration inkluderet. Fremtidige undersøgelser, herunder flere tidspunkter efter intravenøs administration, vil muliggøre en mere detaljeret analyse af NP'ernes rumlige tidsmæssige opførsel i tumormikromiljøet.
Afslutningsvis evaluerede vi tumorleveringen af fluorescerende mærkede jernoxidnanopartikler ved hjælp af 2P-IVM i en musemodel af GBM. Denne metode kan let ændres, så den passer til forskellige forskningsområder og repræsenterer et vigtigt værktøj til in vivo hjernebilleddannelse inden for neurovidenskab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Stanford Wu Tsai Neuroscience Microscopy Service, Stanford Center for Innovations in Vivo Imaging (SCi3) - small animal imaging center, NIH S10 Shared Instrumentation Grant (S10RR026917-01, PI Michael Moseley, Ph.D.) og Stanford Preclinical Imaging Facility på Porter Drive for at levere udstyr og infrastruktur til dette projekt. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra National Institute for Child Health and Human Development, bevillingsnummer R01HD103638. Vi vil gerne takke Schnitzer-gruppen, Stanford University; Zuo-laboratoriet, Santa Cruz Universitet; og Neurovascular Imaging Laboratory, Boston Photonic Center, University of Boston, til uddannelsesmæssige diskussioner om to-fotonbilleddannelse og kraniale vinduesmodeller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride infusion solution | Baxter Corp | 533-JB1301P | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium |
Invitrogen | 11965-092 | |
| 1 mL syringes | BD | Luer-Lok syringe, REF309628 | |
| 10% FBS | Thermo fisher | Cytiva SH30910.03HI | |
| 10% DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| 2-photon microscope | Prairie Technologies, Bruker | Prairie Ultima IV | |
| Alcohol applicators, 70% | Medline Industries, LP | MDS093810 | |
| Alcohol, spray bottle | Decon Labs Inc | Decon SaniHol, 04-355-122 | |
| Aluminum foil | Reynold Brands | Reynold Wrap non-stick aluminum foil | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | SAS3 | |
| Anesthesia monitoring | Kent Scientific | MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid | Invitrogen | 15240-096 | |
| Betadine applicators | Professional Disposables International, Inc | S41125 | |
| Biopsy punch, 5 mm | Miltex | Size 5 | |
| Buprenorphine sustained release | Zoo Pharm | Bup SR Lab, 1.0 mg/mL | A generic drug can be used instead. |
| C6 rat glioma cell line | ATCC (American Tissue Culture Collection) | CCL-107 | |
| Cannulas | BD | 16 G, 1.1/2”, 30 G, 1” | |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl, 50 mg/ml | A generic drug can be used instead. |
| Cefazoline | Sagent Pharmaceuticals | 25021-101-10, 1 g/vial | A generic drug can be used instead. |
| Cell strainer, 40 µm | Fisher Scientific | 87711 | |
| Cotton tip applicators, 6” | Dyad Medical Sourcing, LLC | HCS1005 | |
| Dental cement | Stoelting Co | 51459 | Dental cement kit, clear, 2 components |
| Dexamethasone | Bimeda | 138RX, 2 mg/mL | A generic drug can be used instead. |
| DietGel | ClearH2O | Recovery, 72-06-502 | |
| Drape | Cardinal Health | Bio Shield Wrap | |
| Drill | Saeyang Microtech | Escort Pro, B08350 | |
| Drill tips | Hager & Meissinger GmbH | REF310104001001005 | Size 005, US 1/4 |
| FIJI imaging analysis software | National Institute of Health | https://imagej.net/software/fiji/ | |
| Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | |
| Gauze | Fisher HealthCare | Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469 | |
| Gelfoam | Ethicon Inc. | Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972 | |
| Germinator | Cellpoint Scientific | Germinator 500, No. 11688 | |
| Glass coverslips, 5 mm diameter | Fisher Scientific | Menzel Cover glass | |
| Gloves, non-sterile | Fisher Scientific | Nitrile powder-free medical examination gloves | |
| Gloves, sterile | Medline Industries, LP | MDS104070 | |
| Hair removal cream | Church & Dwight | Nair Hair remover lotion | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company Inc | Gastight #1701, 10 µL | |
| HBSS without Ca, Mg | Fisher Scientific | PI88284 | |
| Head bar | Hongway | 5 mm inner diameter O-rings | |
| Heating pad | Stoelting Co. | Rodent warmer X2 | |
| Insulin syringes | Exel International Medical Products | 29G x 1/2″ | |
| Iron oxide nanoparticles | Covis Pharma GmbH | Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501 | |
| Isoflurane | Dechra | 26675-46-7 | |
| Mice | Jackson Laboratories | NSG, Strain 005557 | |
| Microscope (surgery) | Seiler Medical | Seiler IQ Q-100-220 | |
| Nanoparticles | Custom | Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate | |
| Ophtalmic ointment | Major pharmaceuticals | Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964 | |
| Oxygen | Linde Gas & Equipment Inc. | High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540 | |
| Plastic cups | Georgia-Pacirif Consumer Products | Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400 | |
| Polyethylene tubing | Braintree Scientific | 50-195-5494 | |
| Scale | Ohaus Corp | CR2200 | |
| Scalpel | Integra Life Sciences Production Corp | Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel | |
| Scissors | Fisher Scientific | 13-804-18 | |
| Sealant | Henkel Corp | Loctite 4014 | |
| Single use lab gown | High Tech Conversions | 17-444-081 | |
| Stereotactic frame | Stoelting Co. | Stoelting New Standard TM | |
| Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems | Fisher Scientific | S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE | |
| Styrofoam box | N/A | N/A | |
| Surgical gloves | Cardinal Health | 19-163-108 | |
| Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive | 3M Animal Care Prodcuts | 1469SB | |
| Tail vein cathether | Custom | Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing | |
| TrypLE Express (1x), no phenol red | Invitrogen | 12604-039 | |
| Ultraviolett torch | Spring sunshine technology | Consciot |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. Transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina. J Vis Exp. 168, 61970 (2021).
- Zhang, K., et al. In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9+ to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment. J Biol Chem. 295 (34), 12203 (2020).
- Jang, W. H., et al. Two-photon microscopy of Paneth cells in the small intestine of live mice. Sci Rep. 8 (1), 14174 (2018).
- Ihler, F., Bertlich, M., Weiss, B., Dietzel, S., Canis, M. Two-photon microscopy allows imaging and characterization of cochlear microvasculature in vivo. Biomed Res Int. 2015, 154272 (2015).
- Matsuura, R., et al. Intravital imaging with two-photon microscopy reveals cellular dynamics in the ischeamia-reperfused rat heart. Sci Rep. 8 (1), 15991 (2018).
- Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Sci Rep. 7 (1), 694 (2017).
- Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).
- Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain. eNeuro. 17 (1), (2019).
- Birkner, A., Konnerth, A. Deep two-photon imaging in vivo with a red-shifted calcium indicator. Methods Mol Biol. 1929, 15-26 (1929).
- Busche, M. A. In vivo two-photon calcium imaging of hippocampal neurons in Alzheimer mouse models. Methods Mol Biol. 1750, 341-351 (2018).
- Li, L., et al. A sensitive two-photon probe to selectively detect monoamine oxidase B activity in Parkinson's disease models. Nat Commun. 5, 3276 (2014).
- Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (3), (2013).
- Ricard, C., et al. Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice. Sci Rep. 6, 26381 (2016).
- Soubéran, A., et al. Effects of VEGF blockade on the dynamics of the inflammatory landscape in glioblastoma-bearing mice. J Neuroinflammation. 16 (1), 191 (2019).
- Zhang, W., et al. Real-time vivo reveals specific nanoparticle target binding in a syngeneic glioma mouse model. Nanoscale. 14 (15), 5678-5688 (2022).
- Wartchow, K. M., et al. Treatment with cyclic AMP activators reduces glioblastoma growth and invasion as assessed by two-photon microscopy. Cells. 10 (3), 556 (2021).
- Jiang, L. W., et al. Label-free detection of fibrillar collagen deposition associated with vascular elements in glioblastoma multiforme by using multiphoton microscopy. J Microsc. 265 (2), 207-213 (2017).
- Chen, Z., Ross, J. L., Hambardzumyan, D. Intravital 2-photon imaging reveals distinct morphology and infiltrative properties of glioblastoma-associated macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (28), 14254-14259 (2019).
- Zhang, Y. S., et al. Labeling human mesenchymal stem cells with gold nanocages for in vitro and in vivo tracking by two-photon microscopy and photoacoustic microscopy. Theranostics. 3 (8), 532-543 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hoeferlin, G. F., Menendez, D. M., Krebs, O. K., Capadona, J. R., Shoffstall, A. J. Assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice. J Vis Exp. 189, 64188 (2022).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Sci Rep. 6, 27818 (2016).
- Kim, T. H., et al. Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex. Cell Rep. 17 (12), 3385-3394 (2016).
- Kılıç, K., et al. Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice. Front Physiol. 11, 612678 (2021).
- Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium-implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
- Lu, W., Sun, Q., Wan, J., She, Z., Jiang, X. G. Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles allow gene delivery into brain tumors via intravenous administration. Cancer Res. 66 (24), 11878-11887 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Xin, H., et al. Enhanced anti-glioblastoma efficacy by PTX-loaded PEGylated poly(ɛ-caprolactone) nanoparticles: In vitro and in vivo evaluation. Int J Pharm. 402 (1-2), 238-247 (2010).
- Valable, S., et al. In vivo MRI tracking of exogenous monocytes/macrophages targeting brain tumors in a rat model of glioma. Neuroimage. 40 (2), 972 (2008).
- Jia, Y., et al. Phototheranostics: Active targeting of orthotopic glioma using biomimetic proteolipid nanoparticles. ACS Nano. 13 (1), 386-398 (2021).
- Asan, L., et al. Cellular correlates of gray matter volume changes in magnetic resonance morphometry identified by two-photon microscopy. Sci Rep. 11, 4234 (2021).
