Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Social Defeat Stress-model voor adolescente C57BL/6 mannelijke en vrouwelijke muizen

Published: March 15, 2024 doi: 10.3791/66455
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2,3,4,5
1Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 2Douglas Mental Health University Institute, McGill University, 3Department of Psychiatry, McGill University, 4Department of Neurology and Neurosurgery, Faculty of Medicine, McGill University, 5Ludmer Centre for Neuroinformatics & Mental Health, McGill University

Summary

We ontwikkelden een versneld social defeat stress-model voor adolescente C57BL/6-muizen, dat werkt bij zowel mannetjes als vrouwtjes en blootstelling mogelijk maakt tijdens discrete adolescente periodes. Blootstelling aan dit model leidt tot sociale vermijding, maar alleen bij een subset van verslagen mannelijke en vrouwelijke muizen.

Abstract

Sociale tegenspoed in de adolescentie komt veel voor en kan een negatieve invloed hebben op geestelijke gezondheidstrajecten. Het modelleren van sociale stress bij adolescente mannelijke en vrouwelijke knaagdieren is nodig om de effecten ervan op de voortdurende hersenontwikkeling en gedragsresultaten te begrijpen. Het paradigma van chronische sociale nederlaagstress (CSDS) is op grote schaal gebruikt om sociale stress te modelleren bij volwassen C57BL/6 mannelijke muizen door gebruik te maken van het agressieve gedrag van een volwassen mannelijk knaagdier tegen een indringer die zijn territorium binnendringt. Een voordeel van dit paradigma is dat het het mogelijk maakt om verslagen muizen te categoriseren in veerkrachtige en vatbare groepen op basis van hun individuele verschillen in sociaal gedrag 24 uur na de laatste nederlaagsessie. Het implementeren van dit model bij adolescente C57BL/6-muizen was een uitdaging omdat volwassen of adolescente muizen doorgaans geen vroege adolescente mannelijke of vrouwelijke muizen aanvallen en omdat de adolescentie een korte levensperiode is, die discrete tijdelijke perioden van kwetsbaarheid omvat. Deze beperking werd overwonnen door een versnelde versie van de CSDS aan te passen voor gebruik bij adolescente mannelijke en vrouwelijke muizen. Dit 4-daagse stressparadigma met 2 fysieke aanvalssessies per dag maakt gebruik van een C57BL/6 mannelijke volwassene om de CD-1-muis voor te bereiden op agressiviteit, zodat deze gemakkelijk de mannelijke of vrouwelijke adolescente muis aanvalt. Dit model werd accelerated social defeat stress (AcSD) voor adolescente muizen genoemd. Blootstelling van adolescenten aan AcSD induceert 24 uur later sociale vermijding bij zowel mannen als vrouwen, maar alleen bij een subgroep van verslagen muizen. Dit beveiligingslek doet zich voor ondanks het feit dat het aantal aanvallen consistent is tussen sessies tussen veerkrachtige en vatbare groepen. Het AcSD-model is kort genoeg om blootstelling tijdens discrete perioden in de adolescentie mogelijk te maken, maakt de segregatie van muizen mogelijk op basis van de aan- of afwezigheid van sociaal vermijdingsgedrag, en is het eerste model dat beschikbaar is om sociale nederlaagstress bij adolescente C57BL/6 vrouwelijke muizen te bestuderen.

Introduction

Het paradigma van chronische sociale nederlaagstress wordt veel gebruikt om sociale stress te modelleren bij volwassen postnatale dag (PND) >65 mannelijke knaagdieren. Dit paradigma is gebaseerd op het natuurlijke agressieve gedrag van een volwassen mannelijk knaagdier wanneer een indringer zijn territorium binnendringt. Dit model wordt gebruikt bij een verscheidenheid aan knaagdiersoorten, waaronder ratten, hamsters en muizen 1,2,3,4,5,6,7,8,9, en bestaat uit een combinatie van fysieke agressie en psychologische stress die ongeveer 10 dagen duurt, waarin een indringer knaagdier een paar minuten fysieke agressie van het inwonende knaagdier experimenteert. De twee knaagdieren blijven in de huiskooi van de bewoner, gescheiden door een scheidingswand die sensorisch maar geen fysiek contact mogelijk maakt7. In muizenexperimenten zijn de meest gebruikte resident/agressor-muizen gepensioneerde fokkers Zwitserse CD-1-muizen, die robuust territoriaal gedrag vertonen tegen indringermuizen 6,7. Voor de indringermuizen is de best gekarakteriseerde stam de inteelt C57BL/6 stam 2,4,5. De verslagen muis wordt elke dag blootgesteld aan een nieuwe agressor om gewenning aan de agressor te voorkomen. Controlemuizen worden elke dag gehuisvest met een andere soortgenoot. 24 uur na de laatste nederlaagsessie worden experimentele muizen getest in een sociale interactietest (SIT) waarin ze een open veld kunnen verkennen in afwezigheid (geen doelwit) of aanwezigheid van een nieuwe CD-1-muis (doelwit). Controlemuizen brengen meer tijd door in de interactiezone met het doelwit dan in het niet-doelwitgedeelte van de taak. Verslagen muizen worden geclassificeerd als vatbaar (ratio<1) of veerkrachtig (ratio>1) volgens een sociale interactieratio (tijd doorgebracht in de interactiezone met aanwezige agressor/tijd doorgebracht in de interactiezone met agressor afwezig). Deze procedure biedt een nuttig hulpmiddel om individuele verschillen in reactie op stress te bestuderen.

Tot voor kort werd het stressmodel voor chronische sociale nederlagen vooral gebruikt bij volwassen mannelijke muizen, omdat de geaccentueerde mannelijke dominantiehiërarchieën gepaard gaan met vechten tegen mannetjes, maar niet tegen vrouwtjes 6,7. Bovendien vallen mannelijke knaagdieren meestal geen vrouwtjes aan; In plaats daarvan houden ze zich bezig met paringsgedrag10. Ondanks deze obstakels zijn er verschillende strategieën ontwikkeld om het paradigma van chronische sociale nederlaagstress voor volwassen vrouwelijke muizen aan te passen. Het Californische muismodel van sociale nederlaag is bijvoorbeeld gebaseerd op de natuurlijke agressie van deze monogame soort van beide geslachten bij het verdedigen van hun territorium 9,11. Andere benaderingen richten zich op het induceren van agressief gedrag van de CD-1-muizen door hun ventromediale hypothalamus te stimuleren om consistent agressief gedrag te vertonen10,12, of door mannelijke urine toe te passen bij de experimentele volwassen vrouwelijke muizen om aanvallen van CD-1-agressors te ontvangen13. Deze verhoogde en consistente agressie van de CD-1-muizen is van cruciaal belang voor de experimentele indringermuis om duidelijke gedragstekenen van ondergeschiktheid te vertonen ten opzichte van de herhaalde aanvallen van de agressor tijdens de duur van de interactie6.

Aanpassing van het chronische sociale nederlaagmodel voor gebruik bij adolescente C57BL/6muizen
De adolescentie is een periode die wordt gekenmerkt door een substantiële psychosociale rijping, die zich parallel ontvouwt met veranderingen in de micro- en macroarchitectuur van de hersenen, met name in de prefrontale cortex. Bij zowel mensen als knaagdieren is er weinig consensus over het specifieke begin en einde van de adolescentieperiode14,15. Bovendien zijn er kritieke perioden van kwetsbaarheid binnen de adolescentie voor door ervaring veroorzaakte verstoring van de voortdurende hersen- en cognitieve ontwikkeling 16,17,18,19. De puberteit en de adolescentie komen tegelijkertijd voor, maar deze termen zijn niet synoniem. De puberteit betekent het begin van seksuele rijping, terwijl de adolescentie een bredere fase vertegenwoordigt die wordt gekenmerkt door de geleidelijke overgang van een jeugdige staat naar het bereiken van onafhankelijkheid20. Verschillende groepen hebben gesuggereerd dat de adolescentie bij muizen zich uitstrekt van het spenen (PND 21) tot de volwassenheid (PND 60)21. Met name de vroege adolescentie kan worden aangeduid als de eerste en tweede week na het spenen (PND 21-34) en halverwege de adolescentie als de PND 35-48-periode. Deze bereiken omvatten discrete ontwikkelingsperioden met betrekking tot bijvoorbeeld de ontwikkeling van het dopaminesysteem 22,23,24, kwetsbaarheid voor geneesmiddeleffecten op zich ontwikkelende neuronale netwerken 17,25,26,27 en verschillende gedragskenmerken 16,20,28,29,30.

Vechtgedrag van de inwonende muis is vereist voor het sociale nederlaagprotocol. Net als bij vrouwelijke muizen gaan mannetjes echter doorgaans geen agressieve interacties aan met vroege adolescente muizen, mogelijk omdat ze deze niet als een bedreiging beschouwen. De meeste onderzoeken naar de effecten van chronische sociale nederlaag bij adolescente C57BL/6-muizen zijn uitgevoerd tijdens de mid-adolescente periode 31,32,33,34,35; anderen specificeren niet de postnatale dag van blootstelling van adolescenten36,37, of verlengen de dagen voor de nederlaag tot vroege volwassenheid38 of staan geen sensorisch contact toe39; Andere studies bij adolescente muizen gebruiken verschillende stammen40,41. De kenmerken van deze studies met behulp van chronische sociale nederlaagstress bij adolescente mannelijke muizen zijn samengevat in Tabel 1.

Onze onderzoeksgroep is geïnteresseerd in het richten op specifieke blootstellingsperioden van adolescenten, inclusief vroege adolescentie, bij C57BL/6-muizen. Vanwege de korte duur van de verschillende adolescente perioden werd een aangepaste versie van de versnelde versie van het paradigma van chronische sociale nederlaagstress ontworpen42. Dit model werd accelerated social defeat stress (AcSD) voor adolescente muizen genoemd. Eerder werk toont aan dat er significante sekseverschillen zijn in gevoeligheid voor sociale stress in de adolescentie bij ratten 8,26,43,44,45, evenals in de schadelijke effecten van sociale stress op geestelijke gezondheidstrajecten bij mensen 46,47,48,49,50,51,52, 53,54,55,56. Het AcSD-model werkt ook effectief voor adolescente vrouwelijke muizen, waardoor ze mogelijke seksespecifieke gevolgen kunnen onderzoeken en de neurobiologische basis kunnen verkennen.

Tabel 1: Studies waarbij gebruik wordt gemaakt van stressparadigma's voor sociale nederlagen bij adolescente mannelijke muizen. Stam en soort: Californische muis: Peromyscus californicus. C57BL/6: Mus musculus black 6 ingeteelde muizenstam. C57BL/6J: M. musculus black 6 inteelt muismodel geleverd door Jackson's laboratoria. CD-1: M. musculus uit een Zwitsers uitgefokt albino-muizenstam. ICR: M. musculus Institute of Cancer Research heeft de albino-muizenstam gekruist. OF1: M. musculus Oncins France 1 uitgeteelde albino muizenstam.
Afkortingen: wk = week; PND = Postnatale dag; res = veerkrachtig; SUS = vatbaar; unsus = onvatbaar. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadian Council of Animal Care en goedgekeurd door de McGill University en Douglas Hospital Animal Care Committee (goedkeuringsnummer dierproeven: 2005-5084). Alle muizen werden gehuisvest in een temperatuur- en vochtigheidsgecontroleerde (21-22 °C; 60%) koloniekamer en op een licht-donkercyclus van 12 uur (licht aan om 8:00 uur) in het Neurofenotyperingscentrum van het Douglas Mental Health University Institute. De muizen hadden tijdens de experimenten ad libitum toegang tot voedsel en water. Muizen werden willekeurig toegewezen aan elke experimentele conditie. Proefdieren werden verkregen uit een commerciële bron (zie Materiaaltabel). Tabel 2 geeft een overzicht van de kenmerken van het dier voor elke experimentele fase. In totaal werden 489 adolescente C57BL/6J-muizen (259 mannetjes; 230 vrouwtjes) gebruikt in 20 experimentele cohorten.

Tabel 2: Proefdieren voor elke experimentele fase. †Als deze dieren niet ernstig gewond raken, kunnen ze opnieuw worden gebruikt voor priming. "Als deze dieren niet ernstig gewond raken, kunnen ze opnieuw worden gebruikt voor priming tijdens AcSD, §Neurofenotypering Centrum van het Douglas Mental Health University Institute. Voor experimenten met mannetjes, #Voor experimenten met vrouwtjes, als de nederlaag gemengd is, gebruik dan vrouwtjes voor priming. ††Niet te gebruiken voor AcSD. Afkortingen: AcSD = versnelde sociale nederlaagstress; PND = Postnatale dag Klik hier om deze tabel te downloaden.

1. Acclimatisatie

LET OP: Deze fase duurt minimaal 1 week.

  1. Koop mannelijke CD-1 gepensioneerde fokmuizen (zie materiaaltabel) ouder dan 4 maanden en tweemaal de hoeveelheid van de adolescente C57BL/6J-muizen (d.w.z. als 10 muizen worden blootgesteld aan stress, koop dan 20 CD-1-muizen).
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om deze hoeveelheid CD-1-muizen aan te schaffen omdat slechts een klein deel van de CD-1-muizen agressief gedrag vertoont tegenover adolescente muizen.
  2. Laat de CD-1 mannetjesmuizen ad libitum wennen aan de nieuwe faciliteit in hun thuiskooi met voedsel en water gedurende 1 week voorafgaand aan de screening en priming.
  3. Gebruik C57BL/6 bij PND >65 (volwassenen) en PND 25 ± 3 (adolescenten) (tabel 2) voor de screening- en primingsessies. Verwerf 4 C57BL/6 muizen van elke leeftijd per dag priming (d.w.z. gedurende 3 dagen priming, verwerf 12 PND >65 en 12 PND 25 ± 3) om het risico op verwondingen te verminderen, omdat deze dieren herhaaldelijk zullen worden ingezet voor screening en priming-proces.

2. CD-1 screening en priming

OPMERKING: De duur van deze fase is 3 dagen screening (1 dag voor vrouwelijke muizen) en 3-4 dagen priming (dit kan toenemen voor vrouwelijke muizen en afhankelijk van het agressieve gedrag van de CD-1-muizen).

  1. Gebruik de operationele definitie van aanval om de aanvallen van de CD-1 te registreren zoals hieronder beschreven.
    1. Eén aanval wordt gedefinieerd als wanneer de CD-1-muis de C57BL/6J-muis bijt en de C57BL/6J-muis weggaat als reactie op de beet. Een beet wordt gedefinieerd als wanneer de CD-1-muis zijn tanden op een deel van het lichaam van de C57BL/6J-muis plaatst. Weggaan wordt gedefinieerd als wanneer de C57BL/6J-muis beide achterpoten beweegt vanuit de positie waarin ze zich bevonden voordat de CD-1 hem aanviel.
    2. Zorg ervoor dat er een verschil van ten minste ~2 s is tussen afzonderlijke aanvallen. Als er meer dan één beet plaatsvindt <2 s uit elkaar, tel dan als één aanval.
    3. Als de CD-1-muis meer dan eens achter elkaar bijt zonder onderbreking (<~2 s uit elkaar), scheid de dieren dan voorzichtig met een plastic liniaal. Als de CD-1-muis bijt en niet loslaat, scheid dan voorzichtig de dieren. Als de C57BL/6J-muis vast komt te zitten in een hoek of wordt vastgepind door de CD-1-muis en niet weg kan bewegen als reactie op een beet, scheid de dieren dan voorzichtig met een liniaal. Tel deze allemaal als één aanval (tot aan scheiding).
  2. Screening
    1. Gebruik nitril onderzoekshandschoenen voor alle handelingen met dieren en vermijd het gebruik van parfum of geurstoffen.
    2. Voer de 1edag van de screening alleen uit met volwassen C57BL/6 mannelijke muizen als indringers (PND >65) in de CD-1 muizen thuiskooi. Screen de CD-1-muizen altijd voordat u een nieuw experiment uitvoert.
    3. Introduceer een volwassen mannelijke C57BL/6 muis PND >65 in de thuiskooi van een CD-1 mannelijke muis gedurende 3 minuten. Registreer de latentie tot de eerste agressie en hoeveel agressies er worden uitgevoerd (zie aanvullende tabel 1).
    4. Introduceer van de2e tot de laatste dag van de screening een volwassen mannelijke C57BL/6 PND>65 gedurende 1 minuut (limiet tot 30 s als de CD-1 erg agressief is) en verwissel deze vervolgens met een adolescente C57BL/6 PND 25 ± 3 gedurende 5 minuten.
      OPMERKING: Het is belangrijk om de screening uit te voeren met adolescente muizen, omdat niet alle muizen die de volwassen C57BL/6 mannelijke muis aanvallen, de adolescente C57BL/6 zullen aanvallen. In feite zullen CD-1-muizen die adolescente muizen aanvallen, niet altijd volwassen C57BL/6-mannetjes aanvallen.
    5. Als het experiment gericht is op agressiviteit ten opzichte van vrouwelijke muizen, voer dan de screening en priming uit met adolescente vrouwelijke muizen, zelfs als de experimentele muizen beide geslachten omvatten.
    6. Registreer de latentie tot de eerste agressie, het aantal aanvallen en de verwondingen die alle C57BL/6-muizen hebben opgelopen (zie aanvullende tabel 2).
    7. Registreer elke vorm van interactie: jagen, opstijgen, snuffelen, vlooien of bijten. Registreer als de CD-1 de adolescente C57BL/6-muizen niet benadert; als dit gedrag gedurende 2 dagen wordt herhaald, neem dan de CD-1 niet op in de priming.
    8. Selecteer voor de priming-fase alle CD-1-muizen die gedrag vertonen zoals jagen, opstijgen, snuffelen, volgen, verzorgen of bijten van de adolescent C57BL/6.
    9. Bewaar de niet-geselecteerde CD-1-muizen en gebruik ze voor de sociale interactietest (SIT).
      OPMERKING: Territoriaal gedrag neemt toe met de tijd; daarom kunnen de niet-geselecteerde CD-1-muizen in het volgende experiment agressief worden tegenover adolescente muizen.
  3. Priming CD-1 agressief gedrag
    1. Huisvest de CD-1-muizen die zijn geselecteerd voor priming in hun thuiskooi tot de laatste dag van priming.
    2. Introduceer een volwassen mannelijke C57BL/6J muis PND >65 gedurende 30 s in de CD-1 thuiskooi en verwissel deze vervolgens met een adolescente C57BL/6 PND 25 ± 3 muis gedurende 5 minuten.
    3. Registreer de latentie tot de eerste agressie, het aantal aanvallen en eventuele interactie (zie aanvullende tabel 3).
    4. Voer de priming 2x per dag uit gedurende 3-4 dagen op hetzelfde tijdstip dat de nederlagen gepland staan (9:00 uur en 14:00 uur).
      OPMERKING: Niet alle CD-1-muizen zullen de adolescente muizen tijdens de eerste dagen aanvallen, vooral als de priming op vrouwelijke muizen is. Het aantal dagen voor priming kan toenemen of afnemen, afhankelijk van het agressieve gedrag van de CD-1-muizen.
    5. Om het aantal priming-dagen te verminderen, hergebruikt u CD-1-muizen die eerder een sociaal nederlaagexperiment met mannelijke muizen hebben ondergaan. Als CD-1-muizen geen verhoogde agressie vertonen, verleng dan de dagen voor priming totdat de criteria zijn bereikt.
    6. Verkort de dagen voor priming als de CD-1-muizen extreem agressief gedrag vertonen (C57BL/6-muizen vertonen overmatige verwonding) om ernstige verwondingen tijdens sociale nederlagen te voorkomen.
    7. Selecteer voor de volgende fase van het experiment de CD-1-muizen die de adolescente muizen minstens 10x (mannetjes) of 5x (vrouwtjes) aanvallen gedurende 2 opeenvolgende dagen.

3. AcSD-protocol

LET OP: Deze fase bestaat uit 3 dagen gewenning en 4 dagen blootstelling aan AcSD.

  1. Gewenning
    1. Zet de rattenkooien op voor een sociale nederlaag (Figuur 1A-F). Verdeel de rattenkooien in 2 compartimenten met behulp van geschikte scheidingswanden van acrylglas (Figuur 1B,D; zie Materiaaltabel).
    2. Voeg aan beide zijden van de kooi bodembedekking van harde houtsnippers toe, voeg een katoenen vierkant per kant toe als strooisel (Figuur 1D). Zorg ervoor dat de bovenkant van de draad is vastgezet met bindclips (Figuur 1E). Zorg ervoor dat de rattenkooi is afgedekt met het deksel zonder het beschermende katoen (Figuur 1F).
    3. Plaats een CD-1 muis per kooi aan één kant van de kooi. Plaats een tag aan de buitenkant van de kooi voor gemakkelijke identificatie van elke muis.
    4. Plaats de geselecteerde CD-1-muizen in het sociale nederlaagapparaat (Figuur 1F) 2 of 3 dagen voordat het AcSD-protocol begint (om het territoriale gedrag van CD-1 te verbeteren).
    5. Voer 1 dag voor het experiment een priming-sessie uit; Dit is belangrijk om agressie consistent te houden.
  2. Nederlaag sessies
    1. Voer 2 sessies per dag uit (eerste sessie: 9 uur, tweede sessie: 2 uur) gedurende 4 dagen, 8 sessies in totaal. Maak een schema om ervoor te zorgen dat de agressor voor elke sessie anders zal zijn (zie aanvullende tabel 4 en aanvullende tabel 5).
    2. Weeg de C57BL/6 adolescentmuis voordat u deze aan de CD-1-kant van de kooi plaatst. Introduceer een volwassen mannelijke C57BL/6-muis >65 gedurende 30 s in de CD-1-kant van de nederlaagkooi en verwissel deze vervolgens met een adolescente C57BL/6 PND 24-28-muis voor een 10 minuten durende nederlaagepisode of maximaal 10 aanvallen per sessie.
    3. Scheid de dieren na elke aanval met een plastic liniaal. Controleer na elke sessie van nederlaag op verwondingen en behandel ze met pijnstillende crème. Registreer het aantal blessures.
    4. Plaats de adolescente C57BL/6J-muis in het vrije compartiment naast een onbekende agressor tot de volgende sessie. Herhaal de procedure elke sessie met een andere agressor.
    5. Begin de sessie met de experimentele en agressormuizen die de vorige sessie niet waren gekoppeld. Bewaak de verwondingen van de volwassen C57BL/6J mannelijke muizen die worden gebruikt voor priming (zie aanvullende tabel 6).
  3. Volg de onderstaande aanbevelingen voor eindpunten voor dierenwelzijn en humane gezondheid.
    1. Volg de standaardprocedure van de overeenkomstige institutionele beoordelingscommissie voor sociale nederlagen en zorg voor een constante veterinaire evaluatie.
    2. Bewaak de gezondheid van muizen tijdens het onderzoek om dierenleed en dood te voorkomen.
    3. Controleer of de geperforeerde verdeler correct is ingesteld om te voorkomen dat muizen naar het andere compartiment oversteken.
    4. Waarschuw het veterinaire zorgpersoneel wanneer een dier een wond heeft voor de juiste controle en breng dagelijks pijnstillende crème aan totdat de wond volledig is genezen.
    5. Als een blessure verergert (wonden worden groter), beperk dan de aanvallen tot 5 in de volgende sessie, zodat herstel mogelijk is. Controleer op ernstige verwondingen. Ernstige verwondingen worden gedefinieerd als wonden van in totaal > 1 cm.
    6. Dieren onmiddellijk verwijderen en euthanaseren met een vermindering van 15%-20% van hun gewicht ten opzichte van het oorspronkelijke lichaamsgewicht; verminderde/verminderde locomotorische activiteit en verminderde vachtverzorging; muizen met wonden > 1 cm; afgehakte penis, of bijtwonden met zwelling van de voorpoten.
      OPMERKING: Primaire euthanasie wordt uitgevoerd via isofluraan/CO2-gaskamers, gevolgd door secundaire euthanasie door cervicale dislocatie.
  4. Muizen aansturen
    1. Voer 2 sessies per dag uit (eerste sessie: 9 uur, tweede sessie: 2 uur) gedurende 4 dagen, 8 sessies in totaal. Maak een schema om ervoor te zorgen dat controlemuizen de kooi delen met elke sessie een andere C57BL/6J-soortgenoot (zie aanvullende tabel 7 en aanvullende tabel 8).
      OPMERKING: Controlemuizen worden niet blootgesteld aan een agressor. Om de introductie van een nieuwe CD-1-muis elke nederlaagsessie na te bootsen, worden controlemuizen elke sessie gekoppeld aan een nieuwe soortgenoot van hetzelfde geslacht en dezelfde leeftijd (niet-nestgenoot).
    2. Huisvest de controlemuizen in het sociale nederlaagapparaat (Figuur 1) in een aparte ruimte van die van de AcSD-muizen.
    3. Plaats twee controlemuizen per kooi, één aan elke kant van de kooi. Zet de muizen in een andere kant van de kooi of een andere kooi, zodat ze de geur niet herkennen. Draai de controlemuizen elke sessie.

Figure 1
Figuur 1: Apparaat voor de versnelde sociale nederlaagstress (AcSD) voor adolescente muizen. (A) Van links naar rechts, gepaarde staaldraadbladen met een afstand van 0,6 cm tussen de staven, doorzichtige geperforeerde polycarbonaat verdeler met perforatiediameter van 0,6 cm, bindclips om de draadbladen vast te zetten, doorzichtige rattenkooi met dekseldeksel (zonder katoenen beschermlaag). (B) Omhoog: vergelijking tussen de polycarbonaat verdelers voor chronische sociale nederlaag bij volwassenen (links) en AcSD bij adolescenten (rechts); Onder: Close-up van de polycarbonaat verdeler voor adolescente muizen. (C) Omhoog: vergelijking tussen de staaldraadtoppen voor chronische sociale nederlaag bij volwassenen (links) en AcSD bij adolescenten (rechts); Onder: close-up van de bovenkanten van de staaldraad. (D-F) Montage van het sociale nederlaagapparaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Test van de sociale interactie

  1. Voer de SIT uit volgens de AcSD zoals eerder beschreven 57,58,59.
    1. Voer de SIT 24 uur na de laatste sessie van AcSD uit. Voer de SIT uit onder rood licht (niet onder geel licht) tussen 9 uur en 4 uur.
    2. Stel de hoofdarena en de videocamera boven het hoofd in (zie Materiaaltabel). De hoofdarena is verdeeld in 3 gebieden: de sociale interactiezone (SIZ), de hoeken en het centrum; Deze gebieden moeten in de arena worden gemarkeerd met een zwarte lijn (gebruik een zwarte permanente marker). Gebruik de volgende afmetingen en criteria voor elk gebied.
      1. Zorg ervoor dat de SIZ het vierkante gebied van 14 cm x 9 cm is dat de behuizing omringt. De hoeken zijn kleine, vierkante gebieden (9 cm x 9 cm) in de hoeken van de muur tegenover de behuizing en vertegenwoordigen het verste punt van de SIZ. Het centrum is het gebied tussen de SIZ en de hoeken.
    3. Reinig de arena en de verblijven met een reinigende waterstofperoxidase-oplossing.
    4. Plaats identificatielabels voor elk dier op de vloer voor analyse. Registreer al het gedrag van dieren voor offline analyse.
  2. Eerste sessie om de basislijnexploratie te bepalen
    1. Plaats een lege gaasbehuizing tegen een van de muren van de arena. Plaats de experimentele (verslagen of controle) adolescente C57BL/6 muis in het midden van de arena. Laat hem 2,5 minuut vrij de arena verkennen. Pak de muis.
    2. Reinig de arena en de verblijven met een reinigende waterstofperoxidase-oplossing.
  3. Tweede sessie voor sociale interactie
    1. Plaats een onbekende CD-1-muis in de gaasbehuizing. Plaats de behuizing op dezelfde plaats als de vorige sessie.
    2. Introduceer dezelfde adolescente C57BL/6-muis opnieuw in de arena. Laat hem 2,5 minuut vrij de arena verkennen. Haal de muizen op.
    3. Reinig de arena en de verblijven met een reinigende waterstofperoxidase-oplossing.
    4. Herhaal het proces voor alle adolescente C57BL/6-muizen (gestreste en controlemuizen) in een evenwichtige volgorde.
    5. Gebruik meer dan één CD-1-muis voor de SIT om hanteringsstress en vooringenomenheid te verminderen (gebruik bijvoorbeeld voor een cohort van 30 C57BL/6-muizen 4 CD-1-muizen). Tegenwicht bieden aan hen bij de adolescente muizen.
      OPMERKING: Deze test meet de benadering en/of het vermijdingsgedrag van de experimentele muizen in de richting van een sociaal doel, zoals voor het eerst beschreven door Krishnan5 en Golden7.
  4. Analyse
    1. Noteer de tijd(en) die tijdens beide sessies van de test in de interactiezone en de hoeken worden doorgebracht.
    2. Bereken de sociale interactieratio als de tijd doorgebracht in de interactiezone met de aanwezige CD-1-agressor gedeeld door de tijd die wordt doorgebracht in de interactiezone met de afwezige CD-1-agressor.
    3. Classificeer gestreste muizen met een verhouding < 1,00 als vatbaar en een verhouding ≥ 1,00 als veerkrachtig.
    4. Sluit dieren uit die de arena tijdens de eerste sessie niet verkennen (d.w.z. 0 s in een van de aangewezen gebieden hebben doorgebracht) van alle analyses om verschillen in locomotorische activiteit te beheersen.
    5. Sluit alle dieren die 0 aanvallen krijgen in ≥4 sociale nederlaagsessies uit van alle analyses om niet-representatieve veerkrachtige dieren te voorkomen.
    6. Sluit muizen (niet vatbaar) uit die niet ten minste 61 s binnen de interactiezone doorbrengen om ervoor te zorgen dat hoge sociale interactieratio's de werkelijke interesse in het sociale doel weerspiegelen.
    7. Sluit muizen uit met uitschieters in de interactieratioscores.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In totaal werden vier verschillende experimenten uitgevoerd met behulp van het chronische sociale nederlaagstressmodel bij adolescente C57BL/6 mannelijke muizen (PND 21). Dit model had echter belangrijke beperkingen voor het gebruik ervan bij vroege adolescente C57BL/6-muizen.

Vereiste aanpassingen aan de apparatuur voor adolescente C57BL/6-muizen
De eerste beperking was dat de apparatuur die werd gebruikt voor het sociale manipulatie-apparaat was ontworpen voor volwassen muizen. Vanwege hun grootte waren adolescente C57BL/6-muizen met PND 21 in staat om door de perforaties van de verdelers naar de agressorzijde te gaan. Dit onderbrak de periode van sensorisch contact. Bovendien konden adolescente muizen ontsnappen door de tralies van de staaldraadtoppen. Daarom werd de apparatuur aangepast om te voorkomen dat de muizen zouden ontsnappen (Figuur 1). De diameter van de perforaties werd gewijzigd van 1,1 cm naar 0,6 cm (figuur 1B) en de bovenkant van staaldraad werd vervangen van een bovenkant met een afstand van 1,1 cm tussen de staven naar een met een afstand van 0,6 cm (figuur 1C). Bovendien werd de bovenkant vastgezet met clips en waren de rattenkooien ook bedekt met plastic hoezen zonder beschermend katoen. De strooisel van de houtsnippers werd ook op een geschikt niveau gesteld voor de adolescente muizen (Figuur 1D-F).

Het AcSD-model vereist priming van volwassen mannelijke CD-1-muizen om consistente, agressieve aanvallen te garanderen
De tweede en belangrijkere beperking was het gebrek aan consistentie in de fysieke agressie van CD-1-muizen tegenover de adolescente muizen. Tijdens de sessies met chronische sociale nederlagen varieerde de agressie van nul agressieve aanvallen tijdens de sessie van 10 minuten tot een of twee beten die dodelijk waren vanwege de kleine omvang van de adolescente muizen. Als de CD-1-muizen echter voor meer dan één experiment werden gebruikt, nam de consistentie in het aantal aanvallen toe.

Figuur 2B toont het aantal aanvallen per dag voor elk experimenteel cohort voor chronische sociale nederlagen (P0, A0, A1 en A2). Er werd een interactie gevonden tussen dag en cohort (Figuur 2B, tweezijdige herhaalde metingen ANOVA: F(27, 234) = 3,83, p < 0,0001), hoofdeffect van dag (F(6,288, 163,5) = 6,2, p < 0,0001), en hoofdeffect van cohort (F(3, 26) = 3,8, p = 0,02). Post-hoctest onthulde verschillen tussen cohorten in dag 1, 2, 3 en 7 (Holm-Sidak post-hoctests: dag 1, P0 vs. A2, p = 0,02; A1 vs. A2, p = 0,02; dag 2, A1 vs. A2, p = 0,04; dag, 3 A0 vs. A1, p = 0,007; A1 vs. A2, p = 0,04; dag 7, A0 vs. A1, p = 0,04). Alle CD-1 muizen in de experimenten P0 en A0 zijn de afgelopen 3 dagen gestopt met aanvallen. CD-1-muizen die werden gebruikt voor experimenten P0 en A0 werden gebruikt in A1, waarbij er een consistentie was in aanvallen (Figuur 2B), wat aangeeft dat de CD-1 vatbaarder waren voor agressie als ze eerder werden blootgesteld aan fysieke interacties.

Om deze reden werden, zoals beschreven in stap 2.1 en 2.2, de CD-1-muizen specifiek gescreend op hun agressie tegenover de adolescente muizen en samen met een volwassen C57BL/6-mannetje geprimed op agressie tegenover de adolescente C57BL/6-muizen. Bovendien werd AcSD gebruikt om de leeftijd te verhogen van PND 21 naar PND 25 en toch gericht te zijn op de vroege adolescentie.

Tijdens de AcSD-sessies verhoogden CD-1-muizen het aantal aanvallen op de adolescente muizen in een consistenter patroon, zoals weergegeven in figuur 2D. In tegenstelling tot het paradigma van chronische sociale nederlaag, werd er geen significante interactie gevonden tussen de sessie en het experimentele cohort (Figuur 2D, tweezijdige herhaalde metingen ANOVA: F(35, 483) = 1,33, p = 0,1), er was een hoofdeffect van sessie (F(5.644, 389.5) = 14.15, p < 0.0001) en een hoofdeffect van cohort (F(5, 69) = 7.91, p < 0.0001); De post-hoctest van Holm-Sidak bracht geen significante verschillen tussen cohorten aan het licht. Uit een vergelijking van de gemiddelden van aanvallen tussen cohorten bleek dat dit effect vooral werd veroorzaakt door cohort A7, dat een significant hoger aantal aanvallen had (gegevens niet getoond, eenrichtingsverkeer ANOVA F(5, 69) = 7,911, p < 0,0001; Holm-Sidak post hoc tests: A3 vs. A6, p = 0,04; A7 vs. A5, p = 0,002; A7 vs. A6, p < 0,0001; A7 vs. A8, p = 0,0001).

Adolescente muizen kregen meer aanvallen met geprimed CD-1-muizen tijdens AcSD dan adolescente muizen die werden blootgesteld aan een chronisch sociaal nederlaagprotocol (Figuur 2E, ongepaarde t-test met Welch's correctie, t = 15.40, df = 17.87, p < 0.0001) met behulp van naïeve (niet-geprime) CD-1-muizen. De aanvallen waren niet consistent tijdens het protocol voor chronische sociale nederlagen, en in feite werden verschillende experimentele muizen helemaal niet aangevallen.

Figure 2
Figuur 2: Vergelijking van het aantal aanvallen per dag tussen chronische sociale nederlaag stress en AcSD. (A) Tijdlijn van het chronische sociale nederlaag stressmodel. (B) Aantal aanvallen per dag voor elk experimenteel cohort (P0, P1, A1 en A2) tijdens chronische sociale nederlaagstress bij adolescente C57BL/6 mannelijke muizen (tweezijdige herhaalde metingen ANOVA). (C) Tijdlijn van het model voor versnelde sociale nederlaagstress (AcSD). (D) Aantal aanvallen per dag voor elk experimenteel cohort (A3-A8) tijdens AcSD bij adolescente C57BL/6 mannelijke muizen (tweerichtingsherhaalde metingen ANOVA). (E) Het gemiddelde aantal aanvallen was significant hoger voor AcSD (ongepaarde t-test met Welch's correctie, ****p < 0,0001). Alle gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Afkortingen: CSDS = chronische sociale nederlaagstress; SIT = test van sociale interactie; PND = postnatale dag; P0, A0-A8 = labels voor elk experimenteel cohort. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Patroon van aanvallen tijdens AcSD-sessies heeft geen invloed op het sociale fenotype 24 uur later
Na blootstelling aan sociale nederlaag door stress vertoonden de meeste adolescente mannelijke muizen geen sociale vermijding wanneer ze werden getest in de SIT (Figuur 3B, chronische sociale nederlaag: eenrichtingsverkeer ANOVA F(2, 43) = 14,57, p < 0,0001. F, AcSD: Kruskal-Wallis-test, H(2) = 72,35, p < 0,0001). Voor beide modellen waren er geen significante verschillen in het aantal aanvallen tussen sociaal vermijdende en niet-sociaal vermijdende verslagen muizen (Figuur 3D, chronische sociale nederlaag: tweezijdige herhaalde metingen ANOVA, F(9, 252) = 4,07, p = 0,21. H. AcSD: herhaalde metingen in twee richtingen ANOVA, F(7, 511) = 1,32, p = 0,24). Het aandeel veerkrachtige muizen was echter hoger na chronische sociale nederlaag dan dat na blootstelling aan AcSD (Figuur 3C,G, 70% versus 55,26%, binomiale test (eenzijdig), p = 0,0047).

Figure 3
Figuur 3: Vergelijking van de scores van de sociale interactietest (SIT) volgens de paradigma's van chronische sociale nederlaagstress en de AcSD. (A) Tijdlijn van het chronische sociale nederlaagstressmodel. (B) Verdeling van de SAT-score na chronische sociale nederlaagstress in de adolescentie (eenrichtings-ANOVA). (C) Percentage veerkrachtige/vatbare stress na chronische sociale nederlaag in de adolescentie. (D) Aantal aanvallen per fenotype ontvangen tijdens chronische sociale nederlaagstress, er werden geen significante verschillen gevonden tussen veerkrachtig en vatbaar (tweezijdige herhaalde metingen ANOVA). (E) Tijdlijn van het model voor versnelde sociale nederlaagstress (AcSD). (F) Verdeling van de SIT-score na AcSD in de adolescentie (Kruskal-Wallis). Dit cijfer is gewijzigd van57. (G) Het aandeel veerkrachtig/vatbaar na AcSD in de adolescentie. Dit cijfer is gewijzigd van57. (H) Aantal aanvallen per fenotype ontvangen tijdens AcSD; er is geen verschil tussen veerkrachtig en vatbaar (tweezijdige herhaalde maatregelen ANOVA). Dit cijfer is gewijzigd van59. **p < 0,001, ****p < 0,0001. Alle gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Afkortingen: PND = postnatale dag; Con = controles; Res = veerkrachtig; Sus = vatbaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

AcSD kan worden gebruikt bij adolescente C57BL/6 vrouwelijke muizen
Omdat PND 25 C57BL/6 mannelijke en vrouwelijke muizen nog niet reproductief volwassen zijn, kunnen geprepareerde CD-1-muizen agressieve aanvallen uitvoeren op adolescente vrouwelijke muizen zoals ze deden op adolescente mannelijke muizen. De priming-fase moest echter worden verlengd om een consistent aantal aanvallen te bereiken (Figuur 4A). Zoals te zien is in figuur 4B, werd er geen interactie gevonden tussen dag en cohort in alle experimenten (Figuur 4B, tweezijdige herhaalde metingen ANOVA: F(35,707) = 1,38, p = 0,07), er was een hoofdeffect van de sessie (F(6.286, 634.9) = 16.1, p < 0.0001) en een hoofdeffect van het cohort (F(5, 101) = 11.34, p < 0.0001; Holm-Sidak post hoc tests: sessie 2 C4 vs C8, p = 0.03; sessie 6 C7 vs C4, p = 0,02; C7 versus C5, p = 0,02; sessie 7 C8 vs C3, p = 0,02; C8 versus C4, p = 0,045). De meerderheid van de adolescente C57BL/6 vrouwelijke muizen die werden blootgesteld aan AcSD waren veerkrachtig tegen sociale vermijding (Figuur 4C, Brown-Forsythe's ANOVA: F(2,113.4) = 27.2, p < 0.0001), vergelijkbaar met adolescente mannelijke muizen. Er werd geen significant verschil gevonden in het aantal aanvallen tussen veerkrachtige en gevoelige muizen (Figuur 4E, tweezijdige herhaalde metingen ANOVA, sessie x fenotype interactie: F(7, 714) = 0,73, p = 0,64, hoofdeffect van sessie F(6,375, 650,3) = 7,02, p < 0,0001, geen hoofdeffect van fenotype F(1, 102) = 0,4, p = 0,53).

Figure 4
Figuur 4: AcSD bij adolescente vrouwelijke muizen. (A) Tijdlijn van het experiment. (B) Aantal aanvallen per dag door experiment tijdens AcSD (tweezijdige herhaalde metingen ANOVA). (C) Verdeling van de SIT-score na AcSD tijdens de adolescentie bij vrouwelijke muizen (Brown-Forsythe's ANOVA). (D) Percentage veerkrachtig/vatbaar na AcSD in de adolescentie (rechts). (E) Aantal aanvallen per fenotype ontvangen tijdens AcSD; er werden geen significante verschillen gevonden tussen veerkrachtige en gevoelige muizen (tweerichtingsherhaalde metingen ANOVA). Alle gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. (C-E) Deze cijfers zijn gewijzigd van59. Afkortingen: SIT = sociale interactietest; PND = postnatale dag; C3-C8 = labels voor elk experimenteel cohort; Con = controles; Res = veerkrachtig; Sus = vatbaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Sjabloon voor een scoreformulier voor dag 1 van de screening bij volwassenen. Afkortingen: CD-1 = ID van gescreende CD-1 muizen, Exp = Experiment ID, 3 min = Duur van de screeningssessie voor de C57BL/6 volwassen muizen, BL6 ID = ID van C57BL/6 volwassen muizen gebruikt voor screening, Lat 1 VOLWASSENEN = Latentie van de eerste aanval van de CD-1 naar de C57BL/6 volwassen muis, # agressies = Aantal aanvallen uitgevoerd door de CD-1. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Scoreformulier sjabloon voor de screening met volwassenen en adolescenten. Afkortingen: Exp = Experiment ID, 1 min = Duur van de screeningssessie voor de C57BL/6 volwassen muizen, BL6 ID = ID van C57BL/6 volwassen muizen gebruikt voor screening, Lat 1 VOLWASSENEN = Latentie van de eerste aanval van de CD-1 naar de C57BL/6 volwassen muis, # agressies = Aantal aanvallen uitgevoerd door de CD-1, 5 min = Duur van de screeningssessie voor de C57BL/6 adolescente muizen, BL6 Ad = ID van C57BL/6 adolescente muizen gebruikt voor screening, Lat 1 Adolescenten = Latentie van de eerste aanval van de CD-1 naar de C57BL/6 adolescente muis, CD-1 = ID van gescreende CD-1 muizen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 3: Sjabloon voor het scoreblad voor de priming-fase. Afkortingen: CD-1 = ID van CD-1 muizen gebruikt voor priming, Exp = Experiment ID, 30 sec = Duur van de priming sessie voor de C57BL/6 volwassen muizen, BL6 ID = ID van C57BL/6 volwassen muizen gebruikt voor priming, Lat 1 VOLWASSENEN = Latentie van de eerste aanval van de CD-1 naar de C57BL/6 volwassen muis, # agressies = Aantal aanvallen uitgevoerd door de CD-1, Min: 3 = Duur van de priming-sessie voor de C57BL/6 adolescente muizen, BL6 Ad = ID van C57BL/6 adolescente muizen gebruikt voor priming, Lat 1 Adolescenten = Latentie van de eerste aanval van de CD-1 naar de C57BL/6 adolescente muis, # mountings = Aantal mountings ontvangen door de C57BL/6 adolescente muizen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 4: Scorebladsjabloon voor het plannen van sociale nederlagen (20 adolescente muizen). Afkortingen: CD1 = ID van CD-1 muizen, E = Experiment, H = Vochtigheid, 1 st = Sessie 1, 2nd = Sessie 2, BL6 volwassen = ID van C57BL/6 volwassen muizen gebruikt voor priming, Gewicht = Gewicht van C57BL/6 adolescente muizen, # aanvallen = Aantal aanvallen uitgevoerd door de CD-1, # wonden = Aantal wonden ontvangen door de C57BL/6 adolescente muizen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 5: Voorbeeld van het plannen van sociale nederlagen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 6: Model voor letselmonitoring van volwassen C57BL/6 mannelijke muizen. Afkortingen: 1e - # wonden = Aantal wonden opgelopen door de C57BL/6 volwassen muis in sessie 1, 2e - # wonden = Aantal wonden opgelopen door de C57BL/6 volwassen muis in sessie 2, BL6 = ID van C57BL/6 volwassen muizen gebruikt voor priming. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 7: Planningssjabloon voor de controlegroep (10 adolescente muizen). Regels voor klauteren: Herhaal niet dezelfde soortgenoot; een muis kan niet dezelfde kant van de doos op dezelfde dag herhalen; muizen moeten worden geklauterd met muizen uit verschillende kooien uit hun thuiskooi; thuiskooien zijn genummerd; muizennummers worden gegeven afhankelijk van het nummer van de thuiskooi; Verslagen en controlegroepen worden willekeurig uit de thuiskooi gehaald. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 8: Voorbeeld van de planning van de controlegroep. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Consistent, agressief gedrag bij CD-1-muizen
Tijdens de screeningfase is het erg belangrijk om kennis te nemen van al het gedrag dat door de CD-1 wordt vertoond (jagen, opstijgen, snuffelen, verzorgen of bijten) en deze gegevens nauwlettend te volgen bij het selecteren van de CD-1-muizen voor de AcSD. Het is waarschijnlijk dat een CD-1-muis die interactie heeft met de adolescente muis zonder deze aan te vallen, tijdens het primen agressiviteit zal ontwikkelen ten opzichte van adolescente muizen. Daarentegen zal een CD-1-muis die een volwassen muis aanvalt maar een adolescente muis niet benadert, waarschijnlijk geen agressiviteit ontwikkelen ten opzichte van adolescente muizen.

De CD-1-primingfase maakt het mogelijk om agressief gedrag te ontwikkelen ten opzichte van adolescente muizen. Daarom is het hebben van een nauwkeurig register van het gedrag van cruciaal belang voor de selectie van de muizen. Bovendien is het essentieel om de CD-1-muizen altijd te screenen voordat een nieuw experiment wordt uitgevoerd, zelfs als een CD-1-muis al eerder een nederlaag heeft geleden. Sommige CD-1-muizen kunnen stoppen met het aanvallen van adolescente muizen wanneer ze gedurende een bepaalde periode ongestoord in hun huiskooien worden gelaten, anderen kunnen verhoogd territoriaal gedrag ontwikkelen omdat ze geïsoleerd zijn gehuisvest.

Voor het primen van de CD-1-muizen beveelt het protocol 3 dagen aan. Als naïeve CD-1-muizen worden gebruikt, kan de priming worden verlengd als de CD-1-muizen de adolescente muizen niet actief aanvallen. Voor CD-1-muizen die een sociale nederlaag hebben doorgemaakt met adolescente muizen, kan de duur van deze priming-fase worden verkort.

De screening- en primingfasen zijn van cruciaal belang voor succesvolle AcSD-sessies. CD-1-muizen die op de juiste manier zijn geprimed, zullen bijvoorbeeld sneller aanvallen en de limiet van 10 aanvallen bereiken dan een minder agressieve CD-1-muis, waardoor korte nederlaagepisodes mogelijk zijn.

Tijdens AcSD is het van cruciaal belang om de dieren te scheiden wanneer de aanvallen zeer gewelddadig zijn (d.w.z. de CD-1-muis laat de C57BL/6J-muis niet los); Anders raken de adolescente muizen gewond en moeten de aanvallen worden beperkt. Het behandelen van verwondingen is ook erg belangrijk om infecties te voorkomen; Het wordt aanbevolen om geen olieachtige zalven te gebruiken voor de behandeling van verwondingen, omdat dieren de zalf weglikken, daarbij haar verliezen en de verwonding blootleggen.

Problemen oplossen met AcSD voor gebruik voor adolescente C57BL/6 mannelijke en vrouwelijke muizen
Het chronische sociale nederlaagstressmodel presenteerde belangrijke beperkingen voor het gebruik ervan in de vroege adolescentie bij zowel mannelijke als vrouwelijke C57BL/6-muizen. In dit hoofdstuk worden de wijzigingen beschreven die zijn aangebracht voor de ontwikkeling van het AcSD-model in de adolescentie.

Uitrusting: De volledige lijst met apparatuur staat vermeld in de Materiaaltabel. De C57BL/6 adolescente muizen in de vroege adolescentie (PND 21-30) waren te klein voor de eerder beschreven apparatuur die in het laboratoriumwerd gebruikt 60. De diameter van de perforaties op de scheidingswanden van acrylglas is groot genoeg om C57BL/6-muizen van het ene compartiment naar het andere te laten oversteken, waar de agressor zich bevindt. Om dit te voorkomen, zijn verdelers van acrylglas gemaakt met perforaties met een kleine diameter. Bovendien moest de bovenkant van staaldraad worden vastgezet met clips om te voorkomen dat muizen uit de kooien zouden ontsnappen. De gebruikte deksels worden meestal gebruikt voor geventileerde kooien. In dit geval werden deze deksels gebruikt zonder het beschermende katoen om een goede ventilatie mogelijk te maken en te voorkomen dat muizen uit de kooi zouden ontsnappen. Het is belangrijk om te bedenken dat de hoeveelheid gebruikte strooisel van houtsnippers adolescente muizen in staat moet stellen om bij het voer en de waterdispenser te komen die op het deksel is geplaatst. Grote hoeveelheden houtsnippers kunnen echter nat worden.

Selectie van de CD-1 muizen: In het chronische model worden de CD-1 muizen gescreend op agressief gedrag voorafgaand aan het begin van het experiment. CD-1-muizen worden na 3 dagen screening geselecteerd en hun agressieve gedrag wordt beoordeeld. Na screening worden de dieren die een latentie hebben om aan te vallen onder de 30 s en die consistente aanvallen vertonen, geselecteerd voor de volgende fase. Tijdens de experimenten met chronische sociale nederlagen behielden de CD-1-muizen echter geen consistent aantal aanvallen gedurende 10 dagen (Figuur 2B). Daarom moesten verschillende CD-1-muizen uit het experiment worden verwijderd vanwege een gebrek aan agressie jegens de indringermuis. Hoewel slechts een klein deel van de CD-1-muizen de indringermuis aanviel, waren sommige van deze muizen extreem agressief en verwondden ze soms de mannelijke C57BL/6 PND 21-muizen ernstig. Daarom werd de screening van de CD-1-muizen gewijzigd om agressieve muizen te selecteren in de richting van adolescente muizen, waardoor de fysieke agressie werd verhoogd.

Consistentie van fysieke agressie: Consistente fysieke agressie leidt tot het verkrijgen van een snelle en robuuste nederlaag van de indringer6. Om de procedures tussen experimenten en experimentatoren te standaardiseren, werd een operationele definitie van aanval57 gebruikt, die een nauwkeurige kwantitatieve meting van agressiviteit mogelijk maakte.

Priming-agressiviteit: Tijdens de experimenten met chronische sociale nederlagen varieerde het aantal aanvallen sterk en nam het af tijdens de laatste dagen van het experiment (Figuur 2B). Om het agressieve gedrag van de CD-1-muizen ten opzichte van de adolescente C57BL/6-mannelijke muizen te vergroten, werden de CD-1-muizen klaargestoomd om actief agressief te zijn, ongeacht de muizen die in hun thuiskooi werden geïntroduceerd. Dit gedrag werd bereikt door een volwassen C57BL/6 mannelijke muis gedurende 1 minuut voor de adolescente muis te introduceren, waardoor de CD-1-muis werd aangemoedigd om de adolescente muizen aan te vallen nadat de volwassene was opgehaald.

Duur van het model: Adolescente C57BL/6-muizen met PND 21 zijn erg klein en CD-1-muizen kunnen ze ernstig verwonden met slechts één aanval. Daarom, om zich te richten op de vroege adolescentie en toch herhaalde sessies van sociale nederlaag te hebben, werd een alternatief model gekozen voor de klassieke 10-daagse chronische sociale nederlaagstress. De accelerated social defeat stress (AcSD)42 bestaat uit twee sessies fysieke agressie per dag, één sessie in de ochtend en één in de middag, voor een totaal van 4 dagen (8 sessies). Het AcSD-model maakte een verhoging van de leeftijd van de adolescente muizen mogelijk van PND 21 naar PND 25, nog steeds alleen gericht op de vroege adolescentie.

Beperkingen van AcSD in de adolescentie
Het AcSD-model heeft enkele beperkingen. Vergeleken met het chronische sociale nederlaagmodel bij volwassenen, vereist AcSD de screening van tweemaal het aantal CD-1-muizen van adolescente C57BL/6-muizen. De duur van de priming-fase kan variëren, afhankelijk van het agressieve gedrag van de CD-1-muizen; als zodanig moet het AcSD-schema met anticipatie worden gepland en moet met al deze variabelen rekening worden gehouden. Aangezien de meeste adolescente muizen na blootstelling aan AcSD veerkracht zullen vertonen tegen sociale vermijding, moet het experimentele cohort ten minste 20 dieren voor mannetjes en 30 voor vrouwtjes bestaan om een representatief aantal vatbare muizen te verkrijgen.

AcSD bij adolescente muizen levert consistente resultaten op in experimentele cohorten
Na blootstelling aan sociale stress met zowel chronische sociale nederlaag als AcSD-protocollen, vertoonden de meeste adolescente mannelijke muizen veerkracht tegen sociale vermijding. Voor het chronische sociale nederlaagmodel was het echter niet mogelijk om de variabiliteit in het aantal aanvallen door de CD-1 als een verstorende variabele af te doen. Voor AcSD-experimenten daarentegen worden CD-1-muizen vóór elke nederlaagsessie geprimed om een consistent aantal aanvallen in verschillende sessies te verkrijgen (Figuur 2D,E). Over het algemeen vertonen alle experimentele cohorten van muizen die zijn blootgesteld aan AcSD een vergelijkbaar aantal aanvallen tijdens sessies (Figuur 2D); dit is echter niet het geval voor muizencohorten die zijn blootgesteld aan het chronische sociale nederlaagmodel (Figuur 2B).

Het gebruik van de chronische sociale nederlaagstress bij volwassen C57BL/6 vrouwelijke muizen was een uitdaging in vergelijking met anderen die dit model gebruikten bij andere soorten en stammen 9,13,45,61. Voor AcSD-experimenten bij adolescente C57BL/6 vrouwelijke muizen werd de priming-fase verlengd, waardoor het agressieve gedrag van de CD-1-muizen werd gewaarborgd (Figuur 4A). Er kan echter variabiliteit worden waargenomen in het aantal aanvallen tussen vrouwelijke experimentele cohorten (Figuur 4B). Desalniettemin vertoonden in deze experimenten alle CD-1-muizen agressief gedrag tegenover vrouwtjes. Om het aantal aanvallen te verhogen, kan de priming met de mannelijke muizen worden verlengd tot 1 minuut. Net als bij mannetjes was het percentage adolescente C57BL/6 vrouwelijke muizen dat bestand was tegen sociale vermijding hoger dan bij muizen die vatbaar waren (Figuur 4C,D). Bovendien verschilde het aantal aanvallen niet tussen veerkrachtige en gevoelige muizen (Figuur 4E), wat aangeeft dat het fenotype onafhankelijk is van aanvallen. AcSD kan worden gebruikt bij adolescente C57BL/6 vrouwelijke muizen en experimenten kunnen tegelijkertijd worden uitgevoerd bij beide geslachten met dezelfde CD-1-muizen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door de Canadian Institutes for Health Research (CF Grant Numbers: MOP-74709; PJT 190045), het National Institute on Drug Abuse (CF Grant nummer: R01DA037911), de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (CF Grant Number: 2982226). Andrea Pantoja-Urban werd gesteund door de Nationale Raad voor Geesteswetenschappen, Wetenschap en Technologie / Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCYT) uit Mexico en FRQNT - Merit-beursprogramma voor buitenlandse studenten (PBEEE). Samuel Richer werd ondersteund door een beurs van het Integrated Program of Neuroscience aan de McGill University. Figuurillustraties zijn gemaakt met behulp van sjablonen uit BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 adolescent mice  In house breeding Mice were breeded at the Neurophenotyping Centre of the Douglas Mental Health University Institute.
C57BL/6 adult mice  Charles River Laboratories Strain Code: 027 Mice are ordered so as to arrive at PND>65 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
C57BL/6J adolescent mice  Jackson Labs Strain Code: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664 Mice are ordered so as to arrive at PND 24 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
CD-1 mice  Charles River Laboratories Strain Code: 022 Mice retired breeders more than three months of age and singled housed throughout.
Cleaning solution  Virox Animal Health DIN 02537222 Prevail: Accelerated Hydrogen Peroxide. Desinfectant cleaner and deodorizer.
Clear perforated acrylic glass divider  Manufactured by Douglas Hospital, custom order 0.6 cm (w) × 45.7 cm (d) × 22.23 cm (h); perforations of 0.6 cm diameter. The dividers are perforated allowing sensory but no physical contact between the pair of mice.
Clear rectangular rat cages  Allentown 24 cm (w) × 48.3 cm (d) × 22.23 (h).
Cotton squares for bedding Inotiv Envigo T.6060 iso-BLOX 2.5 cm x 2.5 cm. Added to the social defeat apparatus.
Hard woodchip bedding Inotiv Envigo Teklad 7090, 7115 Sani-chip bedding.
Large binder clips to secure the steel-wire tops STAPLES Item #: 132429, Model #: 24178-CA 51 mm
Medium binder clips to secure the steel-wire tops Item #: 132367, Model #: 24172-CA 32 mm, in case the cover lids of the rat cages do not close with the large clips
Pain relief cream Polysporin Plus Pain Relief Cream (red format, NOT ointment), 2 Antibiotics plus lidocaine hydrochloride
Paired Steel-wire tops  24 cm (w) × 48 cm (d) with 0.6 cm (w) of separation between the grill
Removable wire-mesh enclosure  Johnston industrial plastics 11 cm (w) × 6.8 cm (d) × 42 cm (h) custom order; two per social interaction test arena secured in precut clear polycarbonate
Social interaction open-field arena PEXIGLAS 45 cm (w) × 45 cm (d) × 49 cm (h), custom-crafted from opaque acrylic glass (Plexiglas) 
Stopwatch  For timing defeat sessions
Video camera with infrared lights  Swann SRDVR-44580V  Swann Camera - 4 Channel 1080p Digital Video Recorder & 2 x PRO-T853
Video tracking software  Topscan 2.0 Clever Systems Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miczek, K. A. A new test for aggression in rats without aversive stimulation: Differential effects of d-amphetamine and cocaine. Psychopharmacology. 60, 253-259 (1979).
  2. Kudryavtseva, N., Bakshtanovskaya, I., Koryakina, L. Social model of depression in mice of c57bl/6j strain. Pharmacol Biochem Behav. 38 (2), 315-320 (1991).
  3. Blanchard, R. J., Mckittrick, C. R., Blanchard, D. C. Animal models of social stress: Effects on behavior and brain neurochemical systems. Physiol Behav. 73 (3), 261-271 (2001).
  4. Berton, O., et al. Essential role of bdnf in the mesolimbic dopamine pathway in social defeat stress. Science. 311 (5762), 864-868 (2006).
  5. Krishnan, V., et al. Molecular adaptations underlying susceptibility and resistance to social defeat in brain reward regions. Cell. 131 (2), 391-404 (2007).
  6. Bartolomucci, A., Fuchs, E., Koolhaas, J. M., Ohl, F. Acute and chronic social defeat: Stress protocols and behavioral testing. Neuromethods. 42, 261-275 (2009).
  7. Golden, S. A., Covington Iii, H. E., Berton, O., Russo, S. J. A standardized protocol for repeated social defeat stress in mice. Nat Protoc. 6 (8), 1183-1191 (2011).
  8. Bourke, C. H., Neigh, G. N. Behavioral effects of chronic adolescent stress are sustained and sexually dimorphic. Horm Behav. 60 (1), 112-120 (2011).
  9. Steinman, M. Q., Trainor, B. C. Sex differences in the effects of social defeat on brain and behavior in the California mouse: Insights from a monogamous rodent. Semin Cell Dev Biol. 61, 92-98 (2017).
  10. Takahashi, A., et al. Establishment of a repeated social defeat stress model in female mice. Sci Rep. 7 (1), 12838 (2017).
  11. Wright, E. C., et al. Sexual differentiation of neural mechanisms of stress sensitivity during puberty. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (43), 2306475120 (2023).
  12. Yin, W., et al. Repeated social defeat in female mice induces anxiety-like behavior associated with enhanced myelopoiesis and increased monocyte accumulation in the brain. Brain Behav Immun. 78, 131-142 (2019).
  13. Van Doeselaar, L., et al. Chronic social defeat stress in female mice leads to sex-specific behavioral and neuroendocrine effects. Stress. 24 (2), 168-180 (2021).
  14. Hollenstein, T., Lougheed, J. P. Beyond storm and stress: Typicality, transactions, timing, and temperament to account for adolescent change. Am Psychol. 68 (6), 444 (2013).
  15. Sawyer, S. M., Azzopardi, P. S., Wickremarathne, D., Patton, G. C. The age of adolescence. Lancet Child Adolesc Health. 2 (3), 223-228 (2018).
  16. Adriani, W., Laviola, G. Windows of vulnerability to psychopathology and therapeutic strategy in the adolescent rodent model. Behav Pharmacol. 15 (5), 341-352 (2004).
  17. Reynolds, L. M., et al. Early adolescence is a critical period for the maturation of inhibitory behavior. Cereb Cortex. 29 (9), 3676-3686 (2019).
  18. Reynolds, L. M., et al. Amphetamine disrupts dopamine axon growth in adolescence by a sex-specific mechanism in mice. Nat Commun. 14 (1), 4035 (2023).
  19. Sisk, L. M., Gee, D. G. Stress and adolescence: Vulnerability and opportunity during a sensitive window of development. Curr Opin Psychol. 44, 286-292 (2022).
  20. Spear, L. P. The adolescent brain and age-related behavioral manifestations. Neurosci Biobehav Rev. 24 (4), 417-463 (2000).
  21. Reynolds, L. M., Flores, C. Mesocorticolimbic dopamine pathways across adolescence: Diversity in development. Front Neural Circuits. 15, 735625 (2021).
  22. Manitt, C., et al. The netrin receptor dcc is required in the pubertal organization of mesocortical dopamine circuitry. J Neurosci. 31 (23), 8381-8394 (2011).
  23. Reynolds, L. M., et al. Dcc receptors drive prefrontal cortex maturation by determining dopamine axon targeting in adolescence. Biol Psychiatry. 83 (2), 181-192 (2018).
  24. Kalsbeek, A., Voorn, P., Buijs, R., Pool, C., Uylings, H. Development of the dopaminergic innervation in the prefrontal cortex of the rat. J Comp Neurol. 269 (1), 58-72 (1988).
  25. Cuesta, S., et al. Dcc-related developmental effects of abused-versus therapeutic-like amphetamine doses in adolescence. Addict Biol. 25 (4), 12791 (2020).
  26. Bekhbat, M., et al. Adolescent stress sensitizes the adult neuroimmune transcriptome and leads to sex-specific microglial and behavioral phenotypes. Neuropsychopharmacology. 46 (5), 949-958 (2021).
  27. Hammerslag, L. R., Gulley, J. M. Age and sex differences in reward behavior in adolescent and adult rats. Dev Psychobiol. 56 (4), 611-621 (2014).
  28. Wheeler, A. L., et al. Adolescent cocaine exposure causes enduring macroscale changes in mouse brain structure. J Neurosci. 33 (5), 1797-1803 (2013).
  29. Schneider, M. Adolescence as a vulnerable period to alter rodent behavior. Cell Tissue Res. 354, 99-106 (2013).
  30. Makinodan, M., Rosen, K. M., Ito, S., Corfas, G. A critical period for social experience-dependent oligodendrocyte maturation and myelination. Science. 337 (6100), 1357-1360 (2012).
  31. Iñiguez, S. D., et al. Social defeat stress induces a depression-like phenotype in adolescent male c57bl/6 mice. Stress. 17 (3), 247-255 (2014).
  32. Iñiguez, S. D., et al. Social defeat stress induces depression-like behavior and alters spine morphology in the hippocampus of adolescent male c57bl/6 mice. Neurobiol Stress. 5, 54-64 (2016).
  33. Latsko, M. S., Farnbauch, L. A., Gilman, T. L., Lynch Iii, J. F., Jasnow, A. M. Corticosterone may interact with peripubertal development to shape adult resistance to social defeat. Horm Behav. 82, 38-45 (2016).
  34. Zhang, F., Yuan, S., Shao, F., Wang, W. Adolescent social defeat induced alterations in social behavior and cognitive flexibility in adult mice: Effects of developmental stage and social condition. Front Behav Neurosci. 10, 149 (2016).
  35. Xu, H., et al. Effects of adolescent social stress and antidepressant treatment on cognitive inflexibility and bdnf epigenetic modifications in the mpfc of adult mice. Psychoneuroendocrinology. 88, 92-101 (2018).
  36. Huang, G. B., et al. Effects of chronic social defeat stress on behaviour, endoplasmic reticulum proteins and choline acetyltransferase in adolescent mice. Int J Neuropsychopharmacol. 16 (7), 1635-1647 (2013).
  37. Hasegawa, S., et al. Dysfunction of serotonergic and dopaminergic neuronal systems in the antidepressant-resistant impairment of social behaviors induced by social defeat stress exposure as juveniles. Int J Neuropsychopharmacol. 21 (9), 837-846 (2018).
  38. Resende, L., et al. Social stress in adolescents induces depression and brain-region-specific modulation of the transcription factor max. Transl Psychiatry. 6 (10), e914 (2016).
  39. Mouri, A., et al. Juvenile social defeat stress exposure persistently impairs social behaviors and neurogenesis. Neuropharmacology. 133, 23-37 (2018).
  40. Rodriguez-Arias, M., et al. Social defeat in adolescent mice increases vulnerability to alcohol consumption. Addict Biol. 21 (1), 87-97 (2016).
  41. Montagud-Romero, S., et al. Repeated social defeat and the rewarding effects of cocaine in adult and adolescent mice: Dopamine transcription factors, probdnf signaling pathways, and the trkb receptor in the mesolimbic system. Psychopharmacology. 234, 2063-2075 (2017).
  42. Wilkinson, M. B., et al. A novel role of the wnt-dishevelled-gsk3β signaling cascade in the mouse nucleus accumbens in a social defeat model of depression. J Neurosci. 31 (25), 9084-9092 (2011).
  43. Hyer, M., et al. Chronic adolescent stress causes sustained impairment of cognitive flexibility and hippocampal synaptic strength in female rats. Neurobiol Stress. 14, 100303 (2021).
  44. Bekhbat, M., et al. Chronic adolescent stress sex-specifically alters central and peripheral neuro-immune reactivity in rats. Brain Behav Immun. 76, 248-257 (2019).
  45. Pyter, L. M., Kelly, S. D., Harrell, C. S., Neigh, G. N. Sex differences in the effects of adolescent stress on adult brain inflammatory markers in rats. Brain Behav Immun. 30, 88-94 (2013).
  46. Dalsgaard, S., et al. Incidence rates and cumulative incidences of the full spectrum of diagnosed mental disorders in childhood and adolescence. JAMA psychiatry. 77 (2), 155-164 (2020).
  47. Pedersen, C. B., et al. A comprehensive nationwide study of the incidence rate and lifetime risk for treated mental disorders. JAMA psychiatry. 71 (5), 573-581 (2014).
  48. Heim, C., Shugart, M., Craighead, W. E., Nemeroff, C. B. Neurobiological and psychiatric consequences of child abuse and neglect. Dev Psychobiol. 52 (7), 671-690 (2010).
  49. Kessler, R. C., Petukhova, M., Sampson, N. A., Zaslavsky, A. M., Wittchen, H. U. Twelve-month and lifetime prevalence and lifetime morbid risk of anxiety and mood disorders in the united states. Int J Methods Psychiatr Res. 21 (3), 169-184 (2012).
  50. Boyd, A., et al. Gender differences in mental disorders and suicidality in europe: Results from a large cross-sectional population-based study. J Affect Disord. 173, 245-254 (2015).
  51. Bale, T. L., Epperson, C. N. Sex differences and stress across the lifespan. Nat Neurosci. 18 (10), 1413-1420 (2015).
  52. Hankin, B. L., Mermelstein, R., Roesch, L. Sex differences in adolescent depression: Stress exposure and reactivity models. Child Dev. 78 (1), 279-295 (2007).
  53. Kim, S., Colwell, S. R., Kata, A., Boyle, M. H., Georgiades, K. Cyberbullying victimization and adolescent mental health: Evidence of differential effects by sex and mental health problem type. J Youth Adolesc. 47, 661-672 (2018).
  54. Filipponi, C., Petrocchi, S., Camerini, A. L. Bullying and substance use in early adolescence: Investigating the longitudinal and reciprocal effects over 3 years using the random intercept cross-lagged panel model. Front Psychol. 11, 571943 (2020).
  55. Brody, G. H., Yu, T., Chen, E., Miller, G. E. Persistence of skin-deep resilience in african american adults. Health Psychol. 39 (10), 921 (2020).
  56. Rijlaarsdam, J., Cecil, C. A., Buil, J. M., Van Lier, P. A., Barker, E. D. Exposure to bullying and general psychopathology: A prospective, longitudinal study. Res Child Adolesc Psychopathol. 49, 727-736 (2021).
  57. Vassilev, P., et al. Unique effects of social defeat stress in adolescent male mice on the netrin-1/dcc pathway, prefrontal cortex dopamine and cognition. eNeuro. 8 (2), (2021).
  58. Vassilev, P., et al. Custom-built operant conditioning setup for calcium imaging and cognitive testing in freely moving mice. eNeuro. 9 (1), (2022).
  59. Pantoja-Urbán, A. H., et al. Gains and losses: Resilience to social defeat stress in adolescent female mice. Biol Psychiatry. 95 (1), 37-47 (2024).
  60. Torres-Berrío, A., et al. Dcc confers susceptibility to depression-like behaviors in humans and mice and is regulated by mir-218. Biol Psychiatry. 81 (4), 306-315 (2017).
  61. Ver Hoeve, E. S., Kelly, G., Luz, S., Ghanshani, S., Bhatnagar, S. Short-term and long-term effects of repeated social defeat during adolescence or adulthood in female rats. Neuroscience. 249, 63-73 (2013).

Tags

Trefwoorden: Social Defeat Stress Adolescente muizen C57BL/6 Man En Vrouw Sociale vermijding Accelerated Social Defeat Stress (AcSD) Model Hersenontwikkeling Gedragsresultaten
Social Defeat Stress-model voor adolescente C57BL/6 mannelijke en vrouwelijke muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pantoja-Urbán, A. H., Richer,… More

Pantoja-Urbán, A. H., Richer, S., Giroux, M., Nouel, D., Flores, C. Social Defeat Stress Model for Adolescent C57BL/6 Male and Female Mice. J. Vis. Exp. (205), e66455, doi:10.3791/66455 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter