Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Sosial nederlagsstressmodell for unge C57BL/6 mannlige og kvinnelige mus

Published: March 15, 2024 doi: 10.3791/66455
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2,3,4,5
1Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 2Douglas Mental Health University Institute, McGill University, 3Department of Psychiatry, McGill University, 4Department of Neurology and Neurosurgery, Faculty of Medicine, McGill University, 5Ludmer Centre for Neuroinformatics & Mental Health, McGill University

Summary

Vi utviklet en akselerert sosial nederlagsstressmodell for unge C57BL/6-mus, som fungerer hos både menn og kvinner og tillater eksponering i diskrete ungdomsperioder. Eksponering for denne modellen induserer sosial unngåelse, men bare i en undergruppe av beseirede hann- og hunnmus.

Abstract

Sosial motgang i ungdomsårene er utbredt og kan påvirke psykiske helsebaner negativt. Modellering av sosialt stress hos unge hann- og hunngnagere er nødvendig for å forstå effekten på pågående hjerneutvikling og atferdsutfall. Paradigmet for kronisk sosialt nederlagsstress (CSDS) har blitt mye brukt til å modellere sosialt stress hos voksne C57BL/6 hannmus ved å utnytte den aggressive oppførselen som vises av en voksen hanngnagere til en inntrenger som invaderer territoriet. En fordel med dette paradigmet er at det gjør det mulig å kategorisere beseirede mus i spenstige og mottakelige grupper basert på deres individuelle forskjeller i sosial atferd 24 timer etter siste nederlagsøkt. Implementering av denne modellen i unge C57BL/6-mus har vært utfordrende fordi voksne eller unge mus vanligvis ikke angriper tidlige unge hann- eller hunnmus, og fordi ungdomstiden er en kort periode av livet, som omfatter diskrete tidsmessige vinduer av sårbarhet. Denne begrensningen ble overvunnet ved å tilpasse en akselerert versjon av CSDS til bruk for unge hann- og hunnmus. Dette 4-dagers stressparadigmet med 2 fysiske angrepsøkter per dag bruker en C57BL/6 mannlig voksen for å forberede CD-1-musen for aggressivitet slik at den lett angriper den mannlige eller kvinnelige ungdomsmusen. Denne modellen ble kalt akselerert sosialt nederlagsstress (AcSD) for unge mus. Ungdomseksponering for AcSD induserer sosial unngåelse 24 timer senere hos både menn og hunner, men bare hos en undergruppe av beseirede mus. Dette sikkerhetsproblemet oppstår til tross for at antallet angrep er konsistent på tvers av økter mellom robuste og utsatte grupper. AcSD-modellen er kort nok til å tillate eksponering i diskrete perioder i ungdomsårene, tillater segregering av mus i henhold til tilstedeværelse eller fravær av sosial unngåelsesatferd, og er den første modellen som er tilgjengelig for å studere sosialt nederlagsstress hos unge C57BL/6 hunnmus.

Introduction

Paradigmet for kronisk sosialt nederlagsstress er mye brukt for å modellere sosialt stress hos voksne postnatal dag (PND) >65 hanngnagere. Dette paradigmet er basert på den naturlige aggressive oppførselen til en voksen hanngnagere når en inntrenger invaderer territoriet. Denne modellen brukes i en rekke gnagerarter, inkludert rotter, hamstere og mus 1,2,3,4,5,6,7,8,9, og består av en kombinasjon av fysisk aggresjon og psykologisk stress som varer i omtrent 10 dager, hvor en inntrengergnagere eksperimenterer noen minutter med fysisk aggresjon fra den fastboende gnageren. De to gnagere forblir i beboerens hjemmebur, atskilt med en skillevegg som tillater sensorisk, men ikke fysisk kontakt7. I museeksperimenter er de mest brukte residente/aggressormusene pensjonerte oppdrettere sveitsiske CD-1-mus, som viser robust territoriell oppførsel mot inntrengermus 6,7. For inntrengermusene er den best karakteriserte stammen innavlen C57BL/6 stamme 2,4,5. Den beseirede musen blir utsatt for en ny angriper hver dag for å forhindre tilvenning til angriperen. Kontrollmus er plassert med en annen konspesifikk hver dag. 24 timer etter siste nederlagsøkt testes eksperimentelle mus i en sosial interaksjonstest (SIT) der de kan utforske et åpent felt i fravær (ingen mål), eller tilstedeværelse av en ny CD-1-mus (mål). Kontrollmus bruker mer tid i interaksjonssonen med målet kontra ikke-måldelen av oppgaven. Beseirede mus er klassifisert som mottakelige (ratio<1) eller spenstige (ratio>1) i henhold til et sosialt interaksjonsforhold (tid tilbrakt i interaksjonssonen med aggressor til stede/tid tilbrakt i interaksjonssonen med aggressor fraværende). Denne prosedyren gir et nyttig verktøy for å studere individuelle forskjeller i respons på stress.

Inntil de siste årene har den kroniske sosiale nederlagsstressmodellen blitt brukt mest hos voksne hannmus fordi de fremhevede mannlige dominanshierarkiene innebærer å kjempe mot hanner, men ikke mot hunner 6,7. Videre angriper hanngnagere vanligvis ikke hunner; i stedet engasjerer de seg i parringsatferd10. Til tross for disse hindringene er det utviklet ulike strategier for å tilpasse det kroniske sosiale nederlagsstressparadigmet for voksne hunnmus. For eksempel er California-musemodellen for sosialt nederlag basert på den naturlige aggresjonen til denne monogame arten fra begge kjønn når de forsvarer sitt territorium 9,11. Andre tilnærminger fokuserer på å indusere aggressiv oppførsel hos CD-1-musene ved å stimulere deres ventromediale hypothalamus til å ha konsistent aggressiv oppførsel10,12, eller ved å påføre hannurin i de eksperimentelle voksne hunnmusene for å motta angrep fra CD-1-aggressorer13. Denne økte og konsekvente aggresjonen til CD-1-musene er avgjørende for at den eksperimentelle inntrengermusen skal vise klare atferdsmessige tegn på underordning mot de gjentatte angrepene fra angriperen under interaksjonens lengde6.

Tilpasning av den kroniske sosiale nederlagsmodellen til bruk hos unge C57BL/6-mus
Ungdomstiden er en periode preget av betydelig psykososial modning, som utspiller seg parallelt med endringer i hjernens mikro- og makroarkitektur, spesielt i prefrontal cortex. Hos både mennesker og gnagere er det liten konsensus om den spesifikke begynnelsen og slutten av ungdomsperioden14,15. Videre er det kritiske sårbarhetsvinduer i ungdomsårene for erfaringsindusert forstyrrelse av pågående hjerne- og kognitiv utvikling 16,17,18,19. Puberteten og ungdomsårene forekommer samtidig, men disse begrepene er ikke synonyme. Puberteten betyr begynnelsen av seksuell modning, mens ungdomsårene representerer en bredere fase preget av det gradvise skiftet fra en ungdomstilstand til å oppnå uavhengighet20. Ulike grupper har antydet at ungdomstiden hos mus strekker seg fra avvenning (PND 21) til voksen alder (PND 60)21. Spesielt tidlig ungdomstid kan refereres til som første og andre uke etter avvenning (PND 21-34) og midten av ungdomsårene som PND 35-48-perioden. Disse områdene omfatter diskrete utviklingsperioder angående for eksempel utviklingen av dopaminsystemet 22,23,24, sårbarhet for legemiddeleffekter på utvikling av nevronale nettverk 17,25,26,27, og distinkte atferdskarakteristikker 16,20,28,29,30 . .

Kampatferd fra den fastboende musen er nødvendig for den sosiale nederlagsprotokollen. Men som med hunnmus, engasjerer hanner seg vanligvis ikke i aggressive interaksjoner med tidlige ungdomsmus, muligens fordi de ikke oppfatter dem som en trussel. De fleste studier som utforsker effekten av kronisk sosialt nederlag hos unge C57BL/6-mus har blitt utført i midten av ungdomsperioden 31,32,33,34,35; andre spesifiserer ikke dagen etter fødselen for ungdomseksponering36,37, eller forlenger dagene for nederlaget til tidlig voksen alder38 eller tillater ikke sensorisk kontakt39; Andre studier på unge mus bruker forskjellige stammer40,41. Egenskapene til disse studiene som bruker kronisk sosialt nederlagsstress hos unge hannmus er oppsummert i tabell 1.

Vår forskningsgruppe er interessert i å målrette mot spesifikke eksponeringsvinduer for ungdom, inkludert tidlig ungdomstid, hos C57BL/6-mus. På grunn av den korte varigheten av de forskjellige ungdomsperiodene ble det utformet en modifisert versjon av den akselererte versjonen av det kroniske sosiale nederlagsstressparadigmet42. Denne modellen ble kalt akselerert sosialt nederlagsstress (AcSD) for unge mus. Tidligere arbeid viser at det er signifikante kjønnsforskjeller i følsomhet for sosialt stress i ungdomsårene hos rotter 8,26,43,44,45, samt i de skadelige effektene av sosialt stress på psykiske helsebaner hos mennesker 46,47,48,49,50,51,52, 53,54,55,56. AcSD-modellen fungerer også effektivt for unge hunnmus, slik at de kan undersøke potensielle kjønnsspesifikke konsekvenser samt utforske det nevrobiologiske grunnlaget.

Tabell 1: Studier som bruker sosialt nederlagsstressparadigmer hos unge hannmus. Stamme og art: California-mus: Peromyscus californicus. C57BL/6: Mus musculus black 6 innavlet musestamme. C57BL/6J: M. musculus black 6 innavlet musemodell levert av Jacksons laboratorier. CD-1: M. musculus fra sveitsisk utavlet albinomusestamme. ICR: M. musculus Institute of Cancer Research avlet albinomusestamme. OF1: M. musculus Oncins France 1 avlet albinomusestamme.
Forkortelser: uke = uke; PND = Postnatal dag; res = spenstig; sus = mottakelig; unsus = ufølsom. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjene fra Canadian Council of Animal Care og godkjent av McGill University og Douglas Hospital Animal Care Committee (godkjenningsnummer for dyreforsøk: 2005-5084). Alle musene ble plassert i et temperatur- og fuktighetskontrollert (21-22 °C; 60 %) kolonirom og på en 12 timers lys-mørk syklus (lys på kl. 8:00) ved nevrofenotyping senter ved Douglas Mental Health University Institute. Musene hadde ad libitum tilgang til mat og vann gjennom hele eksperimentene. Mus ble tildelt tilfeldig til hver eksperimentelle tilstand. Forsøksdyr ble hentet fra en kommersiell kilde (se materialtabell). Tabell 2 oppsummerer dyrets egenskaper for hver forsøksfase. Totalt ble 489 unge C57BL/6J-mus (259 hanner; 230 hunner) brukt fordelt på 20 eksperimentelle kohorter.

Tabell 2: Dyreforsøkspersoner for hver forsøksfase. †Hvis disse dyrene ikke er alvorlig skadet, kan de gjenbrukes til grunning. ‡Hvis disse dyrene ikke er alvorlig skadet, kan de gjenbrukes til priming under AcSD, §Nevrofenotyping senter ved Douglas Mental Health University Institute. For eksperimenter med hanner, #For eksperimenter med hunner, hvis nederlaget er blandet, bruk hunner for priming. ††Skal ikke brukes til AcSD. Forkortelser: AcSD = akselerert sosialt nederlagsstress; PND = Postnatal day Klikk her for å laste ned denne tabellen.

1. Akklimatisering

NOTAT: Denne fasen bør vare minimum 1 uke.

  1. Kjøp hann-CD-1 pensjonerte oppdrettsmus (se materialtabell) eldre enn 4 måneder og dobbelt så mange som de unge C57BL/6J-musene (dvs. hvis 10 mus vil bli utsatt for stress, kjøp 20 CD-1-mus).
    MERK: Det anbefales å anskaffe denne mengden CD-1-mus fordi bare en liten andel av CD-1-musene viser aggressiv oppførsel mot unge mus.
  2. La CD-1-hannmusene venne seg til det nye anlegget i hjemmeburet med mat og vann ad libitum i 1 uke før screening og priming.
  3. Bruk C57BL/6 ved PND >65 (voksne) og PND 25 ± 3 (ungdom) (tabell 2) for screening og priming. Skaff deg 4 C57BL/6 mus i hver alder per dag med priming (dvs. for 3 dager med priming, skaff deg 12 PND >65 og 12 PND 25 ± 3) for å redusere risikoen for skader fordi disse dyrene vil bli brukt gjentatte ganger for screening og priming-prosess.

2. CD-1 screening og priming

MERK: Varigheten av denne fasen er 3 dager med screening (1 dag for hunnmus) og 3-4 dager med priming (dette kan øke for hunnmus og avhengig av CD-1-musenes aggressive oppførsel.)

  1. Bruk den operasjonelle definisjonen av angrep for å registrere angrepene fra CD-1 som beskrevet nedenfor.
    1. Ett angrep er definert som når CD-1-musen biter C57BL/6J-musen, og C57BL/6J-musen beveger seg bort som svar på bittet. Et bitt er definert som når CD-1-musen plasserer tennene på en hvilken som helst del av C57BL/6J-musens kropp. Å bevege seg bort er definert som når C57BL/6J-musen beveger begge bakpotene fra posisjonen de var i før CD-1 koblet den inn.
    2. Sørg for at det er en forskjell på minst ~2 s mellom separate angrep. Hvis det oppstår mer enn ett bitt < 2 s mellomrom, tell som ett angrep.
    3. Hvis CD-1-musen biter mer enn én gang etter hverandre uten pause (<~2 s fra hverandre), separer dyrene forsiktig med en plastlinjal. Hvis CD-1-musen biter og ikke slipper taket, må du skille dyrene forsiktig. Hvis C57BL/6J-musen blir fanget i et hjørne eller blir festet av CD-1-musen og ikke kan bevege seg bort som svar på et bitt, må du forsiktig skille dyrene med en linjal. Tell alle disse som ett angrep (opp til separasjon).
  2. Screening
    1. Bruk nitrilundersøkelseshansker for all håndtering av dyr og unngå bruk av parfyme eller dufter.
    2. Utfør denførste dagen av screeningen kun med voksne C57BL/6 hannmus som inntrengere (PND >65) i CD-1-musens hjemmebur. Skjerm alltid CD-1-musene før et nytt eksperiment.
    3. Introduser en voksen mannlig C57BL/6 mus PND >65 i hjemmeburet til en CD-1 hannmus i 3 minutter. Registrer latensen til første aggresjon og hvor mange aggresjoner som utføres (se tilleggstabell 1).
    4. Fra2nd til siste dag av screening, introduser en voksen hann C57BL/6 PND>65 i 1 min (begrenset til 30 s hvis CD-1 er veldig aggressiv) og bytt den deretter ut med en ungdom C57BL/6 PND 25 ± 3 i 5 min.
      MERK: Det er viktig å utføre screeningen med ungdomsmus fordi ikke alle musene som angriper den voksne C57BL/6 hannmusen vil angripe den unge C57BL/6. Faktisk vil CD-1-mus som angriper unge mus ikke alltid angripe voksne C57BL/6-hanner.
    5. Hvis eksperimentet er for aggressivitet mot hunnmus, utfør screening og priming med unge hunnmus, selv om forsøksmusene inkluderer begge kjønn.
    6. Registrer latensen til den første aggresjonen, antall angrep og sårene mottatt av alle C57BL/6-musene (se tilleggstabell 2).
    7. Registrer enhver form for interaksjon: jakt, monteringsatferd, sniffing, stell eller biting. Registrer hvis CD-1 ikke nærmer seg de unge C57BL/6-musene; hvis denne oppførselen gjentas i 2 dager, må du ikke inkludere CD-1 i priming.
    8. For priming-fasen, velg alle CD-1-musene som viser atferd som å jage, montere atferd, sniffe, følge, stelle eller bite ungdommen C57BL/6.
    9. Behold de ikke-valgte CD-1-musene og bruk dem til den sosiale interaksjonstesten (SIT).
      MERK: Territoriell atferd øker med tiden; derfor kan de ikke-selekterte CD-1-musene bli aggressive mot unge mus i neste eksperiment.
  3. Klargjøring av CD-1 aggressiv oppførsel
    1. Hus CD-1-musene som er valgt ut for grunning i hjemmeburet til siste dag med grunning.
    2. Introduser en voksen mannlig C57BL/6J mus PND >65 i 30 s til CD-1 hjemmeburet, og bytt den deretter ut med en ungdom C57BL/6 PND 25 ± 3 mus i 5 minutter.
    3. Registrer latensen til den første aggresjonen, antall angrep og eventuell interaksjon (se tilleggstabell 3).
    4. Utfør primingen 2 ganger om dagen i 3-4 dager samtidig som nederlagene er planlagt (9:00 og 2:00).
      MERK: Ikke alle CD-1-musene vil angripe ungdomsmusene i løpet av de første dagene, spesielt hvis primingen er mot hunnmus. Antall dager for priming kan øke eller reduseres avhengig av den aggressive oppførselen som vises av CD-1-musene.
    5. For å redusere antall priming-dager, gjenbruk CD-1-mus som har vært gjennom et tidligere sosialt nederlagseksperiment med hannmus. Hvis CD-1-mus ikke viser økt aggresjon, forleng dagene for priming til du når kriteriene.
    6. Reduser dagene for priming hvis CD-1-musene viser ekstrem aggressiv oppførsel (C57BL/6-mus viser overdreven sår) for å forhindre alvorlige skader under sosialt nederlag.
    7. For neste fase av eksperimentet, velg CD-1-musene som angriper ungdomsmusene minst 10 ganger (hanner) eller 5 ganger (hunner) i 2 påfølgende dager.

3. AcSD-protokoll

NOTAT: Denne fasen består av 3 dagers tilvenning og 4 dagers eksponering for AcSD.

  1. Habituering
    1. Sett opp rotteburene for sosialt nederlag (Figur 1A-F). Del rotteburene i 2 rom ved hjelp av passende skillevegger av akrylglass (Figur 1B,D; se materialtabell).
    2. Legg til sengetøy av hardt flis på begge sider av buret, legg til en bomullsfirkant per side som sengetøy (Figur 1D). Sørg for at trådtoppen er festet med bindeklemmer (Figur 1E). Sørg for at rotteburet er dekket med lokket uten den beskyttende bomullen (Figur 1F).
    3. Plasser en CD-1-mus per bur på den ene siden av buret. Plasser en merkelapp på utsiden av buret for enkel identifikasjon av hver mus.
    4. Plasser de utvalgte CD-1-musene i det sosiale nederlagsapparatet (figur 1F) 2 eller 3 dager før AcSD-protokollen starter (for å forbedre CD-1 territoriell oppførsel).
    5. Utfør en priming-økt 1 dag før eksperimentet; Dette er viktig for å holde aggresjonen konsekvent.
  2. Nederlag økter
    1. Utfør 2 økter per dag (første økt: 9, andre økt: 2) i 4 dager, 8 økter totalt. Lag en tidsplan for å sikre at angriperen vil være forskjellig for hver økt (se tilleggstabell 4 og tilleggstabell 5).
    2. Vei C57BL/6 ungdomsmusen før du introduserer den på CD-1-siden av buret. Introduser en voksen mannlig C57BL/6-mus >65 i 30 sekunder i CD-1-siden av nederlagsburet, og bytt den deretter ut med en ung C57BL/6 PND 24-28-mus for en 10 minutter lang nederlagsepisode eller maksimalt 10 angrep per økt.
    3. Skill dyrene etter hvert angrep med en plastlinjal. Etter hver økt med nederlag, sjekk for skader og behandle dem med smertestillende krem. Registrer antall skader.
    4. Plasser den unge C57BL/6J-musen i det ledige rommet ved siden av en ukjent angriper til neste økt. Gjenta prosedyren med en annen angriper hver økt.
    5. Start økten med de eksperimentelle og aggressormusene som ikke ble paret forrige økt. Overvåk skadene til de voksne C57BL/6J hannmusene som ble brukt til priming (se tilleggstabell 6).
  3. Følg anbefalingene nedenfor for dyrevelferd og humane endepunkter.
    1. Følg standard driftsprosedyre for den tilsvarende institusjonelle vurderingsnemnda for sosiale nederlag og sørg for konstant veterinærevaluering.
    2. Overvåk helsen til mus gjennom hele studien for å unngå dyrs lidelse og død.
    3. Kontroller at den perforerte skilleveggen er riktig innstilt for å forhindre at mus krysser til det andre rommet.
    4. Gi beskjed til veterinærpersonalet når et dyr har et sår for passende overvåking og påfør smertestillende krem daglig til såret er helt grodd.
    5. Hvis en skade forverres (sår øker i størrelse), begrens angrepene til 5 i neste økt, slik at du kan komme deg. Se etter alvorlige skader. Alvorlige skader defineres som sår på til sammen > 1 cm.
    6. Fjern og avlive dyr umiddelbart som har en reduksjon på 15%-20% av vekten fra opprinnelig kroppsvekt; redusert/redusert bevegelsesaktivitet og nedsatt stell; mus med sår > 1 cm; avskåret penis, eller bitemerker med hevelse i forbenene.
      MERK: Primær eutanasi utføres via isofluran/CO2-gasskamre etterfulgt av sekundær eutanasi utført ved cervikal dislokasjon.
  4. Kontroller mus
    1. Utfør 2 økter per dag (første økt: 9, andre økt: 2) i 4 dager, 8 økter totalt. Lag en tidsplan for å sikre at kontrollmus deler buret med en annen C57BL/6J-konspesifikk hver økt (se tilleggstabell 7 og tilleggstabell 8).
      NOTAT: Kontrollmus utsettes ikke for en aggressor. For å etterligne introduksjonen til en ny CD-1-mus hver nederlagsøkt, blir kontrollmus paret med en ny likekjønnet og samme alder (ikke-kullkamerat) hver økt.
    2. Plasser kontrollmusene i det sosiale nederlagsapparatet (figur 1) i et annet rom enn AcSD-musene.
    3. Plasser to kontrollmus per bur, en på hver side av buret. Hus musene på en annen side av buret eller et annet bur helt, slik at de ikke gjenkjenner lukten. Roter kontrollmusene hver økt.

Figure 1
Figur 1: Apparat for akselerert sosialt nederlagsstress (AcSD) for unge mus. (A) Fra venstre til høyre, parede ståltrådtopper med 0,6 cm avstand mellom stengene, klar perforert polykarbonatdeler med perforeringsdiameter på 0,6 cm, bindeklemmer for å feste trådtoppene, gjennomsiktig rottebur med lokklokk (uten bomullsbeskyttende lag). (B) Opp: sammenligning mellom polykarbonatdelerne for kronisk sosialt nederlag hos voksne (venstre) og AcSD hos ungdom (høyre); Ned: Tett opp til polykarbonatdeleren for ungdomsmus. (C) Opp: sammenligning mellom ståltrådtoppene for kronisk sosialt nederlag hos voksne (venstre) og AcSD hos ungdom (høyre); Ned: nærbilde av ståltrådtoppene. (D-F) Montering av det sosiale nederlagsapparatet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Test av sosial interaksjon

  1. Utfør SIT etter AcSD som beskrevet tidligere 57,58,59.
    1. Utfør SIT 24 timer etter siste økt med AcSD. Utfør SIT under røde lysforhold (ikke under gult lys) mellom 9 og 4.
    2. Sett opp den firkantede hovedarenaen og videokameraet (se Materialfortegnelse). Hovedarenaen er delt inn i 3 områder: den sosiale interaksjonssonen (SIZ), hjørnene og sentrum; Disse områdene skal markeres i arenaen med en svart strek (bruk en svart permanent markør). Bruk følgende dimensjoner og kriterier for hvert område.
      1. Sørg for at SIZ er det firkantede området 14 cm x 9 cm, som omgir kabinettet. Hjørnene er små, firkantede områder (9 cm x 9 cm) i hjørnene av veggen på motsatt side av kabinettet og representerer det fjerneste punktet fra SIZ. Sentrum er området mellom SIZ og hjørnene.
    3. Rengjør arenaen og innkapslingene med en rensende hydrogenperoksidaseløsning.
    4. Plasser identifikasjonsmerker for hvert dyr på gulvet for analyse. Registrer all dyreatferd for offline analyse.
  2. Første økt for å bestemme baseline-utforskning
    1. Plasser et tomt nettingskap mot en av veggene på arenaen. Plasser den eksperimentelle (beseiret eller kontroller) unge C57BL/6-musen midt på arenaen. La den utforske arenaen fritt i 2,5 min. Hent musen.
    2. Rengjør arenaen og innkapslingene med en rensende hydrogenperoksidaseløsning.
  3. Andre økt for sosial interaksjon
    1. Plasser en ukjent CD-1-mus inne i nettingkabinettet. Plasser kabinettet på samme sted som forrige økt.
    2. Gjeninnfør den samme unge C57BL/6-musen på arenaen. La den utforske arenaen fritt i 2,5 min. Hent musene.
    3. Rengjør arenaen og innkapslingene med en rensende hydrogenperoksidaseløsning.
    4. Gjenta prosessen for alle unge C57BL/6-mus (stressede mus og kontrollmus) i en motvektet rekkefølge.
    5. Bruk mer enn én CD-1-mus for SIT for å redusere håndteringsstress og skjevhet (f.eks. for en kohort på 30 C57BL/6-mus, bruk 4 CD-1-mus). Motvekt dem blant ungdomsmusene.
      MERK: Denne testen måler tilnærmingen og/eller unngåelsesatferden til de eksperimentelle musene mot et sosialt mål, som først beskrevet av Krishnan5 og Golden7.
  4. Analyse
    1. Registrer tiden(e) brukt i interaksjonssonen og hjørnene under begge øktene i testen.
    2. Beregn det sosiale interaksjonsforholdet som tiden brukt i interaksjonssonen med CD-1-aggressoren tilstede delt på tiden brukt i interaksjonssonen med CD-1-angriperen fraværende.
    3. Klassifiser stressede mus med et forhold < 1,00 som mottakelige og et forhold ≥ 1,00 som spenstige.
    4. Ekskluder dyr som ikke utforsker arenaen i løpet av den første økten (dvs. tilbrakte 0 s i noen av de angitte områdene) fra alle analyser for å kontrollere forskjeller i bevegelsesaktivitet.
    5. Ekskluder alle dyr som mottar 0 angrep i ≥4 sosiale nederlagsøkter fra alle analyser for å forhindre ikke-representative motstandsdyktige dyr.
    6. Ekskluder mus (ikke utsatte) som ikke tilbringer minst 61 s innenfor interaksjonssonen for å sikre at høye sosiale interaksjonsforhold gjenspeiler faktisk interesse for det sosiale målet.
    7. Ekskluder mus med outlier interaction ratio-score.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Totalt fire forskjellige eksperimenter ble utført ved bruk av den kroniske sosiale nederlagsstressmodellen hos unge C57BL/6 hannmus (PND 21). Imidlertid presenterte denne modellen viktige begrensninger for bruken i tidlige ungdoms C57BL/6-mus.

Utstyr som krevde modifikasjoner for unge C57BL/6-mus
Den første begrensningen var at utstyret som ble brukt til det sosiale nederlagsapparatet var designet for voksne mus. På grunn av størrelsen var unge C57BL/6-mus ved PND 21 i stand til å passere gjennom perforeringene av skilleveggene til aggressorsiden. Dette avbrøt perioden med sansekontakt. I tillegg klarte unge mus å rømme gjennom stengene på ståltrådtoppene. Derfor ble utstyret modifisert for å hindre musene i å rømme (figur 1). Diameteren på perforeringene ble endret fra 1,1 cm til 0,6 cm (figur 1B), og ståltrådtoppen ble erstattet fra en som hadde 1,1 cm avstand mellom stengene til en med 0,6 cm avstand (figur 1C). I tillegg ble toppen festet med klips, og rotteburene ble også dekket med plastdeksler uten beskyttende bomull. Flissengetøyet ble også satt på et passende nivå for ungdomsmusene (figur 1D-F).

AcSD-modellen krever priming av voksne mannlige CD-1-mus for å sikre konsistente, aggressive anfall
Den andre og viktigere begrensningen var mangelen på konsistens i CD-1-musens fysiske aggresjon mot ungdomsmusene. Under de kroniske sosiale nederlagsøktene varierte aggresjonen fra null aggressive angrep i løpet av 10 minutters økten til ett eller to bitt som var dødelige på grunn av den lille størrelsen på ungdomsmusene. Men hvis CD-1-musene ble brukt til mer enn ett eksperiment, økte konsistensen i antall angrep.

Figur 2B viser antall angrep per dag for hver eksperimentell kohort for kronisk sosialt nederlag (P0, A0, A1 og A2). Det ble funnet en interaksjon mellom dag og kohort (figur 2B, toveis gjentatte mål ANOVA: F(27, 234) = 3,83, p < 0,0001), hovedeffekt av dag (F(6,288, 163,5) = 6,2, p < 0,0001), og hovedeffekt av kohort (F(3, 26) = 3,8, p = 0,02). Post hoc-test viste forskjeller mellom kohorter på dag 1, 2, 3 og 7 (Holm-Sidak post hoc-tester: dag 1, P0 vs. A2, p = 0,02; A1 vs. A2, p = 0,02; dag 2, A1 vs. A2, p = 0,04; dag, 3 A0 vs. A1, p = 0,007; A1 vs. A2, p = 0,04; dag 7, A0 vs. A1, p = 0,04). Alle CD-1-mus i eksperimentene P0 og A0 sluttet å angripe de siste 3 dagene. CD-1-mus som ble brukt til eksperimenter P0 og A0 ble brukt i A1, der det var en konsistens i angrep (figur 2B), noe som indikerer at CD-1 var mer utsatt for aggresjon hvis de ble utsatt for fysiske interaksjoner før.

Av denne grunn, som beskrevet i trinn 2.1 og 2.2, ble CD-1-musene screenet spesifikt for deres aggresjon mot ungdomsmusene og primet med en voksen C57BL/6-hann for aggresjon mot de unge C57BL/6-musene. Videre ble AcSD brukt til å øke alderen fra PND 21 til PND 25 og fortsatt målrette mot tidlig ungdomstid.

Under AcSD-øktene økte CD-1-mus antall angrep mot ungdomsmusene i et mer konsistent mønster som vist i figur 2D. I motsetning til det kroniske sosiale nederlagsparadigmet ble det ikke funnet noen signifikant interaksjon mellom sesjonen og den eksperimentelle kohorten (figur 2D, toveis gjentatte mål ANOVA: F(35, 483) = 1,33, p = 0,1), det var en hovedeffekt av sesjon (F(5,644, 389,5) = 14,15, p < 0,0001) og en hovedeffekt av kohort (F(5, 69) = 7,91, p < 0,0001); Holm-Sidak post hoc-test viste ikke signifikante forskjeller mellom kohortene. En sammenligning av gjennomsnittet av angrep mellom kohorter avslørte at denne effekten for det meste var drevet av kohort A7, som hadde et signifikant høyere antall angrep (data ikke vist, enveis ANOVA F(5, 69) = 7,911, p < 0,0001; Holm-Sidak post hoc-tester : A3 vs. A6, p = 0,04; A7 vs. A5, p = 0,002; A7 vs. A6, p < 0,0001; A7 vs. A8, p = 0,0001).

Ungdomsmus fikk flere angrep med primede CD-1-mus under AcSD enn ungdomsmus utsatt for en kronisk sosial nederlagsprotokoll (figur 2E, uparret t-test med Welchs korreksjon, t = 15.40, df = 17.87, p < 0.0001) ved bruk av naive (ikke-primede) CD-1-mus. Angrepene var ikke konsistente under den kroniske sosiale nederlagsprotokollen, og faktisk ble flere eksperimentelle mus ikke angrepet i det hele tatt.

Figure 2
Figur 2: Sammenligning av antall anfall per dag mellom kronisk sosialt nederlagsstress og AcSD. (A) Tidslinje for den kroniske sosiale nederlagsstressmodellen. (B) Antall angrep per dag for hver eksperimentelle kohort (P0, P1, A1 og A2) under kronisk sosialt nederlagsstress hos unge C57BL/6 hannmus (toveis gjentatte mål ANOVA). (C) Tidslinje for modellen for akselerert sosialt nederlagsstress (AcSD). (D) Antall angrep per dag for hver eksperimentelle kohort (A3-A8) under AcSD hos unge C57BL/6 hannmus (toveis gjentatte mål ANOVA). (E) Gjennomsnittlig antall anfall var signifikant høyere for AcSD (uparret t-test med Welchs korreksjon, ****p < 0,0001). Alle data er vist som gjennomsnitt ± SEM. Forkortelser: CSDS = kronisk sosialt nederlagsstress; SIT = sosial interaksjonstest; PND = postnatal dag; P0, A0-A8 = etiketter for hver eksperimentelle kohort. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Angrepsmønster under AcSD-økter påvirker ikke sosial fenotype 24 timer senere
Etter eksponering for sosialt nederlag viste de fleste unge hannmus ikke sosial unngåelse når de ble testet i SIT (figur 3B, kronisk sosialt nederlag: enveis ANOVA F(2, 43) = 14,57, p < 0,0001. F, AcSD: Kruskal-Wallis-test, H(2) = 72,35, p < 0,0001). For begge modellene var det ingen signifikante forskjeller i antall angrep mellom sosialt unnvikende og ikke-sosialt unnvikende beseirede mus (figur 3D, kronisk sosialt nederlag: toveis gjentatte mål ANOVA, F(9, 252) = 4,07, p = 0,21. H. AcSD: toveis gjentatte mål ANOVA, F(7, 511) = 1,32, p = 0,24). Andelen robuste mus var imidlertid høyere etter kronisk sosialt nederlag enn etter AcSD-eksponering (figur 3C,G, 70 % vs. 55,26 %, binomial test (ensidig), p = 0,0047).

Figure 3
Figur 3: Sammenligning av sosial interaksjonstest (SIT) etter kronisk sosialt nederlagsstress og AcSD-paradigmene. (B) Fordeling av SIT-score etter kronisk sosialt nederlagsstress i ungdomsårene (enveis ANOVA). (C) Andel motstandsdyktige/mottakelige etter kronisk sosialt nederlagsstress i ungdomsårene. (D) Antall angrep etter fenotype mottatt under kronisk sosialt nederlagsstress, ingen signifikante forskjeller mellom motstandsdyktige og mottakelige ble funnet (toveis gjentatte tiltak ANOVA). (E) Tidslinje for modellen for akselerert sosialt nederlagsstress (AcSD). (F) Fordeling av SIT-skår etter AcSD i ungdomsårene (Kruskal-Wallis). Dette tallet er endret fra57. (G) Andelen motstandsdyktige/mottakelige etter AcSD i ungdomsårene. Dette tallet er endret fra57. (H) Antall angrep etter fenotype mottatt under AcSD; det er ingen forskjell mellom motstandsdyktig og mottakelig (toveis gjentatte målinger ANOVA). Dette tallet er endret fra59. **p < 0,001, ****p < 0,0001. Alle data er vist som gjennomsnitt ± SEM. Forkortelser: PND = postnatal dag; Con = kontroller; Res = spenstig; Sus = mottakelig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

AcSD kan brukes hos unge C57BL/6 hunnmus
Fordi PND 25 C57BL/6 hann- og hunnmus ikke har nådd reproduktiv modenhet, kan primede CD-1-mus presentere aggressive angrep mot unge hunnmus som de gjorde mot unge hannmus. Priming-fasen måtte imidlertid forlenges for å nå et jevnt antall anfall (figur 4A). Som vist i figur 4B ble det ikke funnet noen interaksjon mellom dag og kohort på tvers av eksperimenter (figur 4B, toveis gjentatte mål ANOVA: F(35 707) = 1,38, p = 0,07), det var en hovedeffekt av økten (F(6,286, 634,9) = 16,1, p < 0,0001) og en hovedeffekt av kohorten (F(5, 101) = 11,34, p < 0,0001; Holm-Sidak post hoc-tester : økt 2 C4 vs C8, p = 0.03; økt 6 C7 vs C4, p = 0,02; C7 mot C5, p = 0,02; økt 7 C8 vs C3, p = 0,02; C8 mot C4, p = 0,045). Flertallet av unge C57BL/6 hunnmus eksponert for AcSD var motstandsdyktige mot sosial unngåelse (figur 4C, Brown-Forsythes ANOVA: F(2,113,4) = 27,2, p < 0,0001), tilsvarende unge hannmus. Det ble ikke funnet noen signifikant forskjell i antall angrep mellom spenstive og mottakelige mus (figur 4E, toveis gjentatte mål ANOVA, sesjon x fenotypeinteraksjon: F(7, 714) = 0,73, p = 0,64, hovedeffekt av sesjon F(6,375, 650,3) = 7,02, p < 0,0001, ingen hovedeffekt av fenotype F(1, 102) = 0,4, p = 0,53).

Figure 4
Figur 4: AcSD hos unge hunnmus. (A) Tidslinje for eksperimentet. (B) Antall angrep per dag etter eksperiment under AcSD (toveis gjentatte tiltak ANOVA). (C) Fordeling av SIT-score etter AcSD i ungdomsårene hos hunnmus (Brown-Forsythes ANOVA). (D) Andel spenstige/mottakelige etter AcSD i ungdomsårene (høyre). (E) Antall angrep etter fenotype mottatt under AcSD; ingen signifikante forskjeller mellom spenstige og mottakelige mus ble funnet (toveis gjentatte mål ANOVA). Alle data er vist som gjennomsnitt ± SEM. (C-E) Disse tallene er endret fra59. Forkortelser: SIT = sosial interaksjonstest; PND = postnatal dag; C3-C8 = etiketter for hver eksperimentelle kohort; Con = kontroller; Res = spenstig; Sus = mottakelig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggstabell 1: Skåringsarkmal for dag 1 av screening med voksne. Forkortelser: CD-1 = ID for CD-1-mus screenet, Exp = Eksperiment-ID, 3 min = Varighet av screeningøkten for C57BL/6 voksne mus, BL6 ID = ID for C57BL/6 voksne mus brukt til screening, Lat 1 ADULTS = Latens av det første angrepet fra CD-1 mot C57BL/6 voksenmus, # aggresjoner = Antall angrep utført av CD-1. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 2: Skåringsarkmal for screening med voksne og unge. Forkortelser: Exp = Eksperiment-ID, 1 min = Varighet av screeningøkten for C57BL/6 voksne mus, BL6 ID = ID for C57BL/6 voksne mus brukt til screening, Lat 1 ADULTS = Latens av det første angrepet fra CD-1 mot C57BL/6 voksenmus, # aggresjoner = Antall angrep utført av CD-1, 5 min = Varighet av screeningøkten for C57BL/6 ungdomsmus, BL6 Ad = ID for C57BL/6 ungdomsmus brukt til screening, Lat 1 Adolescents = Latency av det første angrepet fra CD-1 mot C57BL/6 ungdomsmus, CD-1 = ID av CD-1 mus screenet. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 3: Poengarkmal for grunningsfasen. Forkortelser: CD-1 = ID for CD-1-mus brukt til priming, Exp = Eksperiment-ID, 30 sek = Varighet av priming-økten for C57BL/6 voksne mus, BL6 ID = ID for C57BL/6 voksne mus brukt til priming, Lat 1 ADULTS = Latens av det første angrepet fra CD-1 mot C57BL/6 voksenmus, # aggresjoner = Antall angrep utført av CD-1, Min: 3 = Varighet av priming-økten for C57BL/6 ungdomsmus, BL6 Ad = ID for C57BL/6 ungdomsmus brukt til priming, Lat 1 Youths = Latency av det første angrepet fra CD-1 mot C57BL/6 ungdomsmus, # mountings = Antall mountings mottatt av C57BL/6 ungdomsmus. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 4: Scoringsarkmal for sosial nederlagsplanlegging (20 ungdomsmus). Forkortelser: CD1 = ID for CD-1-mus, E = Eksperiment, H = Fuktighet, 1 st = Sesjon 1, 2nd = Sesjon 2, BL6 voksen = ID for C57BL/6 voksne mus brukt til priming, Vekt = Vekt av C57BL/6 ungdomsmus, # angrep = Antall angrep utført av CD-1, # sår = Antall sår mottatt av C57BL/6 ungdomsmus. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Utfyllende tabell 5: Eksempel på planlegging av sosialt nederlag. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Utfyllende tabell 6: Mal for skadeovervåking av voksne C57BL/6 hannmus. Forkortelser: 1. - # sår = Antall sår mottatt av C57BL/6 voksen mus i økt 1, 2. - # sår = Antall sår mottatt av C57BL/6 voksen mus i økt 2, BL6 = ID for C57BL/6 voksne mus brukt til priming. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 7: Kontrollgruppeplanleggingsmal (10 ungdomsmus). Regler for kryptering: Ikke gjenta den samme konsikken; en mus kan ikke gjenta den samme siden av boksen på samme dag; mus må krypteres med mus fra forskjellige bur fra hjemmeburet; hjemmebur er nummerert; museantall er gitt avhengig av hjemmeburnummeret; beseirede og kontrollgrupper blir tatt tilfeldig fra hjemmeburet. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggstabell 8: Eksempel på kontrollgruppeplanlegging. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Konsekvent, aggressiv oppførsel hos CD-1-mus
Under screeningfasen er det svært viktig å legge merke til all atferden som vises av CD-1 (jage, montere atferd, sniffe, stelle eller bite) og å følge disse postene nøye når du velger CD-1-musene for AcSD. Det er sannsynlig at en CD-1-mus som samhandler med ungdomsmusen uten å angripe den, vil utvikle aggressivitet mot ungdomsmus under priming. Derimot vil en CD-1-mus som angriper en voksen mus, men ikke nærmer seg en ungdomsmus, sannsynligvis ikke utvikle aggressivitet mot ungdomsmus.

CD-1 priming-fasen gjør det mulig å utvikle aggressiv oppførsel mot unge mus. Derfor er det avgjørende å ha et nøyaktig register over atferden for valg av mus. Videre er det viktig å alltid screene CD-1-musene før et nytt eksperiment, selv når en CD-1-mus har vært gjennom nederlag før. Noen CD-1-mus kan slutte å angripe ungdomsmus når de blir stående uforstyrret i hjemmeburene sine i en periode, andre kan utvikle økt territoriell atferd fordi de er plassert i isolasjon.

For priming av CD-1-musene anbefaler protokollen 3 dager. Hvis naive CD-1-mus brukes, kan primingen forlenges hvis CD-1-musene ikke angriper ungdomsmusene aktivt. For CD-1-mus som hadde vært gjennom sosialt nederlag med unge mus, kan varigheten av denne priming-fasen reduseres.

Screening- og priming-fasene er avgjørende for vellykkede AcSD-økter. For eksempel vil CD-1-mus som har blitt riktig primet angripe og nå grensen på 10 angrep raskere enn en mindre aggressiv CD-1-mus, noe som gir mulighet for korte nederlagsepisoder.

Under AcSD er det avgjørende å skille dyrene når angrepene er veldig voldsomme (dvs. CD-1-musen slipper ikke C57BL/6J-musen); ellers vil ungdomsmusene bli skadet, og angrepene må begrenses. Behandling av skader er også svært viktig for å unngå infeksjoner; Det anbefales ikke å bruke fete salver til behandling av skader fordi dyr vil slikke bort salven, miste hår i prosessen og avsløre skaden.

Feilsøking av AcSD som skal brukes til unge C57BL/6 hann- og hunnmus
Modellen for kronisk sosialt nederlagsstress presenterte viktige begrensninger for bruken i tidlig ungdomstid hos både hann- og hunnmus C57BL/6. I denne delen er modifikasjonene som ble gjort for utviklingen av AcSD-modellen i ungdomsårene beskrevet.

Utstyr: Den komplette listen over utstyr er oppført i materialtabellen. C57BL/6 ungdomsmusene tidlig i ungdomsårene (PND 21-30) var for små for utstyret beskrevet tidligere brukt i laboratoriet60. Diameteren på perforeringene på akrylglassdelerne er stor nok til at C57BL/6-mus kan krysse fra det ene rommet til det andre, der angriperen befinner seg. For å forhindre dette ble det laget akrylglassdelere som har perforeringer med liten diameter. I tillegg måtte ståltrådtoppen festes med klips for å hindre mus i å rømme burene. Dekklokkene som brukes brukes vanligvis til ventilerte bur. I dette tilfellet ble disse dekklokkene brukt uten den beskyttende bomullen for å tillate riktig ventilasjon og for å forhindre at mus rømmer fra buret. Det er viktig å tenke på at mengden flissengetøy som brukes skal tillate unge mus å nå maten og vanndispenseren plassert på lokket. Imidlertid kan store mengder flis bli våte.

Valg av CD-1-musene: I den kroniske modellen blir CD-1-musene screenet for aggressiv oppførsel før eksperimentet begynner. CD-1-mus velges ut etter 3 dagers screening, og deres aggressive oppførsel vurderes. Etter screening velges dyrene som har latenstider til å angripe under 30 s og som viser konsekvente angrep for neste fase. Under de kroniske sosiale nederlagseksperimentene opprettholdt imidlertid ikke CD-1-musene et konsistent antall angrep i 10 dager (figur 2B). Derfor måtte flere CD-1-mus fjernes fra eksperimentet på grunn av mangel på aggresjon mot inntrengermusen. Faktisk, mens bare en liten andel av CD-1-musene angrep inntrengermusen, var noen av disse musene ekstremt aggressive og noen ganger alvorlig skadet hannmusene C57BL/6 PND 21. Derfor ble screeningen av CD-1-musene endret til å selektere aggressive mus mot ungdomsmus, noe som økte den fysiske aggresjonen.

Konsistens av fysisk aggresjon: Konsekvent fysisk aggresjon fører til å oppnå et raskt og robust nederlag for inntrengeren6. For å standardisere prosedyrer mellom eksperimenter og eksperimenter ble det brukt en operativ definisjon av angrep57, noe som muliggjorde presis kvantitativ måling av aggressivitet.

Priming aggressivitet: Under de kroniske sosiale nederlagseksperimentene varierte antall angrep sterkt, og avtok i løpet av de siste dagene av eksperimentet (figur 2B). For å øke den aggressive oppførselen til CD-1-musene mot de unge C57BL/6-hannmusene, ble CD-1-musene primet til å være aktivt aggressive uavhengig av musene som ble introdusert til hjemmeburet deres. Denne oppførselen ble oppnådd ved å introdusere en voksen C57BL/6 hannmus i 1 minutt før ungdomsmusen, og oppmuntre CD-1-musen til å angripe ungdomsmusene etter at den voksne ble hentet.

Modellens varighet: Unge C57BL/6-mus ved PND 21 er svært små, og CD-1-mus kan skade dem alvorlig med bare ett angrep. Derfor, for å målrette mot tidlig ungdomstid og fortsatt ha gjentatte økter med sosialt nederlag, ble en alternativ modell til det klassiske 10-dagers kroniske sosiale nederlagsstresset valgt. Det akselererte sosiale nederlagsstresset (AcSD)42 består av to økter med fysisk aggresjon per dag, en økt om morgenen og en om ettermiddagen, i totalt 4 dager (8 økter). AcSD-modellen tillot en økning i alderen til ungdomsmusene fra PND 21 til PND 25, fortsatt kun rettet mot tidlig ungdomstid.

Begrensninger av AcSD i ungdomsårene
AcSD-modellen har noen begrensninger. Sammenlignet med den kroniske sosiale nederlagsmodellen hos voksne, krever AcSD screening av dobbelt så mange CD-1-mus av unge C57BL/6-mus. Varigheten av priming-fasen kan variere avhengig av CD-1-musenes aggressive oppførsel; som sådan bør AcSD-planen planlegges med forventning, og alle disse variablene må vurderes. Siden de fleste ungdomsmus vil vise motstandskraft mot sosial unngåelse etter AcSD-eksponering, for å oppnå et representativt antall mottakelige mus, bør den eksperimentelle kohorten bestå av minst 20 dyr for hanner og 30 for hunner.

AcSD hos unge mus gir konsistente resultater på tvers av eksperimentelle kohorter
Etter eksponering for sosialt stress med både kronisk sosialt nederlag og AcSD-protokoller, viste de fleste unge hannmus motstandskraft mot sosial unngåelse. For den kroniske sosiale nederlagsmodellen var det imidlertid ikke mulig å forkaste variasjonen i antall angrep fra CD-1 som en forvirrende variabel. I motsetning til dette, for AcSD-eksperimenter, blir CD-1-mus primet før hver nederlagsøkt for å oppnå et konsistent antall angrep på tvers av økter (figur 2D,E). Totalt sett viser alle de eksperimentelle kohortene av mus eksponert for AcSD et lignende antall angrep på tvers av økter (figur 2D); dette er imidlertid ikke tilfelle for musekohorter utsatt for den kroniske sosiale nederlagsmodellen (figur 2B).

Å bruke det kroniske sosiale nederlagsstresset hos voksne C57BL/6 hunnmus har vært utfordrende sammenlignet med andre som bruker denne modellen i andre arter og stammer 9,13,45,61. For AcSD-eksperimenter hos unge C57BL/6 hunnmus ble primingfasen forlenget, noe som sikret den aggressive oppførselen til CD-1-musene (figur 4A). Imidlertid kan variasjon observeres i antall angrep på tvers av kvinnelige eksperimentelle kohorter (figur 4B). Ikke desto mindre, i disse eksperimentene, viste alle CD-1-mus aggressiv oppførsel mot hunner. For å øke antall angrep kan primingen med hannmusene utvides til 1 min. Som hos hanner var andelen unge C57BL/6 hunnmus som var motstandsdyktige mot sosial unngåelse høyere enn de som viste mottakelighet (figur 4C,D). Videre var det ingen forskjell på antall angrep mellom spenstige og mottakelige mus (figur 4E), noe som indikerer at fenotypen er uavhengig av angrep. AcSD kan brukes i unge C57BL/6 hunnmus, og eksperimenter kan gjøres samtidig på begge kjønn med samme CD-1-mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av Canadian Institutes for Health Research (CF Grant Numbers: MOP-74709; PJT 190045), National Institute on Drug Abuse (CF Grant number: R01DA037911), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (CF Grant Number: 2982226). Andrea Pantoja-Urban ble støttet av The National Council for Humanities, Science and Technologies/Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCYT) fra Mexico og FRQNT - Merit stipendprogram for utenlandske studenter (PBEEE). Samuel Richer ble støttet av et stipend fra Integrated Program of Neuroscience ved McGill University. Figurillustrasjoner ble laget ved hjelp av maler fra BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 adolescent mice  In house breeding Mice were breeded at the Neurophenotyping Centre of the Douglas Mental Health University Institute.
C57BL/6 adult mice  Charles River Laboratories Strain Code: 027 Mice are ordered so as to arrive at PND>65 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
C57BL/6J adolescent mice  Jackson Labs Strain Code: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664 Mice are ordered so as to arrive at PND 24 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
CD-1 mice  Charles River Laboratories Strain Code: 022 Mice retired breeders more than three months of age and singled housed throughout.
Cleaning solution  Virox Animal Health DIN 02537222 Prevail: Accelerated Hydrogen Peroxide. Desinfectant cleaner and deodorizer.
Clear perforated acrylic glass divider  Manufactured by Douglas Hospital, custom order 0.6 cm (w) × 45.7 cm (d) × 22.23 cm (h); perforations of 0.6 cm diameter. The dividers are perforated allowing sensory but no physical contact between the pair of mice.
Clear rectangular rat cages  Allentown 24 cm (w) × 48.3 cm (d) × 22.23 (h).
Cotton squares for bedding Inotiv Envigo T.6060 iso-BLOX 2.5 cm x 2.5 cm. Added to the social defeat apparatus.
Hard woodchip bedding Inotiv Envigo Teklad 7090, 7115 Sani-chip bedding.
Large binder clips to secure the steel-wire tops STAPLES Item #: 132429, Model #: 24178-CA 51 mm
Medium binder clips to secure the steel-wire tops Item #: 132367, Model #: 24172-CA 32 mm, in case the cover lids of the rat cages do not close with the large clips
Pain relief cream Polysporin Plus Pain Relief Cream (red format, NOT ointment), 2 Antibiotics plus lidocaine hydrochloride
Paired Steel-wire tops  24 cm (w) × 48 cm (d) with 0.6 cm (w) of separation between the grill
Removable wire-mesh enclosure  Johnston industrial plastics 11 cm (w) × 6.8 cm (d) × 42 cm (h) custom order; two per social interaction test arena secured in precut clear polycarbonate
Social interaction open-field arena PEXIGLAS 45 cm (w) × 45 cm (d) × 49 cm (h), custom-crafted from opaque acrylic glass (Plexiglas) 
Stopwatch  For timing defeat sessions
Video camera with infrared lights  Swann SRDVR-44580V  Swann Camera - 4 Channel 1080p Digital Video Recorder & 2 x PRO-T853
Video tracking software  Topscan 2.0 Clever Systems Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miczek, K. A. A new test for aggression in rats without aversive stimulation: Differential effects of d-amphetamine and cocaine. Psychopharmacology. 60, 253-259 (1979).
  2. Kudryavtseva, N., Bakshtanovskaya, I., Koryakina, L. Social model of depression in mice of c57bl/6j strain. Pharmacol Biochem Behav. 38 (2), 315-320 (1991).
  3. Blanchard, R. J., Mckittrick, C. R., Blanchard, D. C. Animal models of social stress: Effects on behavior and brain neurochemical systems. Physiol Behav. 73 (3), 261-271 (2001).
  4. Berton, O., et al. Essential role of bdnf in the mesolimbic dopamine pathway in social defeat stress. Science. 311 (5762), 864-868 (2006).
  5. Krishnan, V., et al. Molecular adaptations underlying susceptibility and resistance to social defeat in brain reward regions. Cell. 131 (2), 391-404 (2007).
  6. Bartolomucci, A., Fuchs, E., Koolhaas, J. M., Ohl, F. Acute and chronic social defeat: Stress protocols and behavioral testing. Neuromethods. 42, 261-275 (2009).
  7. Golden, S. A., Covington Iii, H. E., Berton, O., Russo, S. J. A standardized protocol for repeated social defeat stress in mice. Nat Protoc. 6 (8), 1183-1191 (2011).
  8. Bourke, C. H., Neigh, G. N. Behavioral effects of chronic adolescent stress are sustained and sexually dimorphic. Horm Behav. 60 (1), 112-120 (2011).
  9. Steinman, M. Q., Trainor, B. C. Sex differences in the effects of social defeat on brain and behavior in the California mouse: Insights from a monogamous rodent. Semin Cell Dev Biol. 61, 92-98 (2017).
  10. Takahashi, A., et al. Establishment of a repeated social defeat stress model in female mice. Sci Rep. 7 (1), 12838 (2017).
  11. Wright, E. C., et al. Sexual differentiation of neural mechanisms of stress sensitivity during puberty. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (43), 2306475120 (2023).
  12. Yin, W., et al. Repeated social defeat in female mice induces anxiety-like behavior associated with enhanced myelopoiesis and increased monocyte accumulation in the brain. Brain Behav Immun. 78, 131-142 (2019).
  13. Van Doeselaar, L., et al. Chronic social defeat stress in female mice leads to sex-specific behavioral and neuroendocrine effects. Stress. 24 (2), 168-180 (2021).
  14. Hollenstein, T., Lougheed, J. P. Beyond storm and stress: Typicality, transactions, timing, and temperament to account for adolescent change. Am Psychol. 68 (6), 444 (2013).
  15. Sawyer, S. M., Azzopardi, P. S., Wickremarathne, D., Patton, G. C. The age of adolescence. Lancet Child Adolesc Health. 2 (3), 223-228 (2018).
  16. Adriani, W., Laviola, G. Windows of vulnerability to psychopathology and therapeutic strategy in the adolescent rodent model. Behav Pharmacol. 15 (5), 341-352 (2004).
  17. Reynolds, L. M., et al. Early adolescence is a critical period for the maturation of inhibitory behavior. Cereb Cortex. 29 (9), 3676-3686 (2019).
  18. Reynolds, L. M., et al. Amphetamine disrupts dopamine axon growth in adolescence by a sex-specific mechanism in mice. Nat Commun. 14 (1), 4035 (2023).
  19. Sisk, L. M., Gee, D. G. Stress and adolescence: Vulnerability and opportunity during a sensitive window of development. Curr Opin Psychol. 44, 286-292 (2022).
  20. Spear, L. P. The adolescent brain and age-related behavioral manifestations. Neurosci Biobehav Rev. 24 (4), 417-463 (2000).
  21. Reynolds, L. M., Flores, C. Mesocorticolimbic dopamine pathways across adolescence: Diversity in development. Front Neural Circuits. 15, 735625 (2021).
  22. Manitt, C., et al. The netrin receptor dcc is required in the pubertal organization of mesocortical dopamine circuitry. J Neurosci. 31 (23), 8381-8394 (2011).
  23. Reynolds, L. M., et al. Dcc receptors drive prefrontal cortex maturation by determining dopamine axon targeting in adolescence. Biol Psychiatry. 83 (2), 181-192 (2018).
  24. Kalsbeek, A., Voorn, P., Buijs, R., Pool, C., Uylings, H. Development of the dopaminergic innervation in the prefrontal cortex of the rat. J Comp Neurol. 269 (1), 58-72 (1988).
  25. Cuesta, S., et al. Dcc-related developmental effects of abused-versus therapeutic-like amphetamine doses in adolescence. Addict Biol. 25 (4), 12791 (2020).
  26. Bekhbat, M., et al. Adolescent stress sensitizes the adult neuroimmune transcriptome and leads to sex-specific microglial and behavioral phenotypes. Neuropsychopharmacology. 46 (5), 949-958 (2021).
  27. Hammerslag, L. R., Gulley, J. M. Age and sex differences in reward behavior in adolescent and adult rats. Dev Psychobiol. 56 (4), 611-621 (2014).
  28. Wheeler, A. L., et al. Adolescent cocaine exposure causes enduring macroscale changes in mouse brain structure. J Neurosci. 33 (5), 1797-1803 (2013).
  29. Schneider, M. Adolescence as a vulnerable period to alter rodent behavior. Cell Tissue Res. 354, 99-106 (2013).
  30. Makinodan, M., Rosen, K. M., Ito, S., Corfas, G. A critical period for social experience-dependent oligodendrocyte maturation and myelination. Science. 337 (6100), 1357-1360 (2012).
  31. Iñiguez, S. D., et al. Social defeat stress induces a depression-like phenotype in adolescent male c57bl/6 mice. Stress. 17 (3), 247-255 (2014).
  32. Iñiguez, S. D., et al. Social defeat stress induces depression-like behavior and alters spine morphology in the hippocampus of adolescent male c57bl/6 mice. Neurobiol Stress. 5, 54-64 (2016).
  33. Latsko, M. S., Farnbauch, L. A., Gilman, T. L., Lynch Iii, J. F., Jasnow, A. M. Corticosterone may interact with peripubertal development to shape adult resistance to social defeat. Horm Behav. 82, 38-45 (2016).
  34. Zhang, F., Yuan, S., Shao, F., Wang, W. Adolescent social defeat induced alterations in social behavior and cognitive flexibility in adult mice: Effects of developmental stage and social condition. Front Behav Neurosci. 10, 149 (2016).
  35. Xu, H., et al. Effects of adolescent social stress and antidepressant treatment on cognitive inflexibility and bdnf epigenetic modifications in the mpfc of adult mice. Psychoneuroendocrinology. 88, 92-101 (2018).
  36. Huang, G. B., et al. Effects of chronic social defeat stress on behaviour, endoplasmic reticulum proteins and choline acetyltransferase in adolescent mice. Int J Neuropsychopharmacol. 16 (7), 1635-1647 (2013).
  37. Hasegawa, S., et al. Dysfunction of serotonergic and dopaminergic neuronal systems in the antidepressant-resistant impairment of social behaviors induced by social defeat stress exposure as juveniles. Int J Neuropsychopharmacol. 21 (9), 837-846 (2018).
  38. Resende, L., et al. Social stress in adolescents induces depression and brain-region-specific modulation of the transcription factor max. Transl Psychiatry. 6 (10), e914 (2016).
  39. Mouri, A., et al. Juvenile social defeat stress exposure persistently impairs social behaviors and neurogenesis. Neuropharmacology. 133, 23-37 (2018).
  40. Rodriguez-Arias, M., et al. Social defeat in adolescent mice increases vulnerability to alcohol consumption. Addict Biol. 21 (1), 87-97 (2016).
  41. Montagud-Romero, S., et al. Repeated social defeat and the rewarding effects of cocaine in adult and adolescent mice: Dopamine transcription factors, probdnf signaling pathways, and the trkb receptor in the mesolimbic system. Psychopharmacology. 234, 2063-2075 (2017).
  42. Wilkinson, M. B., et al. A novel role of the wnt-dishevelled-gsk3β signaling cascade in the mouse nucleus accumbens in a social defeat model of depression. J Neurosci. 31 (25), 9084-9092 (2011).
  43. Hyer, M., et al. Chronic adolescent stress causes sustained impairment of cognitive flexibility and hippocampal synaptic strength in female rats. Neurobiol Stress. 14, 100303 (2021).
  44. Bekhbat, M., et al. Chronic adolescent stress sex-specifically alters central and peripheral neuro-immune reactivity in rats. Brain Behav Immun. 76, 248-257 (2019).
  45. Pyter, L. M., Kelly, S. D., Harrell, C. S., Neigh, G. N. Sex differences in the effects of adolescent stress on adult brain inflammatory markers in rats. Brain Behav Immun. 30, 88-94 (2013).
  46. Dalsgaard, S., et al. Incidence rates and cumulative incidences of the full spectrum of diagnosed mental disorders in childhood and adolescence. JAMA psychiatry. 77 (2), 155-164 (2020).
  47. Pedersen, C. B., et al. A comprehensive nationwide study of the incidence rate and lifetime risk for treated mental disorders. JAMA psychiatry. 71 (5), 573-581 (2014).
  48. Heim, C., Shugart, M., Craighead, W. E., Nemeroff, C. B. Neurobiological and psychiatric consequences of child abuse and neglect. Dev Psychobiol. 52 (7), 671-690 (2010).
  49. Kessler, R. C., Petukhova, M., Sampson, N. A., Zaslavsky, A. M., Wittchen, H. U. Twelve-month and lifetime prevalence and lifetime morbid risk of anxiety and mood disorders in the united states. Int J Methods Psychiatr Res. 21 (3), 169-184 (2012).
  50. Boyd, A., et al. Gender differences in mental disorders and suicidality in europe: Results from a large cross-sectional population-based study. J Affect Disord. 173, 245-254 (2015).
  51. Bale, T. L., Epperson, C. N. Sex differences and stress across the lifespan. Nat Neurosci. 18 (10), 1413-1420 (2015).
  52. Hankin, B. L., Mermelstein, R., Roesch, L. Sex differences in adolescent depression: Stress exposure and reactivity models. Child Dev. 78 (1), 279-295 (2007).
  53. Kim, S., Colwell, S. R., Kata, A., Boyle, M. H., Georgiades, K. Cyberbullying victimization and adolescent mental health: Evidence of differential effects by sex and mental health problem type. J Youth Adolesc. 47, 661-672 (2018).
  54. Filipponi, C., Petrocchi, S., Camerini, A. L. Bullying and substance use in early adolescence: Investigating the longitudinal and reciprocal effects over 3 years using the random intercept cross-lagged panel model. Front Psychol. 11, 571943 (2020).
  55. Brody, G. H., Yu, T., Chen, E., Miller, G. E. Persistence of skin-deep resilience in african american adults. Health Psychol. 39 (10), 921 (2020).
  56. Rijlaarsdam, J., Cecil, C. A., Buil, J. M., Van Lier, P. A., Barker, E. D. Exposure to bullying and general psychopathology: A prospective, longitudinal study. Res Child Adolesc Psychopathol. 49, 727-736 (2021).
  57. Vassilev, P., et al. Unique effects of social defeat stress in adolescent male mice on the netrin-1/dcc pathway, prefrontal cortex dopamine and cognition. eNeuro. 8 (2), (2021).
  58. Vassilev, P., et al. Custom-built operant conditioning setup for calcium imaging and cognitive testing in freely moving mice. eNeuro. 9 (1), (2022).
  59. Pantoja-Urbán, A. H., et al. Gains and losses: Resilience to social defeat stress in adolescent female mice. Biol Psychiatry. 95 (1), 37-47 (2024).
  60. Torres-Berrío, A., et al. Dcc confers susceptibility to depression-like behaviors in humans and mice and is regulated by mir-218. Biol Psychiatry. 81 (4), 306-315 (2017).
  61. Ver Hoeve, E. S., Kelly, G., Luz, S., Ghanshani, S., Bhatnagar, S. Short-term and long-term effects of repeated social defeat during adolescence or adulthood in female rats. Neuroscience. 249, 63-73 (2013).

Tags

Nøkkelord: Sosialt nederlagsstress ungdomsmus C57BL/6 mann og kvinne sosial unngåelse akselerert sosialt nederlagsstress (AcSD)-modell hjerneutvikling atferdsutfall
Sosial nederlagsstressmodell for unge C57BL/6 mannlige og kvinnelige mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pantoja-Urbán, A. H., Richer,… More

Pantoja-Urbán, A. H., Richer, S., Giroux, M., Nouel, D., Flores, C. Social Defeat Stress Model for Adolescent C57BL/6 Male and Female Mice. J. Vis. Exp. (205), e66455, doi:10.3791/66455 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter