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Neuroscience

Modello di stress di sconfitta sociale per topi maschi e femmine adolescenti C57BL / 6

Published: March 15, 2024 doi: 10.3791/66455
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2,3,4,5
1Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 2Douglas Mental Health University Institute, McGill University, 3Department of Psychiatry, McGill University, 4Department of Neurology and Neurosurgery, Faculty of Medicine, McGill University, 5Ludmer Centre for Neuroinformatics & Mental Health, McGill University

Summary

Abbiamo sviluppato un modello di stress da sconfitta sociale accelerata per topi adolescenti C57BL/6, che funziona sia nei maschi che nelle femmine e consente l'esposizione durante periodi discreti dell'adolescenza. L'esposizione a questo modello induce l'evitamento sociale, ma solo in un sottogruppo di topi maschi e femmine sconfitti.

Abstract

Le avversità sociali nell'adolescenza sono prevalenti e possono avere un impatto negativo sulle traiettorie della salute mentale. La modellazione dello stress sociale nei roditori adolescenti maschi e femmine è necessaria per comprenderne gli effetti sullo sviluppo cerebrale in corso e sui risultati comportamentali. Il paradigma dello stress da sconfitta sociale cronica (CSDS) è stato ampiamente utilizzato per modellare lo stress sociale in topi maschi adulti C57BL/6 facendo leva sul comportamento aggressivo mostrato da un roditore maschio adulto nei confronti di un intruso che invade il suo territorio. Un vantaggio di questo paradigma è che permette di classificare i topi sconfitti in gruppi resilienti e suscettibili in base alle loro differenze individuali nel comportamento sociale 24 ore dopo l'ultima sessione di sconfitta. L'implementazione di questo modello nei topi C57BL/6 adolescenti è stata impegnativa perché i topi adulti o adolescenti non attaccano tipicamente i topi maschi o femmine adolescenti e perché l'adolescenza è un breve periodo di vita, che comprende discrete finestre temporali di vulnerabilità. Questa limitazione è stata superata adattando una versione accelerata del CSDS da utilizzare per topi maschi e femmine adolescenti. Questo paradigma di stress di 4 giorni con 2 sessioni di attacco fisico al giorno utilizza un maschio adulto C57BL/6 per innescare l'aggressività del topo CD-1 in modo tale da attaccare prontamente il topo adolescente maschio o femmina. Questo modello è stato definito stress da sconfitta sociale accelerata (AcSD) per i topi adolescenti. L'esposizione adolescenziale all'AcSD induce l'evitamento sociale 24 ore dopo sia nei maschi che nelle femmine, ma solo in un sottogruppo di topi sconfitti. Questa vulnerabilità si verifica nonostante il numero di attacchi sia coerente tra le sessioni tra gruppi resilienti e suscettibili. Il modello AcSD è abbastanza breve da consentire l'esposizione durante periodi discreti all'interno dell'adolescenza, consente la segregazione dei topi in base alla presenza o all'assenza di comportamenti di evitamento sociale ed è il primo modello disponibile per studiare lo stress da sconfitta sociale in topi femmine adolescenti C57BL/6.

Introduction

Il paradigma dello stress cronico da sconfitta sociale è ampiamente utilizzato per modellare lo stress sociale nei roditori maschi adulti del giorno postnatale (PND) >65. Questo paradigma si basa sul comportamento aggressivo naturale di un roditore maschio adulto quando un intruso invade il suo territorio. Questo modello viene utilizzato in una varietà di specie di roditori, tra cui ratti, criceti e topi 1,2,3,4,5,6,7,8,9, e consiste in una combinazione di aggressione fisica e stress psicologico della durata di circa 10 giorni, durante i quali un roditore intruso sperimenta alcuni minuti di aggressione fisica da parte del roditore residente. I due roditori rimangono nella gabbia domestica del residente, separati da un divisorio che permette il contatto sensoriale ma non fisico7. Negli esperimenti sui topi, i topi residenti/aggressori più comunemente usati sono i topi CD-1 svizzeri da riproduzione in pensione, che mostrano un robusto comportamento territoriale contro i topi intrusi 6,7. Per i topi intrusi, il ceppo meglio caratterizzato è il ceppo consanguineo C57BL/6 2,4,5. Il topo sconfitto è esposto a un nuovo aggressore ogni giorno per prevenire l'assuefazione all'aggressore. I topi di controllo sono alloggiati con un conspecifico diverso ogni giorno. A 24 ore dopo l'ultima sessione di sconfitta, i topi sperimentali vengono testati in un test di interazione sociale (SIT) in cui possono esplorare un campo aperto in assenza (nessun bersaglio) o in presenza di un nuovo topo CD-1 (bersaglio). I topi di controllo trascorrono più tempo nella zona di interazione con il bersaglio rispetto alla parte non bersaglio del compito. I topi sconfitti sono classificati come suscettibili (rapporto<1) o resilienti (rapporto>1) in base a un rapporto di interazione sociale (tempo trascorso nella zona di interazione con l'aggressore presente/tempo trascorso nella zona di interazione con l'aggressore assente). Questa procedura fornisce uno strumento utile per studiare le differenze individuali in risposta allo stress.

Fino a pochi anni fa, il modello di stress da sconfitta sociale cronica è stato utilizzato principalmente nei topi maschi adulti perché le accentuate gerarchie di dominanza maschile implicano la lotta contro i maschi ma non contro le femmine 6,7. Inoltre, i roditori maschi in genere non attaccano le femmine; invece, si impegnano in comportamenti di accoppiamento10. Nonostante questi ostacoli, sono state sviluppate diverse strategie per adattare il paradigma dello stress da sconfitta sociale cronica per i topi femmine adulte. Ad esempio, il modello murino californiano di sconfitta sociale si basa sull'aggressività naturale di questa specie monogama di entrambi i sessi quando difendono illoro territorio. Altri approcci si concentrano sull'induzione del comportamento aggressivo dei topi CD-1 stimolando il loro ipotalamo ventromediale ad avere un comportamento aggressivo costante10,12, o applicando urina maschile nei topi femmine adulte sperimentali per ricevere attacchi dagli aggressori CD-113. Questa accresciuta e costante aggressività dei topi CD-1 è fondamentale per il topo intruso sperimentale per mostrare chiari segni comportamentali di subordinazione nei confronti degli attacchi ripetuti da parte dell'aggressore durante la durata dell'interazione6.

Adattamento del modello di sconfitta sociale cronica da utilizzare nei topi C57BL/6 adolescenti
L'adolescenza è un periodo caratterizzato da una sostanziale maturazione psicosociale, che si svolge in parallelo con cambiamenti nella micro e macro architettura del cervello, in particolare nella corteccia prefrontale. Sia nell'uomo che nei roditori, c'è poco consenso riguardo all'inizio e alla fine specifici del periodo adolescenziale14,15. Inoltre, ci sono finestre critiche di vulnerabilità all'interno dell'adolescenza per l'interruzione indotta dall'esperienza dello sviluppo cerebrale e cognitivo in corso 16,17,18,19. La pubertà e l'adolescenza si verificano contemporaneamente, ma questi termini non sono sinonimi. La pubertà indica l'inizio della maturazione sessuale, mentre l'adolescenza rappresenta una fase più ampia caratterizzata dal graduale passaggio da uno stato giovanile al raggiungimento dell'indipendenza20. Diversi gruppi hanno suggerito che l'adolescenza nei topi si estende dallo svezzamento (PND 21) fino all'età adulta (PND 60)21. In particolare, la prima adolescenza può essere indicata come la prima e la seconda settimana dopo lo svezzamento (PND 21-34) e la metà dell'adolescenza come il periodo PND 35-48. Questi intervalli comprendono periodi di sviluppo distinti riguardanti ad esempio lo sviluppo del sistema della dopamina 22,23,24, la vulnerabilità agli effetti dei farmaci sullo sviluppo delle reti neuronali 17,25,26,27 e caratteristiche comportamentali distinte 16,20,28,29,30.

Il comportamento di combattimento del topo residente è richiesto per il protocollo di sconfitta sociale. Tuttavia, come con i topi femmine, i maschi in genere non si impegnano in interazioni aggressive con i topi della prima adolescenza, forse perché non li percepiscono come una minaccia. La maggior parte degli studi che esplorano gli effetti della sconfitta sociale cronica nei topi adolescenti C57BL/6 sono stati condotti durante il periodo medio-adolescenziale 31,32,33,34,35; altri non specificano il giorno postnatale dell'esposizione adolescenziale36,37, o estendono i giorni per la sconfitta alla prima età adulta38 o non consentono il contatto sensoriale39; Altri studi su topi adolescenti utilizzano ceppi diversi40,41. Le caratteristiche di questi studi che utilizzano lo stress cronico da sconfitta sociale nei topi maschi adolescenti sono riassunte nella Tabella 1.

Il nostro gruppo di ricerca è interessato a individuare specifiche finestre di esposizione adolescenziali, inclusa la prima adolescenza, in topi C57BL/6. A causa della breve durata dei diversi periodi dell'adolescenza, è stata progettata una versione modificata della versione accelerata del paradigma dello stress da sconfitta sociale cronica42. Questo modello è stato definito stress da sconfitta sociale accelerata (AcSD) per i topi adolescenti. Lavori precedenti mostrano che ci sono significative differenze di sesso nella sensibilità allo stress sociale nell'adolescenza nei ratti 8,26,43,44,45, così come negli effetti dannosi dello stress sociale sulle traiettorie di salute mentale negli esseri umani 46,47,48,49,50,51,52, 53,54,55,56. Il modello AcSD funziona efficacemente anche per i topi femmine adolescenti, consentendo loro di studiare le potenziali conseguenze specifiche del sesso e di esplorare le basi neurobiologiche.

Tabella 1: Studi che utilizzano paradigmi di stress da sconfitta sociale in topi maschi adolescenti. Ceppo e specie: California Topo: Peromyscus californicus. C57BL/6: Mus musculus black 6 ceppo di topo consanguineo. C57BL/6J: Modello murino consanguineo nero 6 di M. musculus fornito dai laboratori di Jackson. CD-1: M. musculus da un ceppo di topo albino svizzero di razza. ICR: M. musculus Institute of Cancer Research ha superato il ceppo di topo albino. OF1: M. musculus Oncins France 1 ceppo di topo albino di razza.
Abbreviazioni: wk = settimana; PND = Giorno postnatale; res = resiliente; sus = suscettibile; unsus = insensibile. Clicca qui per scaricare questa tabella.

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Protocol

Le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con le linee guida del Canadian Council of Animal Care e approvate dalla McGill University e dal Douglas Hospital Animal Care Committee (numero di approvazione per esperimenti sugli animali: 2005-5084). Tutti i topi sono stati alloggiati in una stanza di colonia a temperatura e umidità controllate (21-22 °C; 60%) e su un ciclo luce-buio di 12 ore (luce accesa alle 8:00) presso il Neurophenotyping Centre del Douglas Mental Health University Institute. I topi hanno avuto accesso ad libitum a cibo e acqua durante gli esperimenti. I topi sono stati assegnati in modo casuale a ciascuna condizione sperimentale. Gli animali da esperimento sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). La tabella 2 riassume le caratteristiche dell'animale per ogni fase sperimentale. In totale, 489 topi adolescenti C57BL/6J (259 maschi; 230 femmine) sono stati utilizzati in 20 coorti sperimentali.

Tabella 2: Soggetti animali per ogni fase sperimentale. †Se questi animali non sono gravemente feriti, possono essere riutilizzati per l'adescamento. ‡Se questi animali non sono gravemente feriti, possono essere riutilizzati per l'adescamento durante l'AcSD, §Centro di neurofenotipizzazione del Douglas Mental Health University Institute. Per gli esperimenti con i maschi, #Per gli esperimenti con le femmine, se la sconfitta è mista, usa le femmine per l'adescamento. ††Da non utilizzare per AcSD. Abbreviazioni: AcSD = stress da sconfitta sociale accelerata; PND = Giorno postnatale Clicca qui per scaricare questa tabella.

1. Acclimatazione

NOTA: Questa fase dovrebbe durare almeno 1 settimana.

  1. Acquista topi riproduttori maschi CD-1 in pensione (vedi Tabella dei materiali) di età superiore a 4 mesi e il doppio della quantità dei topi adolescenti C57BL/6J (cioè, se 10 topi saranno esposti allo stress, acquista 20 topi CD-1).
    NOTA: Si raccomanda l'acquisizione di questa quantità di topi CD-1 perché solo una piccola percentuale di topi CD-1 mostra un comportamento aggressivo nei confronti dei topi adolescenti.
  2. Lascia che i topi maschi CD-1 si abituino alla nuova struttura nella loro gabbia domestica con cibo e acqua ad libitum per 1 settimana prima dello screening e dell'adescamento.
  3. Utilizzare C57BL/6 a PND >65 (adulti) e PND 25 ± 3 (adolescenti) (Tabella 2) per le sessioni di screening e priming. Acquisire 4 topi C57BL/6 di ogni età al giorno di adescamento (cioè, per 3 giorni di adescamento, acquisire 12 PND >65 e 12 PND 25 ± 3) per ridurre il rischio di lesioni perché questi animali verranno impiegati ripetutamente per il processo di screening e adescamento.

2. Screening e primering CD-1

NOTA: La durata di questa fase è di 3 giorni di screening (1 giorno per i topi femmine) e 3-4 giorni di priming (questo può aumentare per i topi femmine e, a seconda del comportamento aggressivo dei topi CD-1).

  1. Utilizzare la definizione operativa di attacco per registrare gli attacchi del CD-1 come descritto di seguito.
    1. Un attacco è definito come quando il topo CD-1 morde il topo C57BL/6J e il topo C57BL/6J si allontana in risposta al morso. Un morso è definito come quando il topo CD-1 posiziona i denti su qualsiasi parte del corpo del topo C57BL/6J. L'allontanamento è definito come quando il mouse C57BL/6J sposta entrambe le zampe posteriori dalla posizione in cui si trovavano prima che il CD-1 lo attivasse.
    2. Assicurarsi che ci sia una differenza di almeno ~2 s tra attacchi separati. Se si verifica più di un morso a <2 s di distanza, conta come un attacco.
    3. Se il topo CD-1 morde più di una volta di seguito senza interruzione (<~2 s di distanza), separare delicatamente gli animali con un righello di plastica. Se il topo CD-1 morde e non lo lascia andare, separare delicatamente gli animali. Se il mouse C57BL/6J rimane intrappolato in un angolo o viene bloccato dal mouse CD-1 e non può allontanarsi in risposta a un morso, separare delicatamente gli animali con un righello. Conta tutti questi come un unico attacco (fino alla separazione).
  2. Vagliatura
    1. Utilizzare guanti da esplorazione in nitrile per tutte le manipolazioni degli animali ed evitare l'uso di profumi o fragranze.
    2. Eseguire il 1° giorno dello screening solo con topi maschi adulti C57BL/6 come intrusi (PND >65) nella gabbia domestica dei topi CD-1. Esamina sempre i topi CD-1 prima di un nuovo esperimento.
    3. Introdurre un topo maschio adulto C57BL/6 PND >65 nella gabbia domestica di un topo maschio CD-1 per 3 minuti. Registrare la latenza alla prima aggressione e il numero di aggressioni eseguite (vedere la Tabella supplementare 1).
    4. Dal 2° all'ultimo giorno di screening, introdurre un maschio adulto di C57BL/6 PND>65 per 1 minuto (limite a 30 secondi se il CD-1 è molto aggressivo) e poi sostituirlo con un adolescente C57BL/6 PND 25 ± 3 per 5 minuti.
      NOTA: È importante eseguire lo screening con topi adolescenti perché non tutti i topi che attaccano il topo maschio adulto C57BL/6 attaccheranno l'adolescente C57BL/6. Infatti, i topi CD-1 che attaccano i topi adolescenti non sempre attaccano i maschi adulti C57BL/6.
    5. Se l'esperimento è per l'aggressività nei confronti di topi femmine, eseguire lo screening e il priming con topi femmine adolescenti, anche se i topi sperimentali includono entrambi i sessi.
    6. Registrare la latenza alla prima aggressione, il numero di attacchi e le ferite ricevute da tutti i topi C57BL/6 (vedi Tabella supplementare 2).
    7. Registra qualsiasi tipo di interazione: inseguimento, comportamenti di montaggio, annusare, pettinare o mordere. Registrare se il CD-1 non si avvicina ai topi C57BL/6 adolescenti; se questo comportamento si ripete per 2 giorni, non includere il CD-1 nel priming.
    8. Per la fase di adescamento, selezionare tutti i mouse CD-1 che mostrano comportamenti come inseguire, montare comportamenti, annusare, seguire, adescare o mordere l'adolescente C57BL/6.
    9. Conserva i topi CD-1 non selezionati e usali per il test di interazione sociale (SIT).
      NOTA: Il comportamento territoriale aumenta con il tempo; pertanto, i topi CD-1 non selezionati possono diventare aggressivi nei confronti dei topi adolescenti nell'esperimento successivo.
  3. Comportamento aggressivo del CD-1 di adescamento
    1. Ospita i topi CD-1 selezionati per l'adescamento nella loro gabbia domestica fino all'ultimo giorno di adescamento.
    2. Introdurre un topo maschio adulto C57BL/6J PND >65 per 30 s nella gabbia domestica CD-1 e poi sostituirlo con un topo adolescente C57BL/6 PND 25 ± 3 per 5 minuti.
    3. Registra la latenza alla prima aggressione, il numero di attacchi e qualsiasi interazione (vedi Tabella supplementare 3).
    4. Eseguire l'adescamento 2 volte al giorno per 3-4 giorni nello stesso momento in cui sono programmate le sconfitte (9:00 e 14:00).
      NOTA: Non tutti i topi CD-1 attaccheranno i topi adolescenti durante i primi giorni, specialmente se l'innesco è verso topi femmine. Il numero di giorni per l'adescamento può aumentare o diminuire a seconda del comportamento aggressivo mostrato dai topi CD-1.
    5. Per ridurre il numero di giorni di adescamento, riutilizzare i topi CD-1 che hanno subito un precedente esperimento di sconfitta sociale con topi maschi. Se i topi CD-1 non mostrano una maggiore aggressività, prolungare i giorni per l'adescamento fino a raggiungere i criteri.
    6. Diminuire i giorni per l'adescamento se i topi CD-1 mostrano un comportamento estremamente aggressivo (i topi C57BL/6 mostrano ferite eccessive) per prevenire gravi lesioni durante la sconfitta sociale.
    7. Per la fase successiva dell'esperimento, selezionare i topi CD-1 che attaccano i topi adolescenti almeno 10 volte (maschi) o 5 volte (femmine) per 2 giorni consecutivi.

3. Protocollo AcSD

NOTA: Questa fase consiste in 3 giorni di assuefazione e 4 giorni di esposizione all'AcSD.

  1. Assuefazione
    1. Impostare le gabbie per topi per la sconfitta sociale (Figura 1A-F). Dividere le gabbie per ratti in 2 scomparti utilizzando appositi divisori in vetro acrilico (Figura 1B, D; vedi Tabella dei materiali).
    2. Aggiungere una lettiera di trucioli di legno duro su entrambi i lati della gabbia, aggiungere un quadrato di cotone per lato come materiale di lettiera (Figura 1D). Assicurarsi che la parte superiore del filo sia fissata con clip per legante (Figura 1E). Assicurarsi che la gabbia per topi sia coperta con il coperchio senza il cotone protettivo (Figura 1F).
    3. Posiziona un topo CD-1 per gabbia su un lato della gabbia. Posiziona un'etichetta all'esterno della gabbia per una facile identificazione di ogni topo.
    4. Ospitare i topi CD-1 selezionati nell'apparato di sconfitta sociale (Figura 1F) 2 o 3 giorni prima dell'inizio del protocollo AcSD (per migliorare il comportamento territoriale del CD-1).
    5. Eseguire una sessione di priming 1 giorno prima dell'esperimento; Questo è importante per mantenere l'aggressività coerente.
  2. Sconfiggi le sessioni
    1. Esegui 2 sessioni al giorno (prima sessione: 9 del mattino, seconda sessione: 2 PM) per 4 giorni, 8 sessioni in totale. Fai un programma per assicurarti che l'aggressore sia diverso per ogni sessione (vedi Tabella supplementare 4 e Tabella supplementare 5).
    2. Pesare il mouse adolescente C57BL/6 prima di introdurlo sul lato CD-1 della gabbia. Introduci un topo maschio adulto C57BL/6 >65 per 30 s nel lato CD-1 della gabbia di sconfitta e poi sostituiscilo con un topo adolescente C57BL/6 PND 24-28 per un episodio di sconfitta lungo 10 minuti o un massimo di 10 attacchi per sessione.
    3. Separa gli animali dopo ogni attacco con un righello di plastica. Dopo ogni sessione di sconfitta, controlla la presenza di lesioni e trattale con una crema antidolorifica. Registra il numero di infortuni.
    4. Posiziona il mouse adolescente C57BL/6J nello scomparto libero accanto a un aggressore sconosciuto fino alla sessione successiva. Ripetere la procedura con un aggressore diverso ogni sessione.
    5. Inizia la sessione con i topi sperimentali e aggressori che non sono stati accoppiati nella sessione precedente. Monitorare le lesioni dei topi maschi adulti C57BL/6J utilizzati per l'adescamento (vedere la Tabella supplementare 6).
  3. Seguire le raccomandazioni riportate di seguito per il benessere degli animali e gli endpoint umani.
    1. Seguire la procedura operativa standard del comitato di revisione istituzionale corrispondente per le sconfitte sociali e garantire una valutazione veterinaria costante.
    2. Monitora la salute dei topi durante lo studio per evitare la sofferenza e la morte degli animali.
    3. Verificare che il divisorio perforato sia impostato correttamente per evitare che i topi attraversino l'altro scomparto.
    4. Avvisare il personale veterinario quando un animale ha una ferita per un monitoraggio appropriato e applicare quotidianamente una crema antidolorifica fino a quando la ferita non è completamente guarita.
    5. Se un infortunio peggiora (le ferite aumentano di dimensioni), limitare gli attacchi a 5 nella sessione successiva consentendo il recupero. Verificare la presenza di lesioni gravi. Le lesioni gravi sono definite come ferite per un totale > 1 cm.
    6. Rimuovere immediatamente e sopprimere gli animali che presentano una riduzione del 15%-20% del loro peso rispetto al peso corporeo iniziale; ridotta/diminuita attività locomotoria e alterata toelettatura; topi con ferite > 1 cm; pene reciso o segni di morsi con gonfiore degli arti anteriori.
      NOTA: L'eutanasia primaria viene condotta tramite camere a gas isoflurano/CO2, seguita dall'eutanasia secondaria eseguita mediante lussazione cervicale.
  4. Controllare i mouse
    1. Esegui 2 sessioni al giorno (prima sessione: 9 del mattino, seconda sessione: 2 PM) per 4 giorni, 8 sessioni in totale. Stabilire un programma per assicurarsi che i topi di controllo condividano la gabbia con un diverso conspecifico C57BL/6J ad ogni sessione (vedere la Tabella supplementare 7 e la Tabella supplementare 8).
      NOTA: I topi di controllo non sono esposti ad un aggressore. Per imitare l'introduzione di un nuovo topo CD-1 ad ogni sessione di sconfitta, i topi di controllo vengono accoppiati con un nuovo conspecifico dello stesso sesso e della stessa età (non cucciolata) ad ogni sessione.
    2. Alloggiare i topi di controllo nell'apparato di sconfitta sociale (Figura 1) in una stanza separata da quella dei topi AcSD.
    3. Posiziona due topi di controllo per gabbia, uno su ciascun lato della gabbia. Ospita i topi in un lato diverso della gabbia o in una gabbia completamente diversa, in modo che non riconoscano l'odore. Ruota i mouse di controllo a ogni sessione.

Figure 1
Figura 1: Apparecchio per lo stress da sconfitta sociale accelerata (AcSD) per topi adolescenti. (A) Da sinistra a destra, sommità accoppiate in filo d'acciaio con 0,6 cm di separazione tra le barre, divisorio in policarbonato perforato trasparente con diametro di perforazione di 0,6 cm, clip per legare per fissare le parti superiori in filo, gabbia per topi trasparente con coperchio di copertura (senza strato protettivo in cotone). (B) Up: confronto tra i divisori in policarbonato per la sconfitta sociale cronica negli adulti (a sinistra) e l'AcSD negli adolescenti (a destra); Giù: vicino al divisorio in policarbonato per topi adolescenti. (C) In alto: confronto tra le cime di filo d'acciaio per la sconfitta sociale cronica negli adulti (a sinistra) e l'AcSD negli adolescenti (a destra); Giù: primo piano delle cime in filo d'acciaio. (D-F) Assemblaggio dell'apparato di sconfitta sociale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Test di interazione sociale

  1. Eseguire il SIT seguendo l'AcSD come descritto in precedenza 57,58,59.
    1. Eseguire il SIT 24 ore dopo l'ultima sessione di AcSD. Eseguire il SIT in condizioni di luce rossa (non in condizioni di luce gialla) tra le 9 e le 16.
    2. Allestisci l'arena quadrata principale e la videocamera dall'alto (vedi Tabella dei materiali). L'arena principale è divisa in 3 aree: la zona di interazione sociale (SIZ), gli angoli e il centro; Queste aree dovrebbero essere contrassegnate nell'arena con una linea nera (usa un pennarello indelebile nero). Per ogni area, utilizzate le dimensioni e i criteri riportati di seguito.
      1. Assicurarsi che il SIZ sia l'area quadrata di 14 cm x 9 cm che circonda l'involucro. Gli angoli sono piccole aree quadrate (9 cm x 9 cm) negli angoli del muro opposto al recinto e rappresentano il punto più lontano dalla SIZ. Il centro è l'area tra la SIZ e gli angoli.
    3. Pulire l'arena e le recinzioni con una soluzione detergente di perossidasi di idrogeno.
    4. Posizionare le targhette di identificazione per ogni animale sul pavimento per l'analisi. Registra tutto il comportamento degli animali per l'analisi offline.
  2. Prima sessione per determinare l'esplorazione di base
    1. Posiziona una recinzione di rete metallica vuota contro una delle pareti dell'arena. Posiziona il mouse sperimentale (sconfitto o di controllo) adolescente C57BL/6 al centro dell'arena. Lasciargli esplorare liberamente l'arena per 2,5 minuti. Recupera il mouse.
    2. Pulire l'arena e le recinzioni con una soluzione detergente di perossidasi di idrogeno.
  3. Seconda sessione per l'interazione sociale
    1. Posizionare un mouse CD-1 sconosciuto all'interno dell'involucro della rete metallica. Posizionare l'involucro nella stessa posizione della sessione precedente.
    2. Reintroduci lo stesso mouse C57BL/6 adolescente nell'arena. Lasciargli esplorare liberamente l'arena per 2,5 minuti. Recupera i topi.
    3. Pulire l'arena e le recinzioni con una soluzione detergente di perossidasi di idrogeno.
    4. Ripetere il processo per tutti i topi C57BL/6 adolescenti (topi stressati e di controllo) in un ordine controbilanciato.
    5. Utilizzare più di un mouse CD-1 per il SIT per ridurre lo stress da manipolazione e i bias (ad esempio, per una coorte di 30 topi C57BL/6, utilizzare 4 topi CD-1). Controbilanciali tra i topi adolescenti.
      NOTA: Questo test misura l'approccio e/o il comportamento di evitamento dei topi sperimentali verso un bersaglio sociale, come descritto per la prima volta da Krishnan5 e Golden7.
  4. Analisi
    1. Registra il tempo o i tempi trascorsi nella zona di interazione e negli angoli durante entrambe le sessioni del test.
    2. Calcola il rapporto di interazione sociale come il tempo trascorso nella zona di interazione con l'aggressore CD-1 presente diviso per il tempo trascorso nella zona di interazione con l'aggressore CD-1 assente.
    3. Classificare i topi stressati con un rapporto < 1,00 come suscettibili e un rapporto ≥ 1,00 come resilienti.
    4. Escludere gli animali che non esplorano l'arena durante la prima sessione (cioè che hanno trascorso 0 s in una qualsiasi delle aree designate) da tutte le analisi per controllare le differenze nell'attività locomotoria.
    5. Escludere da tutte le analisi tutti gli animali che ricevono 0 attacchi in sessioni di sconfitta sociale ≥4 per prevenire animali resilienti non rappresentativi.
    6. Escludere i topi (non sensibili) che non trascorrono almeno 61 s all'interno della zona di interazione per garantire che alti rapporti di interazione sociale riflettano l'effettivo interesse per il target sociale.
    7. Escludere i topi con punteggi del rapporto di interazione anomali.

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Representative Results

Un totale di quattro diversi esperimenti sono stati eseguiti utilizzando il modello di stress da sconfitta sociale cronica in topi maschi adolescenti C57BL/6 (PND 21). Tuttavia, questo modello presentava importanti limitazioni per il suo utilizzo nei topi C57BL/6 della prima adolescenza.

Modifiche all'attrezzatura necessarie per i topi C57BL/6 adolescenti
La prima limitazione era che l'attrezzatura utilizzata per l'apparato di lotta sociale era stata progettata per topi adulti. A causa delle loro dimensioni, i topi adolescenti C57BL/6 a PND 21 sono stati in grado di passare attraverso le perforazioni dei divisori sul lato dell'aggressore. Questo interrompeva il periodo di contatto sensoriale. Inoltre, i topi adolescenti sono stati in grado di fuggire attraverso le sbarre delle cime in filo d'acciaio. Pertanto, l'attrezzatura è stata modificata per impedire la fuga dei topi (Figura 1). Il diametro delle perforazioni è stato modificato da 1,1 cm a 0,6 cm (Figura 1B) e la parte superiore in filo d'acciaio è stata sostituita da una con una separazione di 1,1 cm tra le barre a una con una separazione di 0,6 cm (Figura 1C). Inoltre, la parte superiore è stata fissata con clip e anche le gabbie per topi sono state coperte con coperture di plastica senza cotone protettivo. Anche la lettiera del cippato è stata impostata a un livello appropriato per i topi adolescenti (Figura 1D-F).

Il modello AcSD richiede l'adescamento di topi CD-1 maschi adulti per garantire attacchi coerenti e aggressivi
La seconda e più importante limitazione era la mancanza di coerenza nell'aggressività fisica dei topi CD-1 nei confronti dei topi adolescenti. Durante le sessioni di sconfitta sociale cronica, l'aggressività variava da zero attacchi aggressivi durante la sessione di 10 minuti a uno o due morsi che erano fatali a causa delle piccole dimensioni dei topi adolescenti. Tuttavia, se i topi CD-1 sono stati utilizzati per più di un esperimento, la coerenza nel numero di attacchi è aumentata.

La Figura 2B mostra il numero di attacchi giornalieri per ogni coorte sperimentale di sconfitta sociale cronica (P0, A0, A1 e A2). È stata trovata un'interazione tra il giorno e la coorte (Figura 2B, misure ripetute a due vie ANOVA: F(27, 234) = 3,83, p < 0,0001), l'effetto principale del giorno (F(6,288, 163,5) = 6,2, p < 0,0001) e l'effetto principale della coorte (F(3, 26) = 3,8, p = 0,02). Il test post hoc ha rivelato differenze tra le coorti nei giorni 1, 2, 3 e 7 (test post hoc di Holm-Sidak: giorno 1, P0 vs. A2, p = 0,02; A1 contro A2, p = 0,02; giorno 2, A1 vs. A2, p = 0,04; giorno, 3 A0 contro A1, p = 0,007; A1 contro A2, p = 0,04; giorno 7, A0 vs. A1, p = 0,04). Tutti i topi CD-1 negli esperimenti P0 e A0 hanno smesso di attaccare negli ultimi 3 giorni. I topi CD-1 che sono stati utilizzati per gli esperimenti P0 e A0 sono stati utilizzati in A1, in cui c'era una coerenza negli attacchi (Figura 2B), indicando che i CD-1 erano più inclini all'aggressione se sottoposti a interazioni fisiche in precedenza.

Per questo motivo, come descritto nei passaggi 2.1 e 2.2, i topi CD-1 sono stati sottoposti a screening specifico per la loro aggressività nei confronti dei topi adolescenti e innescati con un maschio adulto C57BL/6 per l'aggressività nei confronti dei topi adolescenti C57BL/6. Inoltre, l'AcSD è stato utilizzato per aumentare l'età da PND 21 a PND 25 e per mirare ancora alla prima adolescenza.

Durante le sessioni di AcSD, i topi CD-1 hanno aumentato il numero di attacchi verso i topi adolescenti in un modello più coerente, come mostrato nella Figura 2D. In contrasto con il paradigma della sconfitta sociale cronica, non è stata trovata alcuna interazione significativa tra la sessione e la coorte sperimentale (Figura 2D, misure ripetute a due vie ANOVA: F(35, 483) = 1,33, p = 0,1), c'era un effetto principale della sessione (F(5,644, 389,5) = 14,15, p < 0,0001) e un effetto principale della coorte (F(5, 69) = 7,91, p < 0,0001); Il test post hoc di Holm-Sidak non ha rivelato differenze significative tra le coorti. Un confronto delle medie degli attacchi tra le coorti ha rivelato che questo effetto è stato principalmente guidato dalla coorte A7, che ha avuto un numero significativamente più elevato di attacchi (dati non mostrati, ANOVA a una via F(5, 69) = 7,911, p < 0,0001; Test post hoc di Holm-Sidak: A3 vs. A6, p = 0,04; A7 contro A5, p = 0,002; A7 contro A6, p < 0,0001; A7 contro A8, p = 0,0001).

I topi adolescenti hanno ricevuto più attacchi con topi CD-1 innescati durante l'AcSD rispetto ai topi adolescenti esposti a un protocollo di sconfitta sociale cronica (Figura 2E, t-test non accoppiato con correzione di Welch, t = 15,40, df = 17,87, p < 0,0001) utilizzando topi CD-1 naïve (non innescati). Gli attacchi non sono stati coerenti durante il protocollo di sconfitta sociale cronica e, infatti, diversi topi sperimentali non sono stati attaccati affatto.

Figure 2
Figura 2: Confronto del numero di attacchi al giorno tra stress da sconfitta sociale cronica e AcSD. (A) Cronologia del modello di stress da sconfitta sociale cronica. (B) Numero di attacchi al giorno per ciascuna coorte sperimentale (P0, P1, A1 e A2) durante lo stress cronico da sconfitta sociale in topi maschi adolescenti C57BL/6 (misure ripetute a due vie ANOVA). (C) Cronologia del modello di stress da sconfitta sociale accelerata (AcSD). (D) Numero di attacchi al giorno per ogni coorte sperimentale (A3-A8) durante AcSD in topi maschi adolescenti C57BL/6 (ANOVA con misure ripetute a due vie). (E) Il numero medio di attacchi è stato significativamente più alto per l'AcSD (test t non accoppiato con la correzione di Welch, ****p < 0,0001). Tutti i dati sono indicati come media ± SEM. Abbreviazioni: CSDS = stress da sconfitta sociale cronica; SIT = test di interazione sociale; PND = giorno postnatale; P0, A0-A8 = etichette per ogni coorte sperimentale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il modello di attacchi durante le sessioni di AcSD non influisce sul fenotipo sociale 24 ore dopo
Dopo l'esposizione allo stress da sconfitta sociale, la maggior parte dei topi maschi adolescenti non ha mostrato evitamento sociale quando testati nel SIT (Figura 3B, sconfitta sociale cronica: ANOVA unidirezionale F(2, 43) = 14,57, p < 0,0001. F, AcSD: test di Kruskal-Wallis, H(2) = 72,35, p < 0,0001). Per entrambi i modelli, non ci sono state differenze significative nel numero di attacchi tra topi sconfitti social-evitanti e non social-evitanti (Figura 3D, sconfitta sociale cronica: misure ripetute a due vie ANOVA, F(9, 252) = 4,07, p = 0,21. H. AcSD: misure ripetute a due vie ANOVA, F(7, 511) = 1,32, p = 0,24). Tuttavia, la percentuale di topi resilienti era più alta dopo una sconfitta sociale cronica rispetto a quella dopo l'esposizione ad AcSD (Figura 3C, G, 70 % vs 55,26 %, test binomiale (a una coda), p = 0,0047).

Figure 3
Figura 3: Confronto tra i punteggi dei test di interazione sociale (SIT) a seguito dello stress da sconfitta sociale cronica e dei paradigmi AcSD. (A) Cronologia del modello di stress da sconfitta sociale cronica. (B) Distribuzione del punteggio SIT dopo stress da sconfitta sociale cronica in adolescenza (ANOVA a senso unico). (C) Proporzione di resilienti/suscettibili dopo stress da sconfitta sociale cronica nell'adolescenza. (D) Numero di attacchi per fenotipo ricevuti durante lo stress cronico da sconfitta sociale, non sono state riscontrate differenze significative tra resiliente e suscettibile (misure ripetute a due vie ANOVA). (E) Cronologia del modello di stress da sconfitta sociale accelerata (AcSD). (F) Distribuzione del punteggio SIT dopo AcSD nell'adolescenza (Kruskal-Wallis). Questa cifra è stata modificata da57. (G) La percentuale di resilienti/suscettibili dopo AcSD nell'adolescenza. Questa cifra è stata modificata da57. (H) Numero di attacchi per fenotipo ricevuti durante l'AcSD; non c'è differenza tra resiliente e suscettibile (misure ripetute a due vie ANOVA). Questa cifra è stata modificata da59. **p < 0,001, ****p < 0,0001. Tutti i dati sono indicati come media ± SEM. Abbreviazioni: PND = giorno postnatale; Contro = controlli; Res = resiliente; Sus = suscettibile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

AcSD può essere utilizzato in topi femmina C57BL/6 adolescenti
Poiché i topi maschi e femmine PND 25 C57BL/6 non hanno raggiunto la maturità riproduttiva, i topi CD-1 innescati potrebbero presentare attacchi aggressivi nei confronti dei topi femmine adolescenti come hanno fatto nei confronti dei topi maschi adolescenti. Tuttavia, la fase di priming doveva essere estesa per raggiungere un numero consistente di attacchi (Figura 4A). Come mostrato nella Figura 4B, non è stata riscontrata alcuna interazione tra il giorno e la coorte tra gli esperimenti (Figura 4B, misure ripetute a due vie ANOVA: F(35.707) = 1.38, p = 0.07), c'è stato un effetto principale della sessione (F(6.286, 634.9) = 16.1, p < 0.0001) e un effetto principale della coorte (F(5, 101) = 11.34, p < 0.0001; Test post hoc di Holm-Sidak: sessione 2 C4 vs C8, p = 0,03; sessione 6 C7 vs C4, p = 0,02; C7 contro C5, p = 0,02; sessione 7 C8 vs C3, p = 0,02; C8 vs C4, p = 0,045). La maggior parte dei topi femmina adolescenti C57BL/6 esposti ad AcSD erano resistenti all'evitamento sociale (Figura 4C, ANOVA di Brown-Forsythe: F(2.113,4) = 27,2, p < 0,0001), simile ai topi maschi adolescenti. Non è stata riscontrata alcuna differenza significativa nel numero di attacchi tra topi resilienti e suscettibili (Figura 4E, misure ripetute a due vie ANOVA, interazione fenotipo sessione x: F(7, 714) = 0,73, p = 0,64, effetto principale della sessione F(6,375, 650,3) = 7,02, p < 0,0001, nessun effetto principale del fenotipo F(1, 102) = 0,4, p = 0,53).

Figure 4
Figura 4: AcSD in topi femmine adolescenti. (A) Cronologia dell'esperimento. (B) Numero di attacchi al giorno per esperimento durante AcSD (misure ripetute a due vie ANOVA). (C) Distribuzione del punteggio SIT dopo AcSD durante l'adolescenza in topi femmina (ANOVA di Brown-Forsythe). (D) Proporzione di resilienti/suscettibili dopo AcSD nell'adolescenza (a destra). (E) Numero di attacchi per fenotipo ricevuti durante l'AcSD; non sono state riscontrate differenze significative tra topi resilienti e suscettibili (misure ripetute a due vie ANOVA). Tutti i dati sono mostrati come media ± SEM. (C-E) Queste cifre sono state modificate da59. Abbreviazioni: SIT = test di interazione sociale; PND = giorno postnatale; C3-C8 = etichette per ogni coorte sperimentale; Contro = controlli; Res = resiliente; Sus = suscettibile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare 1: Modello di scheda di punteggio per il giorno 1 di screening con gli adulti. Abbreviazioni: CD-1 = ID dei topi CD-1 sottoposti a screening, Exp = ID dell'esperimento, 3 min = Durata della sessione di screening per i topi adulti C57BL/6, BL6 ID = ID dei topi adulti C57BL/6 utilizzati per lo screening, Lat 1 ADULTS = Latenza del primo attacco dal CD-1 verso il topo adulto C57BL/6, # aggressioni = Numero di attacchi eseguiti dal CD-1. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 2: Modello di scheda di punteggio per lo screening con adulti e adolescenti. Abbreviazioni: Exp = ID esperimento, 1 min = Durata della sessione di screening per i topi adulti C57BL/6, BL6 ID = ID dei topi adulti C57BL/6 utilizzati per lo screening, Lat 1 ADULTI = Latenza del primo attacco dal CD-1 verso il topo adulto C57BL/6, # aggressioni = Numero di attacchi eseguiti dal CD-1, 5 min = Durata della sessione di screening per i topi adolescenti C57BL/6, BL6 Ad = ID dei topi adolescenti C57BL/6 utilizzati per lo screening, Lat 1 Adolescents = Latenza del primo attacco dal CD-1 verso il topo adolescente C57BL/6, CD-1 = ID dei topi CD-1 sottoposti a screening. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 3: Modello di scheda di punteggio per la fase di priming. Abbreviazioni: CD-1 = ID dei topi CD-1 utilizzati per il priming, Exp = ID dell'esperimento, 30 sec = Durata della sessione di priming per i topi adulti C57BL/6, BL6 ID = ID dei topi adulti C57BL/6 utilizzati per il priming, Lat 1 ADULTI = Latenza del primo attacco dal CD-1 verso il topo adulto C57BL/6, # aggressioni = Numero di attacchi eseguiti dal CD-1, Min: 3 = Durata della sessione di priming per i topi adolescenti C57BL/6, BL6 Ad = ID dei topi adolescenti C57BL/6 utilizzati per il priming, Lat 1 Adolescenti = Latenza del primo attacco dal CD-1 verso il topo adolescente C57BL/6, # montaggi = Numero di montaggi ricevuti dai topi adolescenti C57BL/6. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 4: Modello di foglio di punteggio per la programmazione delle sconfitte sociali (20 topi adolescenti). Abbreviazioni: CD1 = ID dei topi CD-1, E = Esperimento, H = Umidità, 1 st = Sessione 1, 2nd = Sessione 2, BL6 adulto = ID dei topi adulti C57BL/6 utilizzati per l'adescamento, Peso = Peso dei topi adolescenti C57BL/6, # attacchi = Numero di attacchi eseguiti dal CD-1, # ferite = Numero di ferite ricevute dai topi adolescenti C57BL/6. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 5: Esempio di programmazione della sconfitta sociale. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 6: Modello per il monitoraggio delle lesioni di topi maschi adulti C57BL/6. Abbreviazioni: 1st - # ferite = Numero di ferite ricevute dal topo adulto C57BL/6 nella sessione 1, 2nd - # ferite = Numero di ferite ricevute dal topo adulto C57BL/6 nella sessione 2, BL6 = ID dei topi adulti C57BL/6 utilizzati per l'adescamento. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 7: Modello di programmazione del gruppo di controllo (10 topi adolescenti). Regole per lo scrambling: Non ripetere lo stesso conspecifico; un mouse non può ripetere lo stesso lato della scatola nello stesso giorno; i topi devono essere mescolati con topi provenienti da gabbie diverse da quella di casa; le gabbie domestiche sono numerate; I numeri dei topi sono dati a seconda del numero della gabbia domestica; I gruppi sconfitti e di controllo vengono presi casualmente dalla gabbia di casa. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 8: Esempio di programmazione del gruppo di controllo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

Comportamento coerente e aggressivo nei topi CD-1
Durante la fase di screening, è molto importante prendere nota di tutti i comportamenti mostrati dal CD-1 (inseguimento, comportamenti di montaggio, annusare, toelettare o mordere) e seguire attentamente questi record quando si selezionano i topi CD-1 per l'AcSD. È probabile che un topo CD-1 che interagisce con il topo adolescente senza attaccarlo svilupperà aggressività nei confronti dei topi adolescenti durante l'adescamento. Al contrario, un topo CD-1 che attacca un topo adulto ma non si avvicina a un topo adolescente probabilmente non svilupperà aggressività nei confronti dei topi adolescenti.

La fase di priming del CD-1 permette di sviluppare un comportamento aggressivo nei confronti dei topi adolescenti. Pertanto, avere un registro accurato dei comportamenti è fondamentale per la selezione dei topi. Inoltre, è essenziale esaminare sempre i topi CD-1 prima di un nuovo esperimento, anche quando un topo CD-1 è già stato sconfitto in precedenza. Alcuni topi CD-1 possono smettere di attaccare i topi adolescenti se lasciati indisturbati nelle loro gabbie domestiche per un periodo di tempo, altri possono sviluppare un aumento del comportamento territoriale perché sono alloggiati in isolamento.

Per il priming dei topi CD-1, il protocollo raccomanda 3 giorni. Se vengono impiegati topi CD-1 naïve, l'innesco può essere esteso se i topi CD-1 non attaccano attivamente i topi adolescenti. Per i topi CD-1 che hanno subito una sconfitta sociale con topi adolescenti, la durata di questa fase di priming può essere ridotta.

Le fasi di screening e priming sono fondamentali per il successo delle sessioni AcSD. Ad esempio, i topi CD-1 che sono stati opportunamente innescati attaccheranno e raggiungeranno il limite di 10 attacchi più velocemente di un topo CD-1 meno aggressivo, consentendo brevi episodi di sconfitta.

Durante l'AcSD, è fondamentale separare gli animali quando gli attacchi sono molto violenti (ad esempio, il topo CD-1 non lascia andare il topo C57BL/6J); In caso contrario, i topi adolescenti saranno feriti e gli attacchi devono essere limitati. Anche il trattamento delle lesioni è molto importante per evitare infezioni; Si raccomanda di non utilizzare unguenti oleosi per il trattamento delle ferite perché gli animali leccheranno via l'unguento, perdendo i capelli nel processo ed esponendo la lesione.

Risoluzione dei problemi AcSD da utilizzare per i mouse maschi e femmine C57BL/6 adolescenti
Il modello di stress cronico da sconfitta sociale presentava importanti limitazioni per il suo utilizzo nella prima adolescenza sia nei topi maschi che nelle femmine di topi C57BL/6. In questa sezione vengono descritte le modifiche che sono state apportate per lo sviluppo del modello AcSD nell'adolescenza.

Attrezzatura: L'elenco completo delle attrezzature è riportato nella Tabella dei materiali. I topi adolescenti C57BL/6 nella prima adolescenza (PND 21-30) erano troppo piccoli per l'attrezzatura descritta precedentemente utilizzata nel laboratorio60. Il diametro delle perforazioni sui divisori in vetro acrilico è abbastanza grande da consentire ai topi C57BL/6 di passare da un compartimento all'altro, dove risiede l'aggressore. Per evitare ciò, sono stati realizzati divisori in vetro acrilico con perforazioni di piccolo diametro. Inoltre, la parte superiore in filo d'acciaio doveva essere fissata con clip per evitare che i topi fuggissero dalle gabbie. I coperchi di copertura utilizzati sono tipicamente utilizzati per le gabbie ventilate. In questo caso, questi coperchi sono stati utilizzati senza il cotone protettivo per consentire una corretta ventilazione e per evitare che i topi fuoriuscissero dalla gabbia. È importante considerare che la quantità di lettiera di trucioli di legno utilizzata dovrebbe consentire ai topi adolescenti di raggiungere il cibo e il distributore d'acqua posto sul coperchio. Tuttavia, grandi quantità di cippato possono bagnarsi.

Selezione dei topi CD-1: Nel modello cronico, i topi CD-1 vengono sottoposti a screening per il comportamento aggressivo prima dell'inizio dell'esperimento. I topi CD-1 vengono selezionati dopo 3 giorni di screening e viene valutato il loro comportamento aggressivo. Dopo lo screening, gli animali che hanno latenze per attaccare sotto i 30 s e che mostrano attacchi costanti vengono selezionati per la fase successiva. Tuttavia, durante gli esperimenti di sconfitta sociale cronica, i topi CD-1 non hanno mantenuto un numero costante di attacchi per 10 giorni (Figura 2B). Pertanto, diversi topi CD-1 hanno dovuto essere rimossi dall'esperimento a causa della mancanza di aggressività nei confronti del topo intruso. Infatti, mentre solo una piccola percentuale dei topi CD-1 ha attaccato il topo intruso, alcuni di questi topi erano estremamente aggressivi e talvolta hanno ferito gravemente i topi maschi C57BL/6 PND 21. Pertanto, lo screening dei topi CD-1 è stato modificato per selezionare topi aggressivi verso topi adolescenti, aumentando l'aggressività fisica.

Coerenza dell'aggressione fisica: L'aggressione fisica costante porta ad ottenere una rapida e robusta sconfitta dell'intruso6. Per standardizzare le procedure tra esperimenti e sperimentatori, è stata utilizzata una definizione operativa di attacco57, che consente una precisa misurazione quantitativa dell'aggressività.

Durante gli esperimenti di sconfitta sociale cronica, il numero di attacchi variava notevolmente, diminuendo durante gli ultimi giorni dell'esperimento (Figura 2B). Per aumentare il comportamento aggressivo dei topi CD-1 nei confronti dei topi maschi adolescenti C57BL/6, i topi CD-1 sono stati preparati ad essere attivamente aggressivi indipendentemente dai topi che sono stati introdotti nella loro gabbia domestica. Questo comportamento è stato ottenuto introducendo un topo maschio adulto C57BL/6 per 1 minuto prima del topo adolescente, incoraggiando il topo CD-1 ad attaccare i topi adolescenti dopo che l'adulto è stato recuperato.

Durata del modello: i topi adolescenti C57BL/6 a PND 21 sono molto piccoli e i topi CD-1 potrebbero ferirli gravemente con un solo attacco. Pertanto, per mirare alla prima adolescenza e avere ancora ripetute sessioni di sconfitta sociale, è stato selezionato un modello alternativo al classico stress da sconfitta sociale cronica di 10 giorni. Lo stress da sconfitta sociale accelerata (AcSD)42 consiste in due sessioni di aggressione fisica al giorno, una sessione al mattino e una al pomeriggio, per un totale di 4 giorni (8 sessioni). Il modello AcSD ha permesso un aumento dell'età dei topi adolescenti da PND 21 a PND 25, mirando ancora solo alla prima adolescenza.

Limitazioni dell'AcSD nell'adolescenza
Il modello AcSD ha alcune limitazioni. Rispetto al modello di sconfitta sociale cronica negli adulti, l'AcSD richiede lo screening del doppio del numero di topi CD-1 dei topi C57BL/6 adolescenti. La durata della fase di priming può variare a seconda del comportamento aggressivo dei topi CD-1; pertanto, il programma AcSD dovrebbe essere pianificato con anticipo e tutte queste variabili devono essere considerate. Poiché la maggior parte dei topi adolescenti mostrerà resilienza contro l'evitamento sociale dopo l'esposizione all'AcSD, per ottenere un numero rappresentativo di topi suscettibili, la coorte sperimentale dovrebbe comprendere almeno 20 animali per i maschi e 30 per le femmine.

L'AcSD nei topi adolescenti produce risultati coerenti in tutte le coorti sperimentali
Dopo l'esposizione allo stress sociale con i protocolli AcSD, la maggior parte dei topi maschi adolescenti ha mostrato resilienza contro l'evitamento sociale. Tuttavia, per il modello di sconfitta sociale cronica, non è stato possibile scartare la variabilità nel numero di attacchi da parte del CD-1 come variabile confondente. Al contrario, per gli esperimenti AcSD, i topi CD-1 vengono preparati prima di ogni sessione di sconfitta per ottenere un numero costante di attacchi tra le sessioni (Figura 2D, E). Nel complesso, tutte le coorti sperimentali di topi esposti ad AcSD mostrano un numero simile di attacchi tra le sessioni (Figura 2D); tuttavia, questo non è il caso delle coorti di topi esposte al modello di sconfitta sociale cronica (Figura 2B).

L'utilizzo dello stress cronico da sconfitta sociale nei topi femmina adulti C57BL/6 è stato impegnativo rispetto ad altri che utilizzano questo modello in altre specie e ceppi 9,13,45,61. Per gli esperimenti AcSD su topi femmina C57BL/6 adolescenti, la fase di priming è stata estesa, garantendo il comportamento aggressivo dei topi CD-1 (Figura 4A). Tuttavia, si può osservare una variabilità nel numero di attacchi tra le coorti sperimentali femminili (Figura 4B). Tuttavia, in questi esperimenti, tutti i topi CD-1 hanno mostrato un comportamento aggressivo nei confronti delle femmine. Per aumentare il numero di attacchi, l'adescamento con i topi maschi può essere esteso a 1 minuto. Come nei maschi, la percentuale di topi femmine adolescenti C57BL/6 resistenti all'evitamento sociale era superiore a quella di quelli che mostravano suscettibilità (Figura 4C, D). Inoltre, il numero di attacchi non differiva tra topi resilienti e suscettibili (Figura 4E), indicando che il fenotipo è indipendente dagli attacchi. L'AcSD può essere utilizzato in topi femmina C57BL/6 adolescenti e gli esperimenti possono essere eseguiti contemporaneamente in entrambi i sessi utilizzando gli stessi topi CD-1.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dal Canadian Institutes for Health Research (CF Grant Numbers: MOP-74709; PJT 190045), l'Istituto Nazionale sull'Abuso di Droghe (numero di sovvenzione CF: R01DA037911), il Consiglio di ricerca sulle scienze naturali e l'ingegneria del Canada (numero di sovvenzione CF: 2982226). Andrea Pantoja-Urban è stato sostenuto dal Consiglio Nazionale per le Scienze Umane, le Scienze e le Tecnologie/Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCYT) dal Messico e FRQNT - Programma di borse di studio al merito per studenti stranieri (PBEEE). Samuel Richer è stato sostenuto da una borsa di studio del Programma Integrato di Neuroscienze della McGill University. Le illustrazioni delle figure sono state create utilizzando i modelli di BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 adolescent mice  In house breeding Mice were breeded at the Neurophenotyping Centre of the Douglas Mental Health University Institute.
C57BL/6 adult mice  Charles River Laboratories Strain Code: 027 Mice are ordered so as to arrive at PND>65 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
C57BL/6J adolescent mice  Jackson Labs Strain Code: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664 Mice are ordered so as to arrive at PND 24 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
CD-1 mice  Charles River Laboratories Strain Code: 022 Mice retired breeders more than three months of age and singled housed throughout.
Cleaning solution  Virox Animal Health DIN 02537222 Prevail: Accelerated Hydrogen Peroxide. Desinfectant cleaner and deodorizer.
Clear perforated acrylic glass divider  Manufactured by Douglas Hospital, custom order 0.6 cm (w) × 45.7 cm (d) × 22.23 cm (h); perforations of 0.6 cm diameter. The dividers are perforated allowing sensory but no physical contact between the pair of mice.
Clear rectangular rat cages  Allentown 24 cm (w) × 48.3 cm (d) × 22.23 (h).
Cotton squares for bedding Inotiv Envigo T.6060 iso-BLOX 2.5 cm x 2.5 cm. Added to the social defeat apparatus.
Hard woodchip bedding Inotiv Envigo Teklad 7090, 7115 Sani-chip bedding.
Large binder clips to secure the steel-wire tops STAPLES Item #: 132429, Model #: 24178-CA 51 mm
Medium binder clips to secure the steel-wire tops Item #: 132367, Model #: 24172-CA 32 mm, in case the cover lids of the rat cages do not close with the large clips
Pain relief cream Polysporin Plus Pain Relief Cream (red format, NOT ointment), 2 Antibiotics plus lidocaine hydrochloride
Paired Steel-wire tops  24 cm (w) × 48 cm (d) with 0.6 cm (w) of separation between the grill
Removable wire-mesh enclosure  Johnston industrial plastics 11 cm (w) × 6.8 cm (d) × 42 cm (h) custom order; two per social interaction test arena secured in precut clear polycarbonate
Social interaction open-field arena PEXIGLAS 45 cm (w) × 45 cm (d) × 49 cm (h), custom-crafted from opaque acrylic glass (Plexiglas) 
Stopwatch  For timing defeat sessions
Video camera with infrared lights  Swann SRDVR-44580V  Swann Camera - 4 Channel 1080p Digital Video Recorder & 2 x PRO-T853
Video tracking software  Topscan 2.0 Clever Systems Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miczek, K. A. A new test for aggression in rats without aversive stimulation: Differential effects of d-amphetamine and cocaine. Psychopharmacology. 60, 253-259 (1979).
  2. Kudryavtseva, N., Bakshtanovskaya, I., Koryakina, L. Social model of depression in mice of c57bl/6j strain. Pharmacol Biochem Behav. 38 (2), 315-320 (1991).
  3. Blanchard, R. J., Mckittrick, C. R., Blanchard, D. C. Animal models of social stress: Effects on behavior and brain neurochemical systems. Physiol Behav. 73 (3), 261-271 (2001).
  4. Berton, O., et al. Essential role of bdnf in the mesolimbic dopamine pathway in social defeat stress. Science. 311 (5762), 864-868 (2006).
  5. Krishnan, V., et al. Molecular adaptations underlying susceptibility and resistance to social defeat in brain reward regions. Cell. 131 (2), 391-404 (2007).
  6. Bartolomucci, A., Fuchs, E., Koolhaas, J. M., Ohl, F. Acute and chronic social defeat: Stress protocols and behavioral testing. Neuromethods. 42, 261-275 (2009).
  7. Golden, S. A., Covington Iii, H. E., Berton, O., Russo, S. J. A standardized protocol for repeated social defeat stress in mice. Nat Protoc. 6 (8), 1183-1191 (2011).
  8. Bourke, C. H., Neigh, G. N. Behavioral effects of chronic adolescent stress are sustained and sexually dimorphic. Horm Behav. 60 (1), 112-120 (2011).
  9. Steinman, M. Q., Trainor, B. C. Sex differences in the effects of social defeat on brain and behavior in the California mouse: Insights from a monogamous rodent. Semin Cell Dev Biol. 61, 92-98 (2017).
  10. Takahashi, A., et al. Establishment of a repeated social defeat stress model in female mice. Sci Rep. 7 (1), 12838 (2017).
  11. Wright, E. C., et al. Sexual differentiation of neural mechanisms of stress sensitivity during puberty. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (43), 2306475120 (2023).
  12. Yin, W., et al. Repeated social defeat in female mice induces anxiety-like behavior associated with enhanced myelopoiesis and increased monocyte accumulation in the brain. Brain Behav Immun. 78, 131-142 (2019).
  13. Van Doeselaar, L., et al. Chronic social defeat stress in female mice leads to sex-specific behavioral and neuroendocrine effects. Stress. 24 (2), 168-180 (2021).
  14. Hollenstein, T., Lougheed, J. P. Beyond storm and stress: Typicality, transactions, timing, and temperament to account for adolescent change. Am Psychol. 68 (6), 444 (2013).
  15. Sawyer, S. M., Azzopardi, P. S., Wickremarathne, D., Patton, G. C. The age of adolescence. Lancet Child Adolesc Health. 2 (3), 223-228 (2018).
  16. Adriani, W., Laviola, G. Windows of vulnerability to psychopathology and therapeutic strategy in the adolescent rodent model. Behav Pharmacol. 15 (5), 341-352 (2004).
  17. Reynolds, L. M., et al. Early adolescence is a critical period for the maturation of inhibitory behavior. Cereb Cortex. 29 (9), 3676-3686 (2019).
  18. Reynolds, L. M., et al. Amphetamine disrupts dopamine axon growth in adolescence by a sex-specific mechanism in mice. Nat Commun. 14 (1), 4035 (2023).
  19. Sisk, L. M., Gee, D. G. Stress and adolescence: Vulnerability and opportunity during a sensitive window of development. Curr Opin Psychol. 44, 286-292 (2022).
  20. Spear, L. P. The adolescent brain and age-related behavioral manifestations. Neurosci Biobehav Rev. 24 (4), 417-463 (2000).
  21. Reynolds, L. M., Flores, C. Mesocorticolimbic dopamine pathways across adolescence: Diversity in development. Front Neural Circuits. 15, 735625 (2021).
  22. Manitt, C., et al. The netrin receptor dcc is required in the pubertal organization of mesocortical dopamine circuitry. J Neurosci. 31 (23), 8381-8394 (2011).
  23. Reynolds, L. M., et al. Dcc receptors drive prefrontal cortex maturation by determining dopamine axon targeting in adolescence. Biol Psychiatry. 83 (2), 181-192 (2018).
  24. Kalsbeek, A., Voorn, P., Buijs, R., Pool, C., Uylings, H. Development of the dopaminergic innervation in the prefrontal cortex of the rat. J Comp Neurol. 269 (1), 58-72 (1988).
  25. Cuesta, S., et al. Dcc-related developmental effects of abused-versus therapeutic-like amphetamine doses in adolescence. Addict Biol. 25 (4), 12791 (2020).
  26. Bekhbat, M., et al. Adolescent stress sensitizes the adult neuroimmune transcriptome and leads to sex-specific microglial and behavioral phenotypes. Neuropsychopharmacology. 46 (5), 949-958 (2021).
  27. Hammerslag, L. R., Gulley, J. M. Age and sex differences in reward behavior in adolescent and adult rats. Dev Psychobiol. 56 (4), 611-621 (2014).
  28. Wheeler, A. L., et al. Adolescent cocaine exposure causes enduring macroscale changes in mouse brain structure. J Neurosci. 33 (5), 1797-1803 (2013).
  29. Schneider, M. Adolescence as a vulnerable period to alter rodent behavior. Cell Tissue Res. 354, 99-106 (2013).
  30. Makinodan, M., Rosen, K. M., Ito, S., Corfas, G. A critical period for social experience-dependent oligodendrocyte maturation and myelination. Science. 337 (6100), 1357-1360 (2012).
  31. Iñiguez, S. D., et al. Social defeat stress induces a depression-like phenotype in adolescent male c57bl/6 mice. Stress. 17 (3), 247-255 (2014).
  32. Iñiguez, S. D., et al. Social defeat stress induces depression-like behavior and alters spine morphology in the hippocampus of adolescent male c57bl/6 mice. Neurobiol Stress. 5, 54-64 (2016).
  33. Latsko, M. S., Farnbauch, L. A., Gilman, T. L., Lynch Iii, J. F., Jasnow, A. M. Corticosterone may interact with peripubertal development to shape adult resistance to social defeat. Horm Behav. 82, 38-45 (2016).
  34. Zhang, F., Yuan, S., Shao, F., Wang, W. Adolescent social defeat induced alterations in social behavior and cognitive flexibility in adult mice: Effects of developmental stage and social condition. Front Behav Neurosci. 10, 149 (2016).
  35. Xu, H., et al. Effects of adolescent social stress and antidepressant treatment on cognitive inflexibility and bdnf epigenetic modifications in the mpfc of adult mice. Psychoneuroendocrinology. 88, 92-101 (2018).
  36. Huang, G. B., et al. Effects of chronic social defeat stress on behaviour, endoplasmic reticulum proteins and choline acetyltransferase in adolescent mice. Int J Neuropsychopharmacol. 16 (7), 1635-1647 (2013).
  37. Hasegawa, S., et al. Dysfunction of serotonergic and dopaminergic neuronal systems in the antidepressant-resistant impairment of social behaviors induced by social defeat stress exposure as juveniles. Int J Neuropsychopharmacol. 21 (9), 837-846 (2018).
  38. Resende, L., et al. Social stress in adolescents induces depression and brain-region-specific modulation of the transcription factor max. Transl Psychiatry. 6 (10), e914 (2016).
  39. Mouri, A., et al. Juvenile social defeat stress exposure persistently impairs social behaviors and neurogenesis. Neuropharmacology. 133, 23-37 (2018).
  40. Rodriguez-Arias, M., et al. Social defeat in adolescent mice increases vulnerability to alcohol consumption. Addict Biol. 21 (1), 87-97 (2016).
  41. Montagud-Romero, S., et al. Repeated social defeat and the rewarding effects of cocaine in adult and adolescent mice: Dopamine transcription factors, probdnf signaling pathways, and the trkb receptor in the mesolimbic system. Psychopharmacology. 234, 2063-2075 (2017).
  42. Wilkinson, M. B., et al. A novel role of the wnt-dishevelled-gsk3β signaling cascade in the mouse nucleus accumbens in a social defeat model of depression. J Neurosci. 31 (25), 9084-9092 (2011).
  43. Hyer, M., et al. Chronic adolescent stress causes sustained impairment of cognitive flexibility and hippocampal synaptic strength in female rats. Neurobiol Stress. 14, 100303 (2021).
  44. Bekhbat, M., et al. Chronic adolescent stress sex-specifically alters central and peripheral neuro-immune reactivity in rats. Brain Behav Immun. 76, 248-257 (2019).
  45. Pyter, L. M., Kelly, S. D., Harrell, C. S., Neigh, G. N. Sex differences in the effects of adolescent stress on adult brain inflammatory markers in rats. Brain Behav Immun. 30, 88-94 (2013).
  46. Dalsgaard, S., et al. Incidence rates and cumulative incidences of the full spectrum of diagnosed mental disorders in childhood and adolescence. JAMA psychiatry. 77 (2), 155-164 (2020).
  47. Pedersen, C. B., et al. A comprehensive nationwide study of the incidence rate and lifetime risk for treated mental disorders. JAMA psychiatry. 71 (5), 573-581 (2014).
  48. Heim, C., Shugart, M., Craighead, W. E., Nemeroff, C. B. Neurobiological and psychiatric consequences of child abuse and neglect. Dev Psychobiol. 52 (7), 671-690 (2010).
  49. Kessler, R. C., Petukhova, M., Sampson, N. A., Zaslavsky, A. M., Wittchen, H. U. Twelve-month and lifetime prevalence and lifetime morbid risk of anxiety and mood disorders in the united states. Int J Methods Psychiatr Res. 21 (3), 169-184 (2012).
  50. Boyd, A., et al. Gender differences in mental disorders and suicidality in europe: Results from a large cross-sectional population-based study. J Affect Disord. 173, 245-254 (2015).
  51. Bale, T. L., Epperson, C. N. Sex differences and stress across the lifespan. Nat Neurosci. 18 (10), 1413-1420 (2015).
  52. Hankin, B. L., Mermelstein, R., Roesch, L. Sex differences in adolescent depression: Stress exposure and reactivity models. Child Dev. 78 (1), 279-295 (2007).
  53. Kim, S., Colwell, S. R., Kata, A., Boyle, M. H., Georgiades, K. Cyberbullying victimization and adolescent mental health: Evidence of differential effects by sex and mental health problem type. J Youth Adolesc. 47, 661-672 (2018).
  54. Filipponi, C., Petrocchi, S., Camerini, A. L. Bullying and substance use in early adolescence: Investigating the longitudinal and reciprocal effects over 3 years using the random intercept cross-lagged panel model. Front Psychol. 11, 571943 (2020).
  55. Brody, G. H., Yu, T., Chen, E., Miller, G. E. Persistence of skin-deep resilience in african american adults. Health Psychol. 39 (10), 921 (2020).
  56. Rijlaarsdam, J., Cecil, C. A., Buil, J. M., Van Lier, P. A., Barker, E. D. Exposure to bullying and general psychopathology: A prospective, longitudinal study. Res Child Adolesc Psychopathol. 49, 727-736 (2021).
  57. Vassilev, P., et al. Unique effects of social defeat stress in adolescent male mice on the netrin-1/dcc pathway, prefrontal cortex dopamine and cognition. eNeuro. 8 (2), (2021).
  58. Vassilev, P., et al. Custom-built operant conditioning setup for calcium imaging and cognitive testing in freely moving mice. eNeuro. 9 (1), (2022).
  59. Pantoja-Urbán, A. H., et al. Gains and losses: Resilience to social defeat stress in adolescent female mice. Biol Psychiatry. 95 (1), 37-47 (2024).
  60. Torres-Berrío, A., et al. Dcc confers susceptibility to depression-like behaviors in humans and mice and is regulated by mir-218. Biol Psychiatry. 81 (4), 306-315 (2017).
  61. Ver Hoeve, E. S., Kelly, G., Luz, S., Ghanshani, S., Bhatnagar, S. Short-term and long-term effects of repeated social defeat during adolescence or adulthood in female rats. Neuroscience. 249, 63-73 (2013).

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Keywords: Sconfitta sociale dello stress Topi adolescenti C57BL/6 Maschio e femmina Evitamento sociale Modello di stress da sconfitta sociale accelerata (AcSD) Sviluppo cerebrale Risultati comportamentali
Modello di stress di sconfitta sociale per topi maschi e femmine adolescenti C57BL / 6
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Pantoja-Urbán, A. H., Richer, S., Giroux, M., Nouel, D., Flores, C. Social Defeat Stress Model for Adolescent C57BL/6 Male and Female Mice. J. Vis. Exp. (205), e66455, doi:10.3791/66455 (2024).

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