Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Модель социального поражения для мышей-подростков C57BL/6 мужского и женского пола

Published: March 15, 2024 doi: 10.3791/66455
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2,3,4,5
1Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 2Douglas Mental Health University Institute, McGill University, 3Department of Psychiatry, McGill University, 4Department of Neurology and Neurosurgery, Faculty of Medicine, McGill University, 5Ludmer Centre for Neuroinformatics & Mental Health, McGill University

Summary

Мы разработали модель ускоренного социального поражения для мышей-подростков C57BL/6, которая работает как у самцов, так и у самок и позволяет воздействовать на них в дискретные подростковые периоды. Воздействие этой модели вызывает социальное избегание, но только у подмножества побежденных самцов и самок мышей.

Abstract

Социальные невзгоды в подростковом возрасте широко распространены и могут негативно влиять на траектории психического здоровья. Моделирование социального стресса у подростков мужского и женского пола грызунов необходимо для понимания его влияния на текущее развитие мозга и поведенческие результаты. Парадигма стресса хронического социального поражения (CSDS) широко используется для моделирования социального стресса у взрослых самцов мышей C57BL/6 путем использования агрессивного поведения, проявляемого взрослым самцом грызуна по отношению к вторгшемуся на его территорию. Преимущество этой парадигмы заключается в том, что она позволяет классифицировать побежденных мышей на устойчивые и восприимчивые группы на основе их индивидуальных различий в социальном поведении через 24 ч после последнего сеанса поражения. Реализация этой модели на мышах-подростках C57BL/6 была сложной задачей, потому что взрослые мыши или мыши-подростки обычно не нападают на мышей раннего подросткового возраста или самки, а также потому, что подростковый возраст — это короткий период жизни, охватывающий дискретные временные окна уязвимости. Это ограничение было преодолено путем адаптации ускоренной версии CSDS для использования на мышах-подростках мужского и женского пола. Эта парадигма 4-дневного стресса с 2 сеансами физической атаки использует взрослого самца C57BL/6, чтобы подготовить мышь CD-1 к агрессивности таким образом, что она легко атакует самца или самку мыши-подростка. Эта модель была названа ускоренным стрессом социального поражения (AcSD) для мышей-подростков. Воздействие AcSD на подросткового возраста вызывает социальное избегание через 24 часа как у самцов, так и у самок, но только у подгруппы побежденных мышей. Эта уязвимость возникает, несмотря на то, что количество атак одинаково в сеансах между устойчивыми и восприимчивыми группами. Модель AcSD достаточно коротка, чтобы обеспечить воздействие в дискретные периоды в подростковом возрасте, позволяет сегрегировать мышей в соответствии с наличием или отсутствием социального избегающего поведения, и является первой моделью, доступной для изучения стресса социального поражения у самок мышей-подростков C57BL/6.

Introduction

Парадигма стресса хронического социального поражения широко используется для моделирования социального стресса у взрослых самцов грызунов в послеродовой период (ПНД) >65 лет. Эта парадигма основана на естественном агрессивном поведении взрослого самца грызуна, когда злоумышленник вторгается на его территорию. Эта модель используется на различных видах грызунов, включая крыс, хомяков и мышей 1,2,3,4,5,6,7,8,9, и состоит из комбинации физической агрессии и психологического стресса продолжительностью около 10 дней, в течение которых вторгшийся грызун испытывает несколько минут физической агрессии со стороны местного грызуна. Два грызуна остаются в домашней клетке жильца, разделенные перегородкой, которая позволяет осуществлять сенсорный, но не физическийконтакт. В экспериментах на мышах наиболее часто используемыми мышами-резидентами/агрессорами являются вышедшие на пенсию мыши-селекционеры Swiss CD-1, которые демонстрируют устойчивое территориальное поведение против мышей-нарушителей 6,7. Для мышей-нарушителей наиболее характерным штаммом является инбридинговый штамм C57BL/6 2,4,5. Побежденная мышь каждый день подвергается воздействию нового агрессора, чтобы не допустить привыкания к агрессору. Контрольные мыши каждый день размещаются с разными сородичами. Через 24 часа после последнего сеанса поражения подопытные мыши были протестированы в тесте социального взаимодействия (SIT), в котором они могли исследовать открытое поле в отсутствие (без мишени) или в присутствии новой мыши CD-1 (мишени). Контрольные мыши проводят больше времени в зоне взаимодействия с целью, чем в нецелевой части задачи. Побежденные мыши классифицируются как восприимчивые (ratio<1) или устойчивые (ratio>1) в соответствии с коэффициентом социального взаимодействия (время нахождения в зоне взаимодействия с присутствующим агрессором/время нахождения в зоне взаимодействия с агрессором в отсутствии). Эта процедура является полезным инструментом для изучения индивидуальных различий в реакции на стресс.

До недавнего времени модель стресса хронического социального поражения использовалась в основном у взрослых самцов мышей, потому что подчеркнутые иерархии доминирования самцов предполагают борьбу против самцов, но не против самок. Кроме того, самцы грызунов обычно не нападают на самок; Вместо этого они участвуют в брачном поведении10. Несмотря на эти препятствия, были разработаны различные стратегии для адаптации парадигмы хронического социального стресса для взрослых самок мышей. Например, калифорнийская мышиная модель социального поражения основана на естественной агрессии этого моногамного вида со стороны представителей обоих полов при защитесвоей территории. Другие подходы сосредоточены на индуцировании агрессивного поведения мышей CD-1 путем стимуляции их вентромедиального гипоталамуса для последовательного агрессивного поведения10,12 или путем применения мочи самцов у экспериментальных взрослых самок мышей для получения атак со стороны агрессоров CD-113. Эта повышенная и последовательная агрессия мышей CD-1 имеет решающее значение для того, чтобы экспериментальная мышь-нарушитель проявляла явные поведенческие признаки подчинения по отношению к повторяющимся атакам агрессора в течениедлительного взаимодействия.

Адаптация модели хронического социального поражения для использования у подростков C57BL/6mice
Подростковый возраст – это период, отмеченный существенным психосоциальным созреванием, которое разворачивается параллельно с изменениями в микро- и макроархитектуре мозга, особенно в префронтальной коре. Как у людей, так и у грызунов нет единого мнения относительно конкретного начала и конца подросткового периода14,15. Кроме того, существуют критические окна уязвимости в подростковом возрасте для вызванных опытом нарушений текущего мозга и когнитивного развития 16,17,18,19. Половое созревание и подростковый возраст наступают в одно и то же время, но эти термины не являются синонимами. Половое созревание означает наступление полового созревания, в то время как подростковый возраст представляет собой более широкую фазу, характеризующуюся постепенным переходом от юношеского состояния к достижению независимости. Различные группы предположили, что подростковый возраст у мышей длится от отлучения от груди (PND 21) до взрослого возраста (PND 60)21. В частности, ранний подростковый возраст можно назвать первой и второй неделями после отлучения от груди (PND 21-34), а средний подростковый возраст — периодом PND 35-48. Эти диапазоны охватывают дискретные периоды развития, касающиеся, например, развития дофаминовой системы 22,23,24, уязвимости к воздействию лекарственных препаратов на развивающиеся нейронные сети 17,25,26,27 и различных поведенческих характеристик 16,20,28,29,30.

Боевое поведение со стороны местной мыши требуется для протокола социального поражения. Однако, как и в случае с самками мышей, самцы обычно не вступают в агрессивные взаимодействия с мышами раннего подросткового возраста, возможно, потому, что они не воспринимают их как угрозу. Большинство исследований, изучающих последствия хронического социального поражения у мышей-подростков C57BL/6, были проведены в среднеподростковый период 31,32,33,34,35; другие не указывают постнатальный день воздействия в подростковом возрасте36,37, или продлевают дни поражения до раннего взрослого возраста38 или не разрешают сенсорный контакт39; В других исследованиях на мышах-подростках используются другие штаммы40,41. Характеристики этих исследований с использованием хронического стресса социального поражения у мышей-подростков мужского пола обобщены в таблице 1.

Наша исследовательская группа заинтересована в нацеливании на конкретные подростковые окна воздействия, включая ранний подростковый возраст, у мышей C57BL/6. Из-за короткой продолжительности различных подростковых периодовбыла разработана модифицированная версия ускоренной версии парадигмы стресса хронического социального поражения. Эта модель была названа ускоренным стрессом социального поражения (AcSD) для мышей-подростков. Предыдущая работа показывает, что существуют значимые половые различия в чувствительности к социальному стрессу в подростковом возрасте у крыс 8,26,43,44,45, а также в вредном влиянии социального стресса на траектории психического здоровья у людей 46,47,48,49,50,51,52, 53,54,55,56. Модель AcSD эффективно работает и для самок мышей-подростков, позволяя им исследовать потенциальные последствия, специфичные для пола, а также изучать нейробиологическую основу.

Таблица 1: Исследования с использованием парадигм стресса социального поражения у мышей-подростков мужского пола. Штамм и виды: Калифорнийская мышь: Peromyscus californicus. C57BL/6: Mus musculus black 6 инбредный штамм мышей. C57BL/6J: Модель мышей M. musculus black 6, предоставленная лабораториями Джексона. CD-1: M. musculus из швейцарской беспородной линии мышей-альбиносов. ICR: M. musculus Институт исследований рака вывел штамм мышей-альбиносов. OF1: M. musculus Oncins France 1 беспородная линия мышей-альбиносов.
Сокращения: wk = неделя; ПНД = послеродовой день; res = упругий; sus = восприимчивый; unsus = невосприимчивый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Экспериментальные процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными и одобрены Университетом Макгилла и Комитетом по уходу за животными больницы Дугласа (номер разрешения эксперимента на животных: 2005-5084). Все мыши были размещены в комнате колонии с контролируемой температурой и влажностью (21-22 °C; 60%) и в 12-часовом цикле свет-темнота (свет включается в 8:00 часов) в Центре нейрофенотипирования Института психического здоровья Университета Дугласа. Мыши имели свободный доступ к пище и воде на протяжении всего эксперимента. Мыши были случайным образом распределены по каждому экспериментальному состоянию. Подопытные животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). В таблице 2 обобщены характеристики животного для каждой фазы эксперимента. В общей сложности было использовано 489 мышей-подростков C57BL/6J (259 самцов; 230 самок) в 20 экспериментальных когортах.

Таблица 2: Животные для каждой фазы эксперимента. †Если эти животные не получили серьезных травм, их можно повторно использовать для грунтовки. ‡Если эти животные не получили серьезных травм, их можно повторно использовать для прайминга во время AcSD, § Центр нейрофенотипирования Института психического здоровья Университета Дугласа. Для экспериментов с самцами, #Для экспериментов с самками, если поражение смешанное, используйте самок для прайминга. ††Не используется для AcSD. Сокращения: AcSD = ускоренный стресс социального поражения; PND = Послеродовой день Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

1. Акклиматизация

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап должен длиться минимум 1 неделю.

  1. Приобретите самцов мышей-производителей CD-1 (см. Таблицу материалов) старше 4 месяцев и в два раза больше мышей-подростков C57BL/6J (т.е., если 10 мышей будут подвергаться стрессу, купите 20 мышей CD-1).
    Примечание: Приобретение такого количества CD-1 мышей рекомендуется, потому что лишь небольшая часть мышей с CD-1 проявляет агрессивное поведение по отношению к мышам-подросткам.
  2. Дайте самцам мышей CD-1 привыкнуть к новому помещению в их домашней клетке с пищей и водой в неограниченном количестве в течение 1 недели до скрининга и прайминга.
  3. Используйте C57BL/6 в PND >65 (взрослые) и PND 25 ±3 (подростки) (Таблица 2) для сеансов скрининга и прайминга. Приобретайте по 4 мыши C57BL/6 каждого возраста в день прайминга (т.е. в течение 3 дней прайминга приобретайте 12 PND >65 и 12 PND 25 ± 3), чтобы снизить риск травм, поскольку эти животные будут повторно использоваться для скрининга и процесса прайминга.

2. Скрининг и праймирование CD-1

Примечание: Продолжительность этой фазы составляет 3 дня скрининга (1 день для самок мышей) и 3-4 дня прайминга (этот показатель может увеличиваться для самок мышей и в зависимости от агрессивного поведения мышей CD-1).

  1. Используйте операционное определение атаки для регистрации атак CD-1, как описано ниже.
    1. Одна атака определяется как момент, когда мышь CD-1 кусает мышь C57BL/6J, а мышь C57BL/6J удаляется в ответ на укус. Укус определяется как ситуация, когда мышь CD-1 кладет свои зубы на любую часть тела мыши C57BL/6J. Отход определяется как момент, когда мышь C57BL/6J перемещает обе задние лапы из положения, в котором они находились до того, как CD-1 вступил с ней в бой.
    2. Убедитесь, что разница между отдельными атаками составляет не менее ~2 с. Если происходит более одного укуса с интервалом <2 с, считайте один приступ.
    3. Если мышь CD-1 кусает более одного раза подряд без перерыва (с интервалом <~2 с), аккуратно отделите животных пластиковой линейкой. Если мышь CD-1 кусается и не отпускает, аккуратно отделите животных. Если мышь C57BL/6J застряла в углу или прижата мышью CD-1 и не может отойти в ответ на укус, аккуратно отделите животных линейкой. Считайте все это как одну атаку (вплоть до разделения).
  2. Экранирование
    1. Используйте нитриловые смотровые перчатки для всех операций с животными и избегайте использования духов или ароматизаторов.
    2. В1-е сутки скрининга проводят только со взрослыми самцами мышей C57BL/6 в качестве незваных гостей (PND >65) в домашней клетке мышей CD-1. Всегда проверяйте мышей с CD-1 перед новым экспериментом.
    3. Поместите взрослого самца мыши C57BL/6 PND >65 в домашнюю клетку самца мыши CD-1 на 3 минуты. Зарегистрируйте задержку до первой агрессии и количество выполненных агрессий (см. дополнительную таблицу 1).
    4. Со2-го по последний день скрининга ввести взрослому мужчине C57BL/6 PND>65 на 1 мин (ограничение до 30 с, если CD-1 очень агрессивен), а затем поменять его местами с подростком C57BL/6 PND 25 ± 3 на 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно проводить скрининг на мышах-подростках, потому что не все мыши, которые атакуют взрослого самца мыши C57BL/6, будут атаковать подростка C57BL/6. На самом деле, мыши CD-1, которые атакуют мышей-подростков, не всегда будут атаковать взрослых самцов C57BL/6.
    5. Если эксперимент направлен на агрессивность по отношению к самкам мышей, проведите скрининг и прайминг на самках мышей-подростков, даже если экспериментальные мыши включают оба пола.
    6. Зарегистрируйте латентность до первой агрессии, количество атак и ран, полученных всеми мышами C57BL/6 (см. дополнительную таблицу 2).
    7. Регистрируйте любые виды взаимодействия: преследование, поведение при верховой езде, обнюхивание, груминг или укус. Регистрировать, если CD-1 не приближается к мышам-подросткам C57BL/6; если такое поведение повторяется в течение 2 дней, не включайте CD-1 в прайминг.
    8. Для фазы прайминга выберите всех мышей CD-1, которые демонстрируют такие поведения, как преследование, поведение при монтировании, обнюхивание, преследование, груминг или укус подростка C57BL/6.
    9. Оставьте неотобранных мышей с CD-1 и используйте их для теста на социальное взаимодействие (SIT).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Территориальное поведение со временем усиливается; таким образом, неотобранные мыши CD-1 могут стать агрессивными по отношению к мышам-подросткам в следующем эксперименте.
  3. Затравка агрессивного поведения CD-1
    1. Мышей CD-1, отобранных для прайминга, содержат в их домашней клетке до последнего дня прайминга.
    2. Поместите взрослого самца мыши C57BL/6J PND >65 на 30 с в домашнюю клетку CD-1, а затем поменяйте его местами с мышью-подростком C57BL/6 PND 25 ± 3 на 5 минут.
    3. Зарегистрируйте задержку до первой агрессии, количество атак и любое взаимодействие (см. дополнительную таблицу 3).
    4. Выполняйте грунтовку 2 раза в день в течение 3-4 дней, одновременно с назначением поражений (9:00 утра и 14:00 дня).
      Примечание: Не все мыши с CD-1 будут атаковать мышей-подростков в течение первых дней, особенно если подготовка направлена на самок мышей. Количество дней для прайминга может увеличиваться или уменьшаться в зависимости от агрессивного поведения, проявляемого мышами CD-1.
    5. Чтобы уменьшить количество дней прайминга, повторно используйте мышей CD-1, которые прошли через предыдущий эксперимент по социальному поражению с самцами мышей. Если мыши CD-1 не проявляют повышенной агрессии, продлите дни для прайминга до достижения критериев.
    6. Уменьшите количество дней для прайминга, если мыши CD-1 демонстрируют крайне агрессивное поведение (мыши C57BL/6 демонстрируют чрезмерное ранение), чтобы предотвратить серьезные травмы во время социального поражения.
    7. Для следующей фазы эксперимента выберите мышей с CD-1, которые атакуют мышей-подростков не менее 10 раз (самцы) или 5 раз (самки) в течение 2 дней подряд.

3. Протокол AcSD

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта фаза состоит из 3 дней привыкания и 4 дней воздействия AcSD.

  1. Привыкание
    1. Установите клетки для крыс для социального поражения (рисунок 1A-F). Разделите клетки для крыс на 2 отсека с помощью соответствующих перегородок из акрилового стекла (рис. 1B, D; см. Таблицу материалов).
    2. Добавьте подстилку из твердой древесной стружки с обеих сторон клетки, добавьте хлопчатобумажный квадрат с каждой стороны в качестве материала для подстилки (Рисунок 1D). Убедитесь, что верхняя часть проволоки закреплена связующими зажимами (рис. 1E). Убедитесь, что клетка для крыс закрыта крышкой без защитной ваты (Рисунок 1F).
    3. Поместите мышь CD-1 на каждую клетку с одной стороны клетки. Поместите бирку на внешнюю сторону клетки, чтобы облегчить идентификацию каждой мыши.
    4. Поместите выбранных мышей CD-1 в аппарат социального поражения (рисунок 1F) за 2 или 3 дня до начала протокола AcSD (для усиления территориального поведения CD-1).
    5. Провести сеанс прайминга за 1 день до эксперимента; Это важно для поддержания постоянной агрессии.
  2. Сеансы поражения
    1. Проводите 2 сеанса в день (первый сеанс: 9 утра, второй сеанс: 2 часа дня) в течение 4 дней, всего 8 сеансов. Составьте расписание, чтобы гарантировать, что агрессор будет отличаться для каждого сеанса (см. Дополнительную таблицу 4 и Дополнительную таблицу 5).
    2. Взвесьте мышь-подростка C57BL/6 перед тем, как поместить ее на сторону CD-1 клетки. Введите взрослого самца мыши C57BL/6 >65 на 30 секунд в сторону CD-1 клетки поражения, а затем поменяйте его местами с мышью-подростком C57BL/6 PND 24-28 для 10-минутного эпизода поражения или максимум 10 атак за сеанс.
    3. Отделяйте животных после каждой атаки с помощью пластиковой линейки. После каждого сеанса поражения проверяйте наличие травм, и обрабатывайте их обезболивающим кремом. Зарегистрируйте количество травм.
    4. Поместите мышь C57BL/6J для подростка в свободное отделение рядом с незнакомым агрессором до следующего сеанса. Повторяйте эту процедуру с разным агрессором на каждом сеансе.
    5. Начните сеанс с экспериментальных мышей и мышей-агрессора, которые не были спарены на предыдущем сеансе. Мониторинг травм взрослых самцов мышей C57BL/6J, используемых для прайминга (см. дополнительную таблицу 6).
  3. Следуйте приведенным ниже рекомендациям по благополучию животных и гуманным конечным точкам.
    1. Следуйте стандартной процедуре работы соответствующего институционального наблюдательного совета по социальным поражениям и обеспечьте постоянную ветеринарную оценку.
    2. Следите за здоровьем мышей на протяжении всего исследования, чтобы избежать страданий и смерти животных.
    3. Убедитесь, что перфорированная перегородка установлена правильно, чтобы предотвратить переход мышей в другое отделение.
    4. Сообщите ветеринарному персоналу о появлении раны у животного для соответствующего наблюдения и ежедневно наносите обезболивающий крем до полного заживления раны.
    5. Если травма ухудшается (раны увеличиваются в размерах), ограничьте количество приступов до 5 на следующем сеансе, чтобы дать возможность восстановиться. Проверьте, нет ли тяжелых травм. Тяжелыми травмами считаются раны общим размером > 1 см.
    6. Немедленно удалять и усыплять животных, у которых наблюдается снижение веса на 15-20% от первоначальной массы тела; сниженная/сниженная двигательная активность и нарушение груминга; мыши с ранами > 1 см; оторванный пенис, или следы укусов с отеком передних конечностей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первичная эвтаназия проводится в газовых камерах с изофлураном/CO2, за которой следует вторичная эвтаназия путем вывиха шейки матки.
  4. Контрольные мыши
    1. Проводите 2 сеанса в день (первый сеанс: 9 утра, второй сеанс: 2 часа дня) в течение 4 дней, всего 8 сеансов. Составьте расписание, чтобы контрольные мыши каждый сеанс находились в одной клетке с разными сородичами C57BL/6J (см. Дополнительную таблицу 7 и Дополнительную таблицу 8).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольные мыши не подвергаются воздействию агрессора. Чтобы имитировать введение в новую мышь CD-1 каждую сессию поражения, контрольные мыши объединяются в пары с новым однополым и ровесным сородичем (не однопометником) в каждой сессии.
    2. Поместите контрольных мышей в аппарат социального поражения (рис. 1) в отдельной комнате от мышей AcSD.
    3. Поместите двух контрольных мышей в каждую клетку, по одной с каждой стороны клетки. Поместите мышей в другую сторону клетки или вообще в другую клетку, чтобы они не распознали запах. Чередуйте контрольные мыши в каждом сеансе.

Figure 1
Рисунок 1: Аппарат для ускоренного социального поражения стрессом (AcSD) у мышей-подростков. (А) Слева направо, парные верхушки из стальной проволоки с расстоянием между брусьями 0,6 см, прозрачная перфорированная перегородка из поликарбоната с диаметром перфорации 0,6 см, связующие зажимы для крепления проволочных вершин, прозрачная клетка для крыс с крышкой-крышкой (без хлопчатобумажного защитного слоя). (B) Вверх: сравнение между поликарбонатными разделителями для хронического социального поражения у взрослых (слева) и AcSD у подростков (справа); Вниз: Близко к разделителю из поликарбоната для мышей-подростков. (C) Вверх: сравнение верхушек из стальной проволоки для хронического социального поражения у взрослых (слева) и AcSD у подростков (справа); Вниз: крупный план верха из стальной проволоки. (Д-Ж) Сборка аппарата социального поражения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

4. Тест на социальное взаимодействие

  1. Выполните SIT после AcSD, как описано ранее 57,58,59.
    1. Выполняйте SIT через 24 часа после последнего сеанса AcSD. Выполняйте SIT при красном свете (не при желтом свете) с 9 утра до 4 вечера.
    2. Установите главную квадратную арену и накладную видеокамеру (см. Таблицу материалов). Основная арена разделена на 3 зоны: зона социального взаимодействия (СИЗ), уголки и центр; Эти участки должны быть отмечены на арене черной линией (используйте черный перманентный маркер). Используйте следующие размеры и критерии для каждой области.
      1. Убедитесь, что SIZ представляет собой квадратную площадь 14 см x 9 см, которая окружает вольер. Углы представляют собой небольшие квадратные участки (9 см х 9 см) в углах стены, противоположной ограждению, и представляют собой самую дальнюю точку от СИЗ. Центр — это область между СИЗ и углами.
    3. Очистите арену и корпуса с помощью очищающего раствора водородпероксидазы.
    4. Разместите на полу идентификационные бирки для каждого животного для анализа. Записывайте все поведение животных для анализа в автономном режиме.
  2. Первый сеанс для определения исходного уровня исследования
    1. Поставьте пустой вольер из проволочной сетки у одной из стен арены. Поместите экспериментальную (побежденную или контрольную) мышь-подростка C57BL/6 в центр арены. Позвольте ему свободно исследовать арену в течение 2,5 минут. Достаньте мышь.
    2. Очистите арену и корпуса с помощью очищающего раствора водородпероксидазы.
  3. Вторая сессия по социальному взаимодействию
    1. Поместите незнакомую мышь CD-1 внутрь корпуса из проволочной сетки. Поместите корпус в то же место, что и во время предыдущего сеанса.
    2. Снова поставьте на арену ту же мышь C57BL/6 подросткового возраста. Позвольте ему свободно исследовать арену в течение 2,5 минут. Достаньте мышей.
    3. Очистите арену и корпуса с помощью очищающего раствора водородпероксидазы.
    4. Повторите процесс для всех мышей-подростков C57BL/6 (мыши-подростки C57BL/6 (мыши, подвергшиеся стрессу, и контрольные мыши) в уравновешенном порядке.
    5. Используйте более одной мыши CD-1 для SIT, чтобы уменьшить стресс и смещение при работе (например, для когорты из 30 мышей C57BL/6 используйте 4 мыши CD-1). Уравновесьте их среди мышей-подростков.
      Примечание: Этот тест измеряет приближение и/или поведение подопытных мышей по отношению к социальной цели, как это впервые описано в Кришнане5 и Голдене7.
  4. Анализ
    1. Запишите время, проведенное в зоне взаимодействия и углах во время обоих сеансов теста.
    2. Рассчитайте коэффициент социального взаимодействия как время, проведенное в зоне взаимодействия с присутствующим агрессором CD-1, разделенное на время, проведенное в зоне взаимодействия с отсутствующим агрессором CD-1.
    3. Классифицировать мышей с коэффициентом < 1,00 как восприимчивых и соотношением ≥ 1,00 как устойчивых.
    4. Исключить животных, которые не исследовали арену во время первого сеанса (т.е. провели 0 с в любой из обозначенных зон) из всех анализов для контроля различий в двигательной активности.
    5. Исключите всех животных, получивших 0 атак в течение ≥4 сеансов социального поражения, из всех анализов для предотвращения нерепрезентативных устойчивых животных.
    6. Исключите мышей (не восприимчивых), которые не проводят по крайней мере 61 с в зоне взаимодействия, чтобы гарантировать, что высокие коэффициенты социального взаимодействия отражают реальный интерес к социальной цели.
    7. Исключите мышей с показателями коэффициента взаимодействия с выбросами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В общей сложности было проведено четыре различных эксперимента с использованием модели стресса хронического социального поражения у мышей-подростков C57BL/6 самцов (PND 21). Тем не менее, эта модель имела существенные ограничения для ее использования на мышах C57BL/6 в раннем подростковом возрасте.

Оборудование требовало доработки для мышей-подростков C57BL/6
Первое ограничение заключалось в том, что оборудование, используемое для аппарата социального поражения, было предназначено для взрослых мышей. Благодаря своим размерам, мыши-подростки C57BL/6 в PND 21 могли проходить через перфорацию разделителей на сторону агрессора. Это прерывало период сенсорного контакта. Кроме того, мыши-подростки могли убегать через прутья верхних частей из стальной проволоки. Поэтому оборудование было модифицировано таким образом, чтобы предотвратить побег мышей (Рисунок 1). Диаметр перфорации был изменен с 1,1 см до 0,6 см (рис. 1В), а верх из стальной проволоки был заменен с расстояния между стержнями 1,1 см на верх с расстоянием 0,6 см (рис. 1В). Кроме того, верх был закреплен зажимами, а клетки для крыс также были закрыты пластиковыми чехлами без защитной ваты. Подстилка из древесной щепы также была установлена на соответствующем уровне для мышей-подростков (рисунок 1D-F).

Модель AcSD требует прайминга взрослых самцов мышей CD-1 для обеспечения стабильных, агрессивных схваток
Вторым и более важным ограничением было отсутствие последовательности в физической агрессии мышей CD-1 по отношению к мышам-подросткам. Во время сеансов хронического социального поражения агрессия варьировалась от нуля агрессивных атак в течение 10-минутного сеанса до одного или двух укусов, которые были смертельными из-за небольшого размера мышей-подростков. Однако, если мыши CD-1 использовались более чем в одном эксперименте, постоянство в количестве атак увеличивалось.

На рисунке 2B показано количество приступов в день для каждой экспериментальной когорты с хроническим социальным поражением (P0, A0, A1 и A2). Было обнаружено взаимодействие между днем и когортой (рисунок 2B, двустороннее повторное измерение ANOVA: F(27, 234) = 3,83, p < 0,0001), основным эффектом дня (F(6,288, 163,5) = 6,2, p < 0,0001) и основным эффектом когорты (F(3, 26) = 3,8, p = 0,02). Апостериорный тест выявил различия между когортами в 1, 2, 3 и 7 дни (апостериорные тесты Холма-Сидака: день 1, P0 против A2, p = 0,02; А1 против А2, p = 0,02; день 2, А1 против А2, p = 0,04; день, 3 А0 против А1, p = 0,007; А1 против А2, p = 0,04; день 7, А0 против А1, p = 0,04). Все мыши с CD-1 в экспериментах P0 и A0 перестали атаковать в течение последних 3 дней. Мыши с CD-1, которые использовались в экспериментах P0 и A0, использовались в экспериментах A1, у которых наблюдалась последовательность атак (рис. 2B), что указывает на то, что CD-1 были более склонны к агрессии, если подвергались физическим взаимодействиям ранее.

По этой причине, как описано на этапах 2.1 и 2.2, мышей с CD-1 специально проверяли на их агрессию по отношению к мышам-подросткам и подготавливали взрослого самца C57BL/6 на агрессию по отношению к мышам-подросткам C57BL/6. Кроме того, AcSD была использована для увеличения возраста с PND 21 до PND 25 и по-прежнему нацелена на ранний подростковый возраст.

Во время сеансов AcSD мыши с CD-1 увеличивали количество атак по отношению к мышам-подросткам в более последовательной схеме, как показано на рисунке 2D. В отличие от парадигмы хронического социального поражения, не было обнаружено значимого взаимодействия между сеансом и экспериментальной когортой (рисунок 2D, двусторонние повторные измерения ANOVA: F(35, 483) = 1,33, p = 0,1), наблюдался основной эффект сеанса (F(5,644, 389,5) = 14,15, p < 0,0001) и основной эффект когорты (F(5, 69) = 7,91, p < 0,0001); Апостериорный тест Холма-Сидака не выявил существенных различий между когортами. Сравнение средних значений атак между когортами показало, что этот эффект в основном обусловлен когортой А7, у которой было достоверно большее количество атак (данные не показаны, односторонняя ANOVA F(5, 69) = 7,911, p < 0,0001; Апостериорные тесты Холма-Сидака: А3 против А6, p = 0,04; А7 против А5, p = 0,002; А7 против А6, р < 0,0001; А7 против А8, p = 0,0001).

Мыши-подростки получали больше атак с праймированными мышами CD-1 во время AcSD, чем мыши-подростки, подвергшиеся воздействию протокола хронического социального поражения (рис. 2E, непарный t-критерий с коррекцией Уэлча, t = 15,40, df = 17,87, p < 0,0001) с использованием наивных (непраймированных) мышей CD-1. Атаки не были последовательными во время протокола хронического социального поражения, и на самом деле несколько экспериментальных мышей вообще не подвергались атакам.

Figure 2
Рисунок 2: Сравнение количества приступов в день между стрессом хронического социального поражения и AcSD. (A) Временная шкала модели стресса хронического социального поражения. (B) Количество приступов в день для каждой экспериментальной когорты (P0, P1, A1 и A2) во время хронического стресса социального поражения у мышей-подростков C57BL/6 самцов (двустороннее повторное измерение ANOVA). (C) Хронология модели ускоренного стресса социального поражения (AcSD). (D) Количество приступов в день для каждой экспериментальной когорты (A3-A8) во время AcSD у мышей-подростков C57BL/6 самцов (двустороннее повторное измерение ANOVA). (E) Среднее количество атак было достоверно выше для AcSD (непарный t-критерий с поправкой Уэлча, ****p < 0,0001). Все данные показаны в виде среднего ± SEM. Сокращения: CSDS = хронический стресс социального поражения; SIT = тест на социальное взаимодействие; ПНД = послеродовой день; P0, A0-A8 = метки для каждой экспериментальной когорты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Паттерн атак во время сеансов AcSD не влияет на социальный фенотип через 24 ч
После воздействия стресса у большинства мышей-подростков мужского пола не наблюдалось социального избегания при тестировании в МСН (рис. 3B, хроническое социальное поражение: односторонняя ANOVA F(2, 43) = 14,57, p < 0,0001. Ф, AcSD: критерий Краскела-Уоллиса, H(2) = 72,35, p < 0,0001). Для обеих моделей не было выявлено существенных различий в количестве атак между социально-избегающими и несоциально-избегающими побежденными мышами (рисунок 3D, хроническое социальное поражение: двусторонние повторные измерения ANOVA, F(9, 252) = 4,07, p = 0,21. Х. AcSD: двустороннее повторное измерение ANOVA, F(7, 511) = 1,32, p = 0,24). Тем не менее, доля устойчивых мышей была выше после хронического социального поражения, чем после воздействия AcSD (рис. 3C,G, 70 % против 55,26 %, биномиальный тест (односторонний), p = 0,0047).

Figure 3
Рисунок 3: Сравнение результатов теста социального взаимодействия (SIT) после стресса хронического социального поражения и парадигмы AcSD. (A) Временная шкала модели стресса хронического социального поражения. (B) Распределение баллов МСН после хронического стресса социального поражения в подростковом возрасте (односторонняя ANOVA). (C) Доля устойчивых/восприимчивых после хронического социального стресса в подростковом возрасте. (D) Количество приступов по фенотипу, полученных во время хронического стресса социального поражения, не было обнаружено существенных различий между устойчивыми и восприимчивыми (двусторонние повторные измерения ANOVA). (E) Хронология модели ускоренного стресса социального поражения (AcSD). (F) Распределение баллов SIT после AcSD в подростковом возрасте (Kruskal-Wallis). Эта цифра была изменена с57. (G) Доля устойчивых/восприимчивых после РАС в подростковом возрасте. Эта цифра была изменена с57. (H) Количество приступов по фенотипу, полученных во время AcSD; нет разницы между упругим и восприимчивым (двустороннее повторное измерение ANOVA). Эта цифра была изменена с59. **p < 0,001, ****p < 0,0001. Все данные отображаются как среднее значение ± SEM. Сокращения: PND = послеродовой день; Con = органы управления; Res = упругий; Sus = восприимчивый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

AcSD можно использовать у мышей-подростков C57BL/6
Поскольку самцы и самки мышей PND 25 C57BL/6 не достигли репродуктивной зрелости, праймированные мыши CD-1 могут проявлять агрессивные атаки по отношению к мышам-подросткам так же, как они делали это по отношению к мышам-подросткам-самцам. Тем не менее, фаза подготовки должна была быть продлена, чтобы достичь стабильного числа атак (рис. 4A). Как показано на рисунке 4B, не было обнаружено взаимодействия между днем и когортой в разных экспериментах (рисунок 4B, двусторонние повторные измерения ANOVA: F(35,707) = 1,38, p = 0,07), наблюдался основной эффект сеанса (F(6,286, 634,9) = 16,1, p < 0,0001) и основной эффект когорты (F(5, 101) = 11,34, p < 0,0001; Апостериорные тесты Холма-Сидака: сессия 2 С4 против С8, p = 0,03; сеанс 6 С7 против С4, p = 0,02; С7 против С5, р = 0,02; сеанс 7 С8 против С3, p = 0,02; C8 против C4, p = 0,045). Большинство самок мышей-подростков C57BL/6, подвергшихся воздействию AcSD, были устойчивы к социальному избеганию (рисунок 4C, ANOVA Брауна-Форсайта: F(2,113.4) = 27.2, p < 0.0001), аналогично мышам-подросткам-самцам. Не было обнаружено существенной разницы в числе атак между устойчивыми и восприимчивыми мышами (рисунок 4E, двусторонние повторные измерения ANOVA, взаимодействие сеанса x фенотипа: F(7, 714) = 0,73, p = 0,64, основной эффект сеанса F(6,375, 650,3) = 7,02, p < 0,0001, отсутствие основного эффекта фенотипа F(1, 102) = 0,4, p = 0,53).

Figure 4
Рисунок 4: AcSD у самок мышей-подростков. (A) Хронология эксперимента. (Б) Количество атак в сутки по эксперименту во время AcSD (двусторонние повторные измерения ANOVA). (C) Распределение балла СИТ после AcSD в подростковом возрасте у самок мышей (ANOVA Брауна-Форсайта). (D) Доля устойчивых/восприимчивых после АКСД в подростковом возрасте (справа). (E) Количество приступов по фенотипу, полученных во время AcSD; не было обнаружено существенных различий между устойчивыми и восприимчивыми мышами (двустороннее повторное измерение ANOVA). Все данные показаны как среднее значение ± SEM. (C-E) Эти цифры были изменены по сравнению с59. Сокращения: SIT = тест на социальное взаимодействие; ПНД = послеродовой день; C3-C8 = метки для каждой экспериментальной когорты; Con = органы управления; Res = упругий; Sus = восприимчивый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительная таблица 1: Шаблон оценочного листа для 1-го дня скрининга со взрослыми. Сокращения: CD-1 = ID обследованных мышей с CD-1, Exp = идентификатор эксперимента, 3 min = продолжительность сеанса скрининга для взрослых мышей C57BL/6, BL6 ID = идентификатор взрослых мышей C57BL/6, использованных для скрининга, Lat 1 ADULTS = задержка первой атаки от CD-1 в сторону взрослой мыши C57BL/6, # агрессии = количество атак, выполненных CD-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица 2: Шаблон оценочного листа для скрининга со взрослыми и подростками. Сокращения: Exp = ID эксперимента, 1 min = Продолжительность сеанса скрининга для взрослых мышей C57BL/6, BL6 ID = ID взрослых мышей C57BL/6, использованных для скрининга, Lat 1 ADULTS = Задержка первой атаки от CD-1 в сторону взрослой мыши C57BL/6, # агрессии = Количество атак, выполненных CD-1, 5 min = Продолжительность сеанса скрининга для мышей-подростков C57BL/6, BL6 Ad = ID мышей-подростков C57BL/6, использованных для скрининга, Lat 1 Подростки = Латентность первой атаки от CD-1 в сторону мыши-подростка C57BL/6, CD-1 = ID мышей-подростков C57BL/6, прошедших скрининг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица 3: Шаблон оценочного листа для этапа грунтовки. Сокращения: CD-1 = ID мышей с CD-1, используемых для прайминга, Exp = ID эксперимента, 30 sec = Продолжительность сеанса прайминга для взрослых мышей C57BL/6, BL6 ID = ID взрослых мышей C57BL/6, используемых для прайминга, Lat 1 ADULTS = Задержка первой атаки от CD-1 в сторону взрослой мыши C57BL/6, # агрессии = Количество атак, выполненных CD-1, Min: 3 = Продолжительность сеанса прайминга для мышей-подростков C57BL/6, BL6 Ad = ID мышей-подростков C57BL/6, использованных для прайминга, Lat 1 Подростки = Латентность первой атаки от CD-1 в сторону мыши-подростка C57BL/6, # монтирования = Количество креплений, полученных мышами-подростками C57BL/6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица 4: Шаблон оценочного листа для планирования социального поражения (20 мышей-подростков). Сокращения: CD1 = ID мышей CD-1, E = Experiment, H = Влажность, 1st = Session 1,2nd = Session 2, BL6 adult = ID взрослых мышей C57BL/6, использованных для прайминга, Weight = Вес мышей-подростков C57BL/6, # attacks = Количество атак, выполненных CD-1, # wounds = Количество ранений, полученных мышами-подростками C57BL/6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица 5: Пример планирования социального поражения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица 6: Шаблон для мониторинга травматизма взрослых самцов мышей C57BL/6. Сокращения: 1-я - # ран = Количество ран, полученных взрослой мышью C57BL/6 в сеансе 1, 2-я - # ран = Количество ранений, полученных взрослой мышью C57BL/6 в сеансе 2, BL6 = ID взрослой мыши C57BL/6, использованной для прайминга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица 7: Шаблон планирования контрольной группы (10 мышей-подростков). Правила скрамблинга: Не повторяйте одну и ту же сородичу; мышь не может повторять одну и ту же сторону коробки в один и тот же день; мышей приходится перебрасывать мышами из разных клеток от их домашней клетки; домашние клетки пронумерованы; количество мышей присваивается в зависимости от номера домашней клетки; Побежденные и контрольные группы забираются случайным образом из домашней клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица 8: Пример планирования контрольных групп. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Последовательное агрессивное поведение у мышей с CD-1
На этапе скрининга очень важно обратить внимание на все поведения, демонстрируемые CD-1 (преследование, поведение при монтировании, обнюхивание, груминг или кусание) и внимательно следить за этими записями при выборе мышей CD-1 для AcSD. Вполне вероятно, что мышь CD-1, которая взаимодействует с мышью-подростком, не атакуя ее, разовьет агрессивность по отношению к мышам-подросткам во время прайминга. Напротив, мышь CD-1, которая нападает на взрослую мышь, но не приближается к мыши-подростку, вероятно, не разовьет агрессивность по отношению к мышам-подросткам.

Фаза прайминга CD-1 позволяет развить агрессивное поведение по отношению к мышам-подросткам. Таким образом, наличие точного регистра поведения имеет решающее значение для отбора мышей. Кроме того, важно всегда проводить скрининг мышей CD-1 перед началом нового эксперимента, даже если мышь с CD-1 уже прошла через поражение. Некоторые мыши CD-1 могут перестать атаковать мышей-подростков, если их не беспокоить в домашних клетках в течение определенного периода времени, другие могут развить повышенное территориальное поведение, потому что они содержатся в изоляции.

Для праймирования мышей CD-1 протокол рекомендует 3 дня. Если используются наивные мыши CD-1, прайминг может быть продлен, если мыши CD-1 не атакуют мышей-подростков активно. У мышей с CD-1, которые пережили социальное поражение с мышами-подростками, продолжительность этой фазы прайминга может быть сокращена.

Фазы скрининга и прайминга имеют решающее значение для успешных сеансов AcSD. Например, мыши CD-1, которые были соответствующим образом подготовлены, будут атаковать и достигнуть лимита в 10 атак быстрее, чем менее агрессивные мыши CD-1, что позволяет проводить короткие эпизоды поражения.

Во время AcSD очень важно разделять животных, когда атаки очень сильны (т.е. мышь CD-1 не отпускает мышь C57BL/6J); В противном случае мыши-подростки будут травмированы, и атаки нужно ограничивать. Лечение травм также очень важно для предотвращения инфекций; Не рекомендуется использовать маслянистые мази для лечения травм, потому что животные будут слизывать мазь, теряя шерсть в процессе и обнажая травму.

Поиск и устранение неисправностей AcSD для мышей-подростков C57BL/6 мужского и женского пола
Модель стресса хронического социального поражения имела важные ограничения для ее использования в раннем подростковом возрасте как у самцов, так и у самок мышей C57BL/6. В этом разделе описаны изменения, которые были сделаны для разработки модели AcSD в подростковом возрасте.

Оборудование: Полный список оборудования указан в Таблице материалов. Мыши-подростки C57BL/6 в раннем подростковом возрасте (PND 21-30) были слишком малы для оборудования, описанного ранее, использованного в лаборатории60. Диаметр отверстий на перегородках из акрилового стекла достаточно велик, чтобы мыши C57BL/6 могли переходить из одного отсека в другой, где проживает агрессор. Чтобы этого не допустить, были изготовлены перегородки из акрилового стекла, которые имеют перфорацию небольшого диаметра. Кроме того, верхняя часть из стальной проволоки должна была быть закреплена зажимами, чтобы мыши не могли сбежать из клеток. Используемые крышки обычно используются для вентилируемых клеток. В этом случае эти крышки использовались без защитного хлопка, чтобы обеспечить надлежащую вентиляцию и предотвратить побег мышей из клетки. Важно учитывать, что количество используемой подстилки из древесной стружки должно позволять мышам-подросткам дотянуться до пищи и диспенсера для воды, расположенного на крышке. Однако большое количество древесной щепы может стать влажным.

Отбор мышей с CD-1: В хронической модели мыши с CD-1 проверяются на агрессивное поведение до начала эксперимента. Мышей с CD-1 отбирают после 3 дней скрининга, и оценивают их агрессивное поведение. После скрининга животные, которые имеют латентность для атаки менее 30 с и которые демонстрируют постоянные атаки, отбираются для следующей фазы. Тем не менее, во время экспериментов по хроническому социальному поражению мыши CD-1 не поддерживали постоянного числа приступов в течение 10 дней (рис. Поэтому несколько мышей CD-1 пришлось удалить из эксперимента из-за отсутствия агрессии по отношению к мыши-нарушителю. На самом деле, в то время как лишь небольшая часть мышей CD-1 атаковала мышь-нарушителя, некоторые из этих мышей были чрезвычайно агрессивны и иногда серьезно ранили самцов мышей C57BL/6 PND 21. Таким образом, скрининг мышей с CD-1 был изменен на отбор агрессивных мышей по отношению к мышам-подросткам, что усилило физическую агрессию.

Последовательность физической агрессии: Последовательная физическая агрессия приводит к получению быстрого и надежного поражения злоумышленника6. Для стандартизации процедур между экспериментами и экспериментаторами было использовано оперативное определениеатаки57, позволяющее точно количественно измерить агрессивность.

Агрессивность прайминга: Во время экспериментов по хроническому социальному поражению количество атак сильно варьировалось, уменьшаясь в течение последних дней эксперимента (рис. Чтобы увеличить агрессивное поведение мышей CD-1 по отношению к мышам-подросткам C57BL/6, мышей с CD-1 настраивали на активную агрессию независимо от того, какие мыши были введены в их домашнюю клетку. Такое поведение было достигнуто путем введения взрослого самца мыши C57BL/6 за 1 минуту до мыши-подростка, что побуждало мышь CD-1 атаковать мышей-подростков после того, как взрослая мышь была извлечена.

Продолжительность модели: Мыши-подростки C57BL/6 при PND 21 очень малы, и мыши CD-1 могут серьезно повредить их всего за одну атаку. Таким образом, чтобы нацелиться на ранний подростковый возраст и все еще иметь повторные сеансы социального поражения, была выбрана альтернативная модель классического 10-дневного хронического стресса социального поражения. Ускоренный стресс социального поражения (AcSD)42 состоит из двух сеансов физической агрессии в день, одного сеанса утром и одного днем, в общей сложности 4 дня (8 сеансов). Модель AcSD позволила увеличить возраст мышей-подростков с PND 21 до PND 25, по-прежнему ориентируясь только на ранний подростковый возраст.

Ограничения AcSD в подростковом возрасте
Модель AcSD имеет некоторые ограничения. По сравнению с моделью хронического социального поражения у взрослых, AcSD требует скрининга в два раза большего количества мышей с CD-1 по сравнению с мышами-подростками C57BL/6. Продолжительность фазы прайминга может варьироваться в зависимости от агрессивного поведения мышей CD-1; Таким образом, график AcSD должен быть спланирован с расчетом на опережение, и все эти переменные должны быть учтены. Поскольку большинство мышей-подростков проявляют устойчивость к социальному избеганию после воздействия AcSD, для получения репрезентативного числа восприимчивых мышей экспериментальная когорта должна включать не менее 20 животных для самцов и 30 для самок.

AcSD у мышей-подростков дает стабильные результаты в экспериментальных когортах
После воздействия социального стресса как с хроническим социальным поражением, так и с протоколами AcSD, большинство мышей-подростков показали устойчивость к социальному избеганию. Однако для модели хронического социального поражения не удалось отбросить изменчивость числа атак CD-1 как искажающую переменную. В отличие от этого, в экспериментах с AcSD мышей с CD-1 подготавливают перед каждым сеансом поражения, чтобы получить постоянное количество атак между сеансами (рис. 2D, E). В целом, все экспериментальные когорты мышей, подвергшихся воздействию AcSD, демонстрируют одинаковое количество атак в течение сеансов (рисунок 2D); однако это не относится к когортам мышей, подвергшимся модели хронического социального поражения (рисунок 2B).

Использование стресса хронического социального поражения у взрослых самок мышей C57BL/6 было сложной задачей по сравнению с другими, использующими эту модель, на других видах и линиях 9,13,45,61. В экспериментах с AcSD на самках мышей-подростков C57BL/6 фаза прайминга была удлиняема, что обеспечивало агрессивное поведение мышей CD-1 (рис. 4A). Тем не менее, вариабельность может наблюдаться в количестве атак среди экспериментальных когорт женщин (рисунок 4B). Тем не менее, в этих экспериментах все мыши с CD-1 проявляли агрессивное поведение по отношению к самкам. Чтобы увеличить количество атак, праймингинг с самцами мышей можно продлить до 1 минуты. Как и у самцов, доля самок мышей-подростков C57BL/6, устойчивых к социальному избеганию, была выше, чем у самок мышей с предрасположенностью (рис. 4C, D). Кроме того, количество приступов не различалось между устойчивыми и восприимчивыми мышами (рис. 4E), что указывает на то, что фенотип не зависит от атак. AcSD можно использовать на мышах-подростках C57BL/6, а эксперименты можно проводить одновременно на мышах обоих полов с использованием одних и тех же мышей CD-1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась Канадским институтом исследований в области здравоохранения (номера грантов CF: MOP-74709; PJT 190045), Национальный институт по борьбе со злоупотреблением наркотиками (номер гранта CF: R01DA037911), Совет по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (номер гранта CF: 2982226). Андреа Пантоха-Урбан был поддержан Национальным советом по гуманитарным наукам, науке и технологиям / Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCYT) из Мексики и FRQNT - стипендиальной программой для иностранных студентов (PBEEE). Сэмюэл Ричер получил стипендию от Интегрированной программы нейробиологии в Университете Макгилла. Иллюстрации к рисункам были созданы с использованием шаблонов от BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 adolescent mice  In house breeding Mice were breeded at the Neurophenotyping Centre of the Douglas Mental Health University Institute.
C57BL/6 adult mice  Charles River Laboratories Strain Code: 027 Mice are ordered so as to arrive at PND>65 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
C57BL/6J adolescent mice  Jackson Labs Strain Code: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664 Mice are ordered so as to arrive at PND 24 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages.
CD-1 mice  Charles River Laboratories Strain Code: 022 Mice retired breeders more than three months of age and singled housed throughout.
Cleaning solution  Virox Animal Health DIN 02537222 Prevail: Accelerated Hydrogen Peroxide. Desinfectant cleaner and deodorizer.
Clear perforated acrylic glass divider  Manufactured by Douglas Hospital, custom order 0.6 cm (w) × 45.7 cm (d) × 22.23 cm (h); perforations of 0.6 cm diameter. The dividers are perforated allowing sensory but no physical contact between the pair of mice.
Clear rectangular rat cages  Allentown 24 cm (w) × 48.3 cm (d) × 22.23 (h).
Cotton squares for bedding Inotiv Envigo T.6060 iso-BLOX 2.5 cm x 2.5 cm. Added to the social defeat apparatus.
Hard woodchip bedding Inotiv Envigo Teklad 7090, 7115 Sani-chip bedding.
Large binder clips to secure the steel-wire tops STAPLES Item #: 132429, Model #: 24178-CA 51 mm
Medium binder clips to secure the steel-wire tops Item #: 132367, Model #: 24172-CA 32 mm, in case the cover lids of the rat cages do not close with the large clips
Pain relief cream Polysporin Plus Pain Relief Cream (red format, NOT ointment), 2 Antibiotics plus lidocaine hydrochloride
Paired Steel-wire tops  24 cm (w) × 48 cm (d) with 0.6 cm (w) of separation between the grill
Removable wire-mesh enclosure  Johnston industrial plastics 11 cm (w) × 6.8 cm (d) × 42 cm (h) custom order; two per social interaction test arena secured in precut clear polycarbonate
Social interaction open-field arena PEXIGLAS 45 cm (w) × 45 cm (d) × 49 cm (h), custom-crafted from opaque acrylic glass (Plexiglas) 
Stopwatch  For timing defeat sessions
Video camera with infrared lights  Swann SRDVR-44580V  Swann Camera - 4 Channel 1080p Digital Video Recorder & 2 x PRO-T853
Video tracking software  Topscan 2.0 Clever Systems Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miczek, K. A. A new test for aggression in rats without aversive stimulation: Differential effects of d-amphetamine and cocaine. Psychopharmacology. 60, 253-259 (1979).
  2. Kudryavtseva, N., Bakshtanovskaya, I., Koryakina, L. Social model of depression in mice of c57bl/6j strain. Pharmacol Biochem Behav. 38 (2), 315-320 (1991).
  3. Blanchard, R. J., Mckittrick, C. R., Blanchard, D. C. Animal models of social stress: Effects on behavior and brain neurochemical systems. Physiol Behav. 73 (3), 261-271 (2001).
  4. Berton, O., et al. Essential role of bdnf in the mesolimbic dopamine pathway in social defeat stress. Science. 311 (5762), 864-868 (2006).
  5. Krishnan, V., et al. Molecular adaptations underlying susceptibility and resistance to social defeat in brain reward regions. Cell. 131 (2), 391-404 (2007).
  6. Bartolomucci, A., Fuchs, E., Koolhaas, J. M., Ohl, F. Acute and chronic social defeat: Stress protocols and behavioral testing. Neuromethods. 42, 261-275 (2009).
  7. Golden, S. A., Covington Iii, H. E., Berton, O., Russo, S. J. A standardized protocol for repeated social defeat stress in mice. Nat Protoc. 6 (8), 1183-1191 (2011).
  8. Bourke, C. H., Neigh, G. N. Behavioral effects of chronic adolescent stress are sustained and sexually dimorphic. Horm Behav. 60 (1), 112-120 (2011).
  9. Steinman, M. Q., Trainor, B. C. Sex differences in the effects of social defeat on brain and behavior in the California mouse: Insights from a monogamous rodent. Semin Cell Dev Biol. 61, 92-98 (2017).
  10. Takahashi, A., et al. Establishment of a repeated social defeat stress model in female mice. Sci Rep. 7 (1), 12838 (2017).
  11. Wright, E. C., et al. Sexual differentiation of neural mechanisms of stress sensitivity during puberty. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (43), 2306475120 (2023).
  12. Yin, W., et al. Repeated social defeat in female mice induces anxiety-like behavior associated with enhanced myelopoiesis and increased monocyte accumulation in the brain. Brain Behav Immun. 78, 131-142 (2019).
  13. Van Doeselaar, L., et al. Chronic social defeat stress in female mice leads to sex-specific behavioral and neuroendocrine effects. Stress. 24 (2), 168-180 (2021).
  14. Hollenstein, T., Lougheed, J. P. Beyond storm and stress: Typicality, transactions, timing, and temperament to account for adolescent change. Am Psychol. 68 (6), 444 (2013).
  15. Sawyer, S. M., Azzopardi, P. S., Wickremarathne, D., Patton, G. C. The age of adolescence. Lancet Child Adolesc Health. 2 (3), 223-228 (2018).
  16. Adriani, W., Laviola, G. Windows of vulnerability to psychopathology and therapeutic strategy in the adolescent rodent model. Behav Pharmacol. 15 (5), 341-352 (2004).
  17. Reynolds, L. M., et al. Early adolescence is a critical period for the maturation of inhibitory behavior. Cereb Cortex. 29 (9), 3676-3686 (2019).
  18. Reynolds, L. M., et al. Amphetamine disrupts dopamine axon growth in adolescence by a sex-specific mechanism in mice. Nat Commun. 14 (1), 4035 (2023).
  19. Sisk, L. M., Gee, D. G. Stress and adolescence: Vulnerability and opportunity during a sensitive window of development. Curr Opin Psychol. 44, 286-292 (2022).
  20. Spear, L. P. The adolescent brain and age-related behavioral manifestations. Neurosci Biobehav Rev. 24 (4), 417-463 (2000).
  21. Reynolds, L. M., Flores, C. Mesocorticolimbic dopamine pathways across adolescence: Diversity in development. Front Neural Circuits. 15, 735625 (2021).
  22. Manitt, C., et al. The netrin receptor dcc is required in the pubertal organization of mesocortical dopamine circuitry. J Neurosci. 31 (23), 8381-8394 (2011).
  23. Reynolds, L. M., et al. Dcc receptors drive prefrontal cortex maturation by determining dopamine axon targeting in adolescence. Biol Psychiatry. 83 (2), 181-192 (2018).
  24. Kalsbeek, A., Voorn, P., Buijs, R., Pool, C., Uylings, H. Development of the dopaminergic innervation in the prefrontal cortex of the rat. J Comp Neurol. 269 (1), 58-72 (1988).
  25. Cuesta, S., et al. Dcc-related developmental effects of abused-versus therapeutic-like amphetamine doses in adolescence. Addict Biol. 25 (4), 12791 (2020).
  26. Bekhbat, M., et al. Adolescent stress sensitizes the adult neuroimmune transcriptome and leads to sex-specific microglial and behavioral phenotypes. Neuropsychopharmacology. 46 (5), 949-958 (2021).
  27. Hammerslag, L. R., Gulley, J. M. Age and sex differences in reward behavior in adolescent and adult rats. Dev Psychobiol. 56 (4), 611-621 (2014).
  28. Wheeler, A. L., et al. Adolescent cocaine exposure causes enduring macroscale changes in mouse brain structure. J Neurosci. 33 (5), 1797-1803 (2013).
  29. Schneider, M. Adolescence as a vulnerable period to alter rodent behavior. Cell Tissue Res. 354, 99-106 (2013).
  30. Makinodan, M., Rosen, K. M., Ito, S., Corfas, G. A critical period for social experience-dependent oligodendrocyte maturation and myelination. Science. 337 (6100), 1357-1360 (2012).
  31. Iñiguez, S. D., et al. Social defeat stress induces a depression-like phenotype in adolescent male c57bl/6 mice. Stress. 17 (3), 247-255 (2014).
  32. Iñiguez, S. D., et al. Social defeat stress induces depression-like behavior and alters spine morphology in the hippocampus of adolescent male c57bl/6 mice. Neurobiol Stress. 5, 54-64 (2016).
  33. Latsko, M. S., Farnbauch, L. A., Gilman, T. L., Lynch Iii, J. F., Jasnow, A. M. Corticosterone may interact with peripubertal development to shape adult resistance to social defeat. Horm Behav. 82, 38-45 (2016).
  34. Zhang, F., Yuan, S., Shao, F., Wang, W. Adolescent social defeat induced alterations in social behavior and cognitive flexibility in adult mice: Effects of developmental stage and social condition. Front Behav Neurosci. 10, 149 (2016).
  35. Xu, H., et al. Effects of adolescent social stress and antidepressant treatment on cognitive inflexibility and bdnf epigenetic modifications in the mpfc of adult mice. Psychoneuroendocrinology. 88, 92-101 (2018).
  36. Huang, G. B., et al. Effects of chronic social defeat stress on behaviour, endoplasmic reticulum proteins and choline acetyltransferase in adolescent mice. Int J Neuropsychopharmacol. 16 (7), 1635-1647 (2013).
  37. Hasegawa, S., et al. Dysfunction of serotonergic and dopaminergic neuronal systems in the antidepressant-resistant impairment of social behaviors induced by social defeat stress exposure as juveniles. Int J Neuropsychopharmacol. 21 (9), 837-846 (2018).
  38. Resende, L., et al. Social stress in adolescents induces depression and brain-region-specific modulation of the transcription factor max. Transl Psychiatry. 6 (10), e914 (2016).
  39. Mouri, A., et al. Juvenile social defeat stress exposure persistently impairs social behaviors and neurogenesis. Neuropharmacology. 133, 23-37 (2018).
  40. Rodriguez-Arias, M., et al. Social defeat in adolescent mice increases vulnerability to alcohol consumption. Addict Biol. 21 (1), 87-97 (2016).
  41. Montagud-Romero, S., et al. Repeated social defeat and the rewarding effects of cocaine in adult and adolescent mice: Dopamine transcription factors, probdnf signaling pathways, and the trkb receptor in the mesolimbic system. Psychopharmacology. 234, 2063-2075 (2017).
  42. Wilkinson, M. B., et al. A novel role of the wnt-dishevelled-gsk3β signaling cascade in the mouse nucleus accumbens in a social defeat model of depression. J Neurosci. 31 (25), 9084-9092 (2011).
  43. Hyer, M., et al. Chronic adolescent stress causes sustained impairment of cognitive flexibility and hippocampal synaptic strength in female rats. Neurobiol Stress. 14, 100303 (2021).
  44. Bekhbat, M., et al. Chronic adolescent stress sex-specifically alters central and peripheral neuro-immune reactivity in rats. Brain Behav Immun. 76, 248-257 (2019).
  45. Pyter, L. M., Kelly, S. D., Harrell, C. S., Neigh, G. N. Sex differences in the effects of adolescent stress on adult brain inflammatory markers in rats. Brain Behav Immun. 30, 88-94 (2013).
  46. Dalsgaard, S., et al. Incidence rates and cumulative incidences of the full spectrum of diagnosed mental disorders in childhood and adolescence. JAMA psychiatry. 77 (2), 155-164 (2020).
  47. Pedersen, C. B., et al. A comprehensive nationwide study of the incidence rate and lifetime risk for treated mental disorders. JAMA psychiatry. 71 (5), 573-581 (2014).
  48. Heim, C., Shugart, M., Craighead, W. E., Nemeroff, C. B. Neurobiological and psychiatric consequences of child abuse and neglect. Dev Psychobiol. 52 (7), 671-690 (2010).
  49. Kessler, R. C., Petukhova, M., Sampson, N. A., Zaslavsky, A. M., Wittchen, H. U. Twelve-month and lifetime prevalence and lifetime morbid risk of anxiety and mood disorders in the united states. Int J Methods Psychiatr Res. 21 (3), 169-184 (2012).
  50. Boyd, A., et al. Gender differences in mental disorders and suicidality in europe: Results from a large cross-sectional population-based study. J Affect Disord. 173, 245-254 (2015).
  51. Bale, T. L., Epperson, C. N. Sex differences and stress across the lifespan. Nat Neurosci. 18 (10), 1413-1420 (2015).
  52. Hankin, B. L., Mermelstein, R., Roesch, L. Sex differences in adolescent depression: Stress exposure and reactivity models. Child Dev. 78 (1), 279-295 (2007).
  53. Kim, S., Colwell, S. R., Kata, A., Boyle, M. H., Georgiades, K. Cyberbullying victimization and adolescent mental health: Evidence of differential effects by sex and mental health problem type. J Youth Adolesc. 47, 661-672 (2018).
  54. Filipponi, C., Petrocchi, S., Camerini, A. L. Bullying and substance use in early adolescence: Investigating the longitudinal and reciprocal effects over 3 years using the random intercept cross-lagged panel model. Front Psychol. 11, 571943 (2020).
  55. Brody, G. H., Yu, T., Chen, E., Miller, G. E. Persistence of skin-deep resilience in african american adults. Health Psychol. 39 (10), 921 (2020).
  56. Rijlaarsdam, J., Cecil, C. A., Buil, J. M., Van Lier, P. A., Barker, E. D. Exposure to bullying and general psychopathology: A prospective, longitudinal study. Res Child Adolesc Psychopathol. 49, 727-736 (2021).
  57. Vassilev, P., et al. Unique effects of social defeat stress in adolescent male mice on the netrin-1/dcc pathway, prefrontal cortex dopamine and cognition. eNeuro. 8 (2), (2021).
  58. Vassilev, P., et al. Custom-built operant conditioning setup for calcium imaging and cognitive testing in freely moving mice. eNeuro. 9 (1), (2022).
  59. Pantoja-Urbán, A. H., et al. Gains and losses: Resilience to social defeat stress in adolescent female mice. Biol Psychiatry. 95 (1), 37-47 (2024).
  60. Torres-Berrío, A., et al. Dcc confers susceptibility to depression-like behaviors in humans and mice and is regulated by mir-218. Biol Psychiatry. 81 (4), 306-315 (2017).
  61. Ver Hoeve, E. S., Kelly, G., Luz, S., Ghanshani, S., Bhatnagar, S. Short-term and long-term effects of repeated social defeat during adolescence or adulthood in female rats. Neuroscience. 249, 63-73 (2013).

Tags

Ключевые слова: стресс социального поражения мыши-подростки C57BL/6 самец и самка социальное избегание модель ускоренного стресса социального поражения (AcSD) развитие мозга поведенческие исходы
Модель социального поражения для мышей-подростков C57BL/6 мужского и женского пола
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pantoja-Urbán, A. H., Richer,… More

Pantoja-Urbán, A. H., Richer, S., Giroux, M., Nouel, D., Flores, C. Social Defeat Stress Model for Adolescent C57BL/6 Male and Female Mice. J. Vis. Exp. (205), e66455, doi:10.3791/66455 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter