Summary
Campylobacter er den førende årsag til bakteriel fødevarebåren gastroenteritis på verdensplan. På trods af at virksomheder vedtager foranstaltninger for at reducere forekomsten i hele deres anlæg, når forurenede produkter konsekvent ud til forbrugerne. Den teknik, der er udviklet i løbet af de sidste tolv år, adresserer begrænsninger i eksisterende metoder til isolering og påvisning af Campylobacter spp. fra råt kød.
Abstract
Denne artikel præsenterer en hurtig, men robust protokol til isolering af Campylobacter spp. fra råt kød, specifikt med fokus på Campylobacter jejuni og Campylobacter coli. Protokollen bygger på etablerede metoder og sikrer kompatibilitet med de fremherskende teknikker, der anvendes af regulerende organer som Food and Drug Administration (FDA) og US Department of Agriculture (USDA) i USA samt International Organization for Standardization (ISO) i Europa. Centralt i denne protokol er indsamling af et skylning, som koncentreres og resuspenderes i Bolton Broth-medier, der indeholder hesteblod. Dette medium har vist sig at lette genopretningen af stressede Campylobacter-celler og reducere den krævede berigelsesvarighed med 50%. De berigede prøver overføres derefter til nitrocellulosemembraner på brucellaplader. For at forbedre metodens følsomhed og specificitet blev 0,45 μm og 0,65 μm porestørrelsesfiltermembraner evalueret. Data afslørede en 29 gange stigning i cellegendannelse med 0,65 μm porestørrelsesfilteret sammenlignet med 0,45 μm porestørrelsen uden at påvirke specificiteten. Campylobacters meget bevægelige egenskaber tillader celler aktivt at bevæge sig gennem membranfiltrene mod agarmediet, hvilket muliggør effektiv isolering af rene Campylobacter-kolonier . Protokollen inkorporerer multiplex kvantitativ realtidspolymerasekædereaktion (mqPCR) assay for at identificere isolaterne på artsniveau. Denne molekylære teknik tilbyder et pålideligt og effektivt middel til artsidentifikation. Undersøgelser udført i løbet af de sidste tolv år med detailkød har vist denne metodes evne til at forbedre genvinding af Campylobacter fra naturligt forurenede kødprøver sammenlignet med nuværende referencemetoder. Desuden kan denne protokol prale af reduceret forberedelses- og behandlingstid. Som følge heraf udgør det et lovende alternativ til effektiv genopretning af Campylobacter fra kød. Desuden kan denne procedure integreres problemfrit med DNA-baserede metoder, hvilket letter hurtig screening af positive prøver sammen med omfattende helgenomsekventeringsanalyse.
Introduction
Campylobacter spp. er den førende årsag til bakteriel fødevarebåren gastroenteritis på verdensplan med anslået 800 millioner tilfælde årligt1. Som en stor zoonotisk bakterie koloniserer Campylobacter naturligt mave-tarmkanalen hos en lang række dyr, herunder vilde fugle, husdyr og kæledyr2. Under slagtning eller levnedsmiddelforarbejdning kontaminerer Campylobacter spp. ofte slagtekroppe eller kødprodukter3. Campylobacteriosis er normalt forbundet med forbruget af underkogt fjerkræ eller krydskontaminering af andre fødevarer med rå fjerkræsaft2. Det kan forårsage alvorlige komplikationer, såsom Guillain-Barré syndrom, reaktiv arthritis og septikæmi hos immunkompromitterede personer4. Påvisning og isolering af Campylobacter fra fødekilder, især fjerkræprodukter, er afgørende for overvågning af folkesundheden, undersøgelse af udbrud og risikovurdering.
Konventionelle dyrkningsbaserede metoder er de traditionelle og standardmetoder til Campylobacter-detektion 5,6. Der er dog flere begrænsninger, herunder lange inkubationstider (48 timer eller mere), lav følsomhed (op til 50%) og er ikke inkluderende for alle stammer (nogle stressede Campylobacter-celler vokser muligvis ikke godt eller slet ikke i medierne)7. Molekylære metoder, såsom polymerasekædereaktion (PCR), er hurtigere og mere følsomme end dyrkningsbaserede metoder, men de giver ikke levedygtige isolater til yderligere karakterisering 8,9.
Immunologiske metoder er alternative og komplementære metoder til påvisning af campylobacter . Disse er hurtige, enkle og alsidige, men har også flere begrænsninger, herunder krydsreaktivitet (nogle antistoffer kan binde til ikke-Campylobacter-bakterier eller andre stoffer, der deler lignende antigener), lav specificitet (nogle antistoffer binder muligvis ikke til alle Campylobacter-stammer eller serotyper) og krav til prøveforberedelse (immunologiske metoder kræver ofte forbehandling af prøverne for at fjerne interfererende stoffer for at forbedre antistoffernes binding)10.
Inden for Campylobacter-slægten forårsager C. jejuni og C. coli de fleste campylobacterinfektioner hos mennesker (henholdsvis 81 % og 8,4 %)11. Begge er spiralformede, mikroaerofile og termofile bakterier, der indeholder et unipolært flagellum eller bipolær flagella. Rotation af et flagellum ved hver pol betragtes både som den primære drivkraft for dets karakteristiske proptrækkermotilitet og afgørende for dets patogenese, fordi det tillader bakterien at svømme gennem den viskøse slimhinde i værts-mave-tarmkanalen. Campylobacters bevægelighed styres af dets kemosensoriske system, der gør det muligt for cellerne at bevæge sig mod gunstige miljøer12,13. Baseret på Campylobacters cellemorfologi og fysiologiske egenskaber har nogle få undersøgelser anvendt membranfiltrering til isolering af Campylobacter spp. fra fækale og miljømæssige prøver 14,15,16.
Denne undersøgelse præsenterer en hurtig og robust protokol til isolering og efterfølgende påvisning af C. jejuni og C. coli fra råt kød, hvilket overvinder ulemperne ved de eksisterende metoder og giver flere fordele. Foreløbige kolonier kan bekræftes som Campylobacter spp. ved hjælp af en række forskellige metoder, såsom mikroskopi, biokemiske tests (fx katalase- og oxidaseaktivitetsassays) eller molekylære metoder6. Metoden identificerer isolaterne på artsniveau ved hjælp af et multiplex real-time PCR (mqPCR) assay, der er målrettet gener, der er unikke for C. jejuni og C. coli. Denne metode er relativt billig, hurtig og selektiv, hvilket gør den velegnet til brug i en række forskellige indstillinger, herunder fødevareforarbejdningsfaciliteter, kliniske laboratorier og forskningslaboratorier.
Protocol
Alt arbejde i forbindelse med denne protokol skal udføres i et biologisk sikkerhedsskab (BSC) for at opretholde aseptiske forhold og minimere risikoen for prøvekontaminering eller operatøreksponering for mikrobielle patogener. Når du overfører prøver uden for BSC, skal du bruge forseglede beholdere for at forhindre spild i tilfælde af utilsigtede dråber, hvilket opretholder prøvens integritet. Engangskomponenter bør fortrinsvis anvendes under hele proceduren for at mindske muligheden for krydskontaminering. I tilfælde, hvor engangsartikler ikke er mulige, skal du sørge for, at alt udstyr og materialer er sterile inden brug. Korrekt affaldshåndtering er afgørende. Alle brugte engangskomponenter skal kasseres som biofarligt affald. Autoklavematerialer inden kassering for at sikre korrekt sterilisering og undgå indeslutning af potentielt farlige materialer. Overholdelse af disse forholdsregler beskytter ikke kun prøvens integritet, men minimerer også risikoen for operatøreksponering for mikrobielle patogener. Figur 1 viser arbejdsgangen for prøveforberedelse, selektiv berigelse, filterbaseret isolering og mqPCR-differentiering af Campylobacter-arter . Supplerende fil 1 viser en mere detaljeret arbejdsgang og billeder gennem hele processen.
1. Tilberedning af kødprøver
- Erhvervelse af kødprøver
- Få forskellige friske kødpakker, herunder kyllingelår, vinger, trommestikker og lever fra lokale detailhandlere.
- Alle prøver overføres til opbevaring ved 4 °C og behandles senest 24 timer efter modtagelsen.
BEMÆRK: Opbevaring af de friske prøver ved lavere temperaturer, såsom under frysepunktet, vil påvirke gendannelsen.
- Behandling af kødprøver
- Følg forholdet mellem komponenter, der er foreskrevet i FSIS-prøveudtagningsretningslinje 6,17.
- Skær 450 g kyllingestykker fra hver pakning og læg dem i en mavepose (se Tabel over materialer).
BEMÆRK: Stomacherposer foreslås, fordi de har tilstrækkelig mekanisk styrke til at sikre downstream-processerne og ikke brister eller lækker. - Forbered bufret peptonvand (BPW).
- 20 g af pulveret (se materialetabel) opløses i 1 liter renset vand. Autoklave opløsningen ved 121 °C i 15 min. Fortynd opløsningen i sterilt vand til en koncentration på 0,1%.
- Tilsæt 200 ml 0,1% BPW til maveposen, der indeholder kyllingen.
- Massér/palper/palperer prøven manuelt fra ydersiden af maveposen i 2 min.
- Opsaml al kyllingeskylningen fra den filtrerede side af posen ved hjælp af en motoriseret pipetteregulator (se materialetabel).
- Fordel kyllingeskylningen i sterile centrifugeflasker. Der centrifugeres ved 10.000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten opsamles forsigtigt ved hjælp af en motoriseret pipetteregulator med en 25 ml serologisk engangspipette af plast. Undgå at forstyrre pelleten.
- Processen gentages efter behov for at sikre, at hele supernatanten fjernes.
- Den opsamlede supernatant kasseres.
2. Selektiv tilsætning af Campylobacter fra råt kød
- Tilberedning af Bolton Broth med kosttilskud
- 13,8 g pulver (se materialetabel) opløses i 500 ml renset vand. Steriliser bouillonen ved autoklavering i 15 minutter ved 121 °C.
- Tilsæt 25 ml laked hesteblod (se tabel over materialer) til den steriliserede 500 ml Bolton Broth.
BEMÆRK: Tilsætningen af hesteblod fungerer som et iltdæmpningsmiddel til at hjælpe med genopretning af skadede Campylobacter-celler fra fødevarematrixen. - Rekonstituér 1 hætteglas med antibiotikatilskud (cefoperazon, cycloheximid, trimethoprim og vancomycin, se materialetabel) i 5 ml 50% ethanol.
- Tilsæt det rekonstituerede antibiotikatilskud til Bolton Broth.
- Procedure for berigelse
- Resuspender pelleten i 50 ml Bolton Broth indeholdende laked hesteblod og antibiotika.
- Anbring prøver (med løsnede hætter) i en forseglet beholder, der opretholder en gasblanding på 85%N2, 10% CO2 og 5%O2.
- Sørg for, at hætten er løs, men beholderen er tæt forseglet for at producere Campylobacters mikroaerofile og termofile vækstkrav.
BEMÆRK: Gaspakker, der opretholder en atmosfære på 85%N2, 10% CO2 og 5%O2 , kan bruges, når miljøkamre ikke er tilgængelige. - Prøverne inkuberes ved 42 °C i 24 timer.
- Sørg for, at hætten er løs, men beholderen er tæt forseglet for at producere Campylobacters mikroaerofile og termofile vækstkrav.
3. Isolering og rensning af C. jejuni og C. coli fra rå kyllinger
- Fremstilling af Brucella agarplader
- 28 g Brucellapulver (se materialetabel) opløses i 1 liter renset vand. 15 g agar opløses i Brucella-opløsningen.
- Brucellaagaren steriliseres ved autoklavering i 15 minutter ved 121 °C. Blandingen af medium agar afkøles i et vandbad ved 55 °C.
- Hæld 20 ml Brucella agar i hver petriskål med en diameter på 100 mm.
- Filtermetode og kolonidyrkning
- Evaluer effekten af fugt på Campylobacter , der passerer gennem filtre ved tørring af Brucella-agarplader med låg åbnet i et biosikkerhedsskab i 0 timer, 1 time, 2 timer og 3 timer.
- Der fremstilles en kontrol uden filter ved direkte spredning af 80 μL af prøven på Brucella-agarpladen.
- Anbring et celluloseacetatfilter (0,45 μm eller 0,65 porestørrelse, se materialetabel) i midten af en Brucella-agarplade.
- Der pipetteres 4 dråber/filter og 20 μL/dråbe beriget prøve på filteret.
- Placer dråberne nær midten af filteret for at sikre, at væsken, der når pladen, går gennem filteret, ikke omkring filteret.
- Placer dråberne på en måde, der sikrer, at de ikke spredes og aggregeres.
- Inkuber dråber ved stuetemperatur i 15 minutter og fjern forsigtigt filtrene.
BEMÆRK: Dette trin giver Campylobacter-cellerne tilstrækkelig tid til at krydse membranen og nå agarmediet uden overdreven tørring. - Pladerne inkuberes ved 42 °C i ca. 24 timer under de ovenfor beskrevne mikroaerobe forhold.
- Vælg karakteristiske Campylobacter-kolonier med specifikke træk.
BEMÆRK: Campylobacterkolonier er typisk runde med glatte kanter, glitrende og gennemskinnelig gullig eller lyserød farve6. - Streak kolonier på Brucella agarplader til rensning. Gentag dette trin, indtil plader med en enkelt ensartet kolonimorfologi opnås.
- Forbered prøver til langtidsopbevaring.
- Forbered Bolton Broth som beskrevet tidligere. Tilføj en koloni fra pladen med ensartet kolonimorfologi.
- Voks natten over (24 timer) under mikroaerofile forhold beskrevet tidligere. Der tilsættes 900 μL af natkulturen til en 2 ml kryovial indeholdende 100 μL DMSO.
- Afkøles hurtigt i tøris-ethanolbad (ca. -72 °C) i 10 min. Overfør til en -80 °C fryser til langtidsopbevaring.
4. Identifikation af C. jejuni- og C. coli-arter
- Udfør artsniveau identifikation af C. jejuni og C. coli ved hjælp af et multiplex qPCR (mqPCR) assay, der tidligere er udviklet18,19.
- Udfør hurtig cellelyse og genomisk DNA-ekstraktion i et 96-brønds pladeformat.
BEMÆRK: Det anbefales kraftigt at overveje at bruge kommercielle kits (se materialetabellen) for at sikre, at prøven er tilstrækkeligt fri for kendte PCR-hæmmere.- Oprensede Campylobacter-kolonier opløses i 100 μL ekstraktionsopløsning.
- Lysprøver lyser ved 99 °C i 10 minutter efterfulgt af afkøling ved 20 °C i 2 minutter i en termocyklist.
- Pladen centrifugeres ved 8.000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Der fjernes 2 μl delprøver af supernatanten til mqPCR-assayet.
- Forbered en 20 μL reaktionsblanding bestående af 10 μL 2x Master Mix, 2,0 μL DNA-prøve, 104 kopier af IAC-skabelonen (Internal Amplification Control) og 200 nM af hver primer og sonde (se materialetabellen).
BEMÆRK: Primere og sonder af hipO og cdtA er de eksklusive målgener for henholdsvis C. jejuni og C. coli. IAC består af et 79-bp DNA-segment af det humane adenovirus og er inkluderet som en positiv kontrol for at sikre ensartet aktivitet af DNA-polymerase på tværs af alle prøver.
- Læg alle prøver i tre eksemplarer i en 96-brønds optisk plade dækket med en optisk film og læg dem i et PCR-system i realtid (se materialetabel).
- Der indledes en varmstartaktivering af DNA-polymerasen ved 95 °C i 10 minutter. Derefter følges op med 40 cyklusser med denaturering ved 95 °C i 15 sek. og udglødning/forlængelse ved 60 °C i 1 min.
- Udfør hurtig cellelyse og genomisk DNA-ekstraktion i et 96-brønds pladeformat.
5. Optælling af cellesuspensioner
- Cellesuspensioner tælles ved hjælp af en 6 x 6 dråbepladeprocedure20. Se supplerende fil 1 for billeder, der viser 6 x 6 dråbeplademetoden.
- Lufttør Brucella agarplader med låget af i en laminar strømningshætte i 45 min.
- Der tilsættes 200 μL bakteriel suspension til seks rækker (A-F) i den første kolonne i en plade med 96 huller.
- 180 μL Brucella-medium fordeles over seks rækker i de resterende kolonner (2-12).
- Forbered ti gange serielle fortyndinger ved hjælp af 20 μL overførsler.
- Overfør f.eks. 20 μL prøve fra kolonne et til kolonne to. Gentag denne proces i mindst 6 kolonner.
- Tilbagesvaling blandes ti gange ved hjælp af pipetten, og spidserne skiftes mellem hver overførsel.
- Brug en multikanalpipette til at aflejre 7 μL dråber fra seks rækker af en søjle på overfladen af en Brucella agarplade.
- Gentag for at oprette et 6 x 6-system, der sikrer, at rækker er tekniske replikater på tværs af kolonner.
- Lufttør pladerne i 5 min, og vend derefter pladen på hovedet. Der inkuberes plader ved 42 °C i 24 timer.
- Tæl antallet af kolonier i hver repræsentativ fortynding.
Representative Results
Effekt af fugt i Brucella agarplader til passiv filtrering af Campylobacter
Campylobacter har et lille genom og mangler flere stressresponsgener, der almindeligvis forekommer i andre bakterier, såsom E. coli O157: H7 og Salmonella. Derfor er det mere følsomt over for forskellige miljøbelastninger og tåler ikke dehydrering eller omgivende iltniveauer. Omvendt kan et alt for fugtigt agarmedium oversvømme filteret. Dette forårsager ikke kun diffusion af prøven uden for filteret, men øger også eksponeringstiden for ilt21.
For at bestemme de passende betingelser for filterbaseret isolering af Campylobacter blev Brucella-agarplader tørret med lågene fjernet i 0 timer, 1 time, 2 timer og 3 timer inde i et biologisk sikkerhedsskab og vurderet for Campylobacter-cellernes effektivitet til at krydse et 0,65 μm porestørrelsesfilter. Fire 20 μL alikvoter af C. jejuni S27 kulturer i koncentrationerne 1,53 x 104 og 1,53 x 105 CFU/ml blev pipetteret på hver filtermembran, der var blevet anbragt oven på en Brucella-plade. Efter 15 minutters penetration blev filtre fjernet, og plader blev inkuberet natten over for cellevækst.
Celler fra 5 replikerede plader blev derefter talt og noteret i tabel 1. Resultaterne viste, at agarpladerne tørrede i 2 timer og 3 timer fungerede på samme måde med næsten lige mange celler genvundet fra passiv filtrering. Det bemærkes, at pladerne, der tørrede under disse betingelser i 0 timer og 1 time, ikke tillod celler at krydse membranen fuldt ud inden for den anvendte periode på 15 minutter.
Sammenligning af forskellige porestørrelsesfiltermembraner til isolering af Campylobacter fra kyllingelever
I betragtning af Campylobacter-cellestørrelserne (0,5-5 μm i længden og 0,2-0,9 μm i bredden) og en lang række fødevarepartikelstørrelser blev celluloseacetatfiltre med 0,45 μm og 0,65 μm porestørrelser testet for effektiviteten af Campylobacter-passage , når de fik en 15 minutters inkubationstid. Fødevareprøver bestående af 450 g kyllingelever tilsat 153 CFU C. jejuni og derefter beriget natten over blev brugt til forsøget. Som en kontrol uden filter blev direkte plettering af berigelsesprøven inkluderet parallelt. Resultaterne (figur 2) fra 5 replikate plader viste konsekvent, at 0,65 μm porestørrelsesfilteret tillod flere celler at krydse end 0,45 μm porestørrelsesfiltre, hvilket resulterede i stigninger på ~ 29 gange flere opnåede celler. Filteret med en porestørrelse på 0,45 μm tilbageholdt for mange celler på oversiden af filteret, hvilket resulterede i en signifikant lavere genvinding af Campylobacter fra fødevarer sammenlignet med filteret med porestørrelse på 0,65 μm. Som forventet voksede der en græsplæne med forskellige baggrundsorganismer på kontrolpladerne uden filter.
Anvendelse af passiv filtrering i Campylobacter-isolering fra detailkylling
På grund af Campylobacter-cellernes usædvanlige bevægelighed blev den passive filtreringsteknik valgt til isolering af C. jejuni og C. coli fra detailkødprodukter, som typisk er forurenet med adskillige baggrundsorganismer. Mellem årene 2014-2023 blev i alt 79 pakker med råt kød, herunder forskellige dele af kyllingekød, kyllingelever, oksekødlever og kalvelever, indsamlet fra forskellige lokale supermarkeder. Fra hver pakning blev der udtaget prøver af 450 g til isolering af Campylobacter spp. Ved at kombinere selektiv berigelse af Campylobacter i blodholdig Bolton-bouillon og passiv filtrering af cellerne gennem et 0,65 μm porestørrelse celluloseacetatfilter direkte på en Brucella-agarplade er 49 Campylobacter-stammer med succes blevet isoleret fra 79 kødprøver (tabel 2). Figur 3 viser resultatet af isolering af en ny Campylobacter-stamme fra kyllingelever. Metoden har gentagne gange vist sig at være følsom, specifik og omkostningseffektiv.
Identifikation og differentiering af C. jejuni- og C. coli-isolater
For at verificere slægten og differentiere arten af Campylobacter-isolater opnået fra råt kød blev der anvendt et multiplex qPCR-assay, der forstærkede de specifikke genmål (hipO og cdtA) for C. jejuni og C. coli, og en intern amplifikationskontrol (IAC). IAC blev inkluderet som en falsk-negativ indikator i den samtidige amplifikation af flere gener. Assayet blev implementeret i et 96-brønds format med hurtig cellelyse og DNA-ekstraktion under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt reagens (se materialetabel). Tabel 2 opsummerer resultatet af artsidentifikation af C. jejuni - og C. coli-stammerne . Som yderligere verifikation bekræftede helgenomsekventeringsresultaterne arten af alle isolaterne (data ikke vist).
Figur 1: Et arbejdsgangsdiagram til isolering og identifikation af Campylobacter-arter fra detailkød. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Filterstørrelsens betydning for genvinding af Campylobacter. Resultaterne indikerer, at 0,65 μm-filteret i gennemsnit kan genvinde 900 ± 138 kolonier, mens 0,45 μm-filteret genvinder 31 ± 7 kolonier. Resultaterne blev genereret fra N = 20 (5 plader med 4 dråber / plade), og en studerendes t-test indikerer, at middelværdierne er statistisk forskellige (p < 0,0001). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Dyrkning af campylobacter ved passiv filtrering af prøver af beriget fjerkræ. (A) Viser de fire dråber 20 μl beriget prøve, der er deponeret på nitrocellulosemembranfilteret. Billedet blev indsamlet i løbet af de 15 minutters passiv filtrering. (B) Afbilder pladen, efter at nitrocellulosefilteret er fjernet. De fire pletter angiver, hvor den berigede prøve krydsede membranen. (C) Afbilder pladen efter 24 timers inkubation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Virkningen af tørretiden for Brucella agarplader på passiv filtrering af C. jejuni. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: C. jejuni og C. coli-stammer isoleret fra råt kød. I perioden fra 2008 til 2023 blev 36 C. jejuni og 13 C. coli-stammer isoleret fra 79 kødpakker på tværs af 24 unikke detailprodukter. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende fil 1: Billeder gennem isolations- og optællingsprocesserne. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Protokollens betydning
C. jejuni og C. coli var de to vigtigste arter af Campylobacter, der blev fundet udbredt hos fjerkræ22 og dyrelever23,24. I denne undersøgelse blev kødprøverne af kyllingedele (ben, vinger og lår), kyllingelever og oksekødlever tilfældigt indsamlet i forskellige tidsperioder og fra forskellige detailbutikker og producenter til isolering af Campylobacter spp. Af de i alt 49 Campylobacter-stammer, der blev isoleret, blev 36 identificeret som C. jejuni og 13 var C. coli, uden at der blev fundet andre Campylobacter-arter, hvilket er i overensstemmelse med andre rapporter25.
Analysen er baseret på den spiralformede cellemorfologi og karakteristiske proptrækkerlignende bevægelighed af Campylobacter spp. En simpel, men effektiv, passiv filtreringsteknik 26,27, der udnyttede sin spiralformede cellemorfologi (lang, slank, 0,2-0,9 x 0,5-5 μm) og stærk proptrækkermotilitet blev brugt til at adskille Campylobacter fra en blanding af baggrundsorganismer. Campylobacters høje bevægelighed tillod cellerne at krydse membranfiltrene og bevæge sig mod gunstige forhold, der findes i agarmediet, mens andre baggrundsmikroorganismer fra kødprodukterne ikke kunne passere igennem. Denne metode er relativt billig, hurtig og selektiv, hvilket gør den velegnet til brug i en række forskellige indstillinger, herunder fødevareforarbejdningsfaciliteter, kliniske laboratorier og forskningslaboratorier.
En banebrydende artikel, der ofte citeres, siger, at 0,45 μm-filteret fungerede så godt, at 0,65 μm ikke blev evalueret28. Resultaterne fra denne undersøgelse indikerer, at 0,65 μm porestørrelsesfilteret klarede sig signifikant bedre end 0,45 μm porestørrelsen, hvilket resulterede i en 29 gange stigning i antallet af celler, der blev genvundet fra berigelsen. Dette er vigtigt, fordi de valgte filtre ikke viser reduceret selektivitet som tidligere rapporteret29. Da det endvidere er kendt, at filtrering vil reducere mængden af genvundet Campylobacter betydeligt sammenlignet med direkte plettering30, forbedrer forøgelsen af porens størrelse genopretningen af mikroorganismen, hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporterede fund21. Dette er signifikant, fordi alle de celler, der krydsede filtrene, dannede ensartede Campylobacter-kolonier , hvilket indikerer, at begge filtre var tilstrækkelige til at forhindre andre mikroflora og fødepartikler i at passere igennem. Derudover bemærker FSIS-flowchart7 potentialet for udvidet resultatproduktion på grund af re-stribede isolater på Campy-Cefex-plader, der indeholder antibiotika. I modsætning hertil har protokollen beskrevet i dette manuskript, som kombinerer brugen af filtrering og selektiv berigelse med cefoperazon, cycloheximid, trimethoprim og vancomycin, ikke nødvendiggjort re-streaking.
Den nuværende anvendte metode er i overensstemmelse med de nuværende FSIS-prøveudtagnings- og verifikationsprogrammer17. Da niveauet af Campylobacter-kontaminering kan være lavt (153 CFU/450 g kylling), centrifugeres skylningen for at koncentrere prøven med en faktor fire, hvilket øger analysens følsomhed. Efter koncentrering af skyllevandet med en faktor på 4x beriges prøverne i 48 timer og screenes med Molecular Detection System (MDS) for at replikere den metode, der anvendes af FSIS-laboratorier (data ikke vist). Navnlig har den beskrevne metode endnu ikke kunnet identificere positive stammer inden for 24 timer, der blev påvist af det molekylære detektionssystem ved hjælp af 48 timers berigelse (data ikke vist). Endelig er en yderligere fordel ved denne protokol, at den kan give information relateret til bakteriearterne og identificere, om Campylobacter er C. coli, C. jejuni eller C. lari, mens MDS vedtaget i MLG 41.07 kun kan give et binært positivt / negativt svar for Campylobacter.
Kritiske trin
Protokollen for Campylobacter-isolering og -identifikation kræver præcision under centrifugering, filtrering og molekylær analyse. Nøjagtige fortyndinger, korrekte inkubationsbetingelser og omhyggelig overholdelse af qPCR-analysebetingelser er afgørende for pålidelig artsidentifikation.
Som en mikroaerofil bakterie er Campylobacter meget skrøbelig og følsom over for forskellige miljøbelastninger og kræver unikke kræsne betingelser for vækst 31,32,33. I fødevareprøver, der typisk gennemgår lange perioder med transport og opbevaring, er mange Campylobacter-celler måske i dvale eller sublethal/dødelig skadet tilstand34,35. Det er således vigtigt at genvinde de stressede celler fra deres madmatricer og vokse dem til en højere koncentration. I det første trin af proceduren brugte vi Bolton Broth suppleret med laked hesteblod og antibiotika til selektiv berigelse af Campylobacter fra mad. Tilsætningsblodet fungerede som et iltdæmpningsmiddel til at overvinde de negative virkninger af frie iltradikaler36. Antibiotika blev brugt til at hæmme væksten af baggrundsmikroflora37.
For at minimere Campylobacters eksponeringstid for omgivende atmosfærisk ilt blev der valgt en inkubationsperiode på 15 minutter for at give cellerne mulighed for at krydse filteret. Også fugtigheden af Brucella-agarpladen under filteret spillede en vigtig rolle i passagehastigheden. Specifikt antydede resultaterne fra test af agarplader tørret i 0 timer, 1 time, 2 timer og 3 timer, at et højt fugtindhold i filteret forhindrede celler i at passere igennem. Lige så kritisk er den præcise placering af filtre og dråber på pladerne og filtrene, som begge påvirker succesen med at isolere celler.
Potentielle faldgruber og begrænsninger
Mens der præsenteres en struktureret tilgang til isolering og identifikation af Campylobacter-arter fra rå kyllingprøver, fortjener flere begrænsninger i denne protokol opmærksomhed. Ekstern kontaminering, utilstrækkeligt tørrede plader, tilstopning af filtre, der hindrer mikrobiel bevægelse, indfangning af mikroorganismerne i pelleten, ufuldstændig forsegling af det atmosfæriske kammer og dråber, der spredes ud over filtergrænser, er blandt de primære faldgruber.
Utilstrækkelig adskillelse af mikroorganismerne fra fødevareoverfladerne eller indeslutning af dem i hovedparten af prøven kan hindre deres isolering ved hjælp af denne metode. Derudover udgør afhængighed af mikrobiel motilitet til passage gennem passive filtre en bemærkelsesværdig begrænsning; det er muligt, at filtermembranerne bevarede nogle mindre bevægelige Campylobacter-stammer , da det har vist sig, at filtre kan reducere fangsteffektiviteten af mikrobielle patogener i fødevarer38. Yderligere begrænsninger omfatter batchkarakteren af centrifugerings- og filtreringsprocesser, modtagelighed for filtertilstopning og ineffektivitet ved dispergering af den dannede pellet, hvilket vil påvirke nøjagtigheden af mikrobielle belastninger. Disse begrænsninger understreger kollektivt behovet for forsigtighed og supplerende metoder til at sikre omfattende analyse, især når man beskæftiger sig med forskellige prøvetyper eller søger kapacitet med høj kapacitet.
Forslag til fejlfinding
For at foregribe potentielle problemer skal du først sikre, at alle materialer overholder de nødvendige kvalitetsstandarder og ikke er udløbet. Fejlfinding af tilstoppede filtre ved potentielt at anvende en ekstra filtrering for at fjerne eventuelle store forurenende stoffer, der kan begrænse Campylobacterens passage gennem nitrocellulosemembranen. Hvis der observeres kontaminering, skal det kontrolleres, at dråberne ikke blev placeret for tæt på filterkanten og tillod væske at nå agaren ved at gå rundt om filteret i modsætning til gennem porerne. Hvis der ikke er tilstrækkelig vækst efter berigelse, skal du kontrollere, at tætningerne på de atmosfæriske beholdere er tætte og ikke lækker.
Potentiel forbedring og udvidelse
Udforskning af alternative filtermaterialer kan forbedre mikrobiel passage og gøre det muligt at udvide denne protokol til brug ved isolering af andre bevægelige mikroorganismer fra heterogene blandinger såsom fødevarer. Det anbefales at identificere kontroller for at bevare mindre bevægelige Campylobacter-varianter uden at påvirke specificiteten negativt. Derudover, mens det multipleksede qPCR-assay, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev påvist at have evnen til at detektere C.lari18 , kan andre Campylobacter-arter af interesse inkluderes i dette assay.
Sammenfattende blev der gennem evaluering af forskellige parametre og indstillinger fastlagt passende betingelser for filterbaseret isolering og artsniveau identifikation af C. jejuni og C. coli fra fødevarer. Metoden har vist sig at være følsom, specifik, robust og omkostningseffektiv. Ved at anvende det på rigtige fødevareprøver var protokollen i stand til at isolere 36 C. jejuni og 13 C. coli-stammer fra 79 kødpakker.
Protokollen er tilpasset FSIS-direktiv 10,250.117, der skitserer proceduren for prøveudtagning af rå kyllingedele, og MLG 41.076 til isolering og identifikation af Campylobacter. Dataene tyder på, at koncentrering af prøven med 4x og berigelse i 24 timer kombineret med filtrering og plettering giver isolerede, bekræftede kolonier inden for 48 timer i modsætning til 96 timer. Protokollen er kompatibel med DNA-baserede metoder såsom genomsekventering for at give en omfattende karakterisering af Campylobacter-stammer , herunder deres antimikrobielle resistensprofiler, virulensforudsigelser og fylogenetiske forhold. Protokollen udgør et lovende alternativ til effektiv genopretning og isolering af Campylobacter spp. fra rå fjerkræ, hvilket kan lette epidemiologiske undersøgelser og folkesundhedsinterventioner.
Disclosures
Alle forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af US Department of Agriculture, Agricultural Research Service (USDA-ARS), National Program 108, Current Research Information System numre 8072-42000-093 og 8072-42000-094-000-D. Omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter i denne artikel er udelukkende med det formål at give specifikke oplysninger og indebærer ikke anbefaling eller godkendelse fra det amerikanske landbrugsministerium. USDA er en udbyder og arbejdsgiver med lige muligheder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar - Solidifying Agent (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 281230 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | JL602-G/L | Equipment |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S | Equipment |
| Antibiotic supplements cefoperazone, cycloheximide, trimethoprim, vancomycin | Oxoid Ltd. | SR0183E | |
| Atmosphere Control Gas Pak (Campy, 85% N2, 10% CO2, and 5% O2) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260680 | |
| Atmosphere Control Vessel, GasPak EZ CampyPak container system | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260678 | |
| Autoclave - Amsco Lab250, Laboratory Steam Sterilizer | Steris plc | LV-250 | Equipment |
| Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+ | Labconco Corporation | 302411101 | Equipment |
| Bolton broth | Oxoid Ltd. | CM0983 | |
| Brucella broth (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 211088 | |
| Buffered Peptone Water | Bio-Rad Laboratories Inc. | 3564684 | |
| Centrifuge Microcentrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 | Equipment |
| Centrifuge, Avanti J-25 | Beckman Coulter, Inc. | Equipment | |
| Chicken thighs, wings, drumsticks, livers | Local retailers | ||
| DNA Extraction - PreMan Ultra Sample Preparation Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4318930 | |
| FAM probe for hipO (Sequence 5'-TTGCAACCTCACTAGCAAAATCC ACAGCT-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Filter - 0.45 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | DAWP04700 | |
| Filter - 0.65 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | HAWG04700 | |
| forward primer for cdtA (Sequence 5'-TGTCAAACAAAAAACACCAAGCT T-3' ') |
Integrated DNA Technologies | ||
| forward primer for hipO (Sequence 5'-TCCAAAATCCTCACTTGCCATT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| forward primer for IAC (Sequence 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| HEX probe for cdtA (Sequence 5'-AAAATTTCCCGCCATACCACTTG TCCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Incubator - Inova 4230 refrigerated incubator shaker | New Brunswick Scientific | 4230 | Equipment |
| Inoculating Loop - Combi Loop 10µL and 1µL | Fisher Scientific International, Inc | 22-363-602 | |
| Internal Amplification Control (IAC) DNA fragment (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTAT GTGGTGGCATTGTCTTCTCCC GTTGTAACTATCCACTGAGATG TGTTAGGCGCGCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Laked horse blood | Remel Inc. | R54072 | |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Mettler Toledo | 17014382 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | Mettler Toledo | 17014384 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | Mettler Toledo | 17014388 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Mettler Toledo | 17014391 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Mettler Toledo | 17014392 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Mettler Toledo | 17013805 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+ | Mettler Toledo | 17013803 | Equipment |
| Media Storage Bottle -PYREX 1 L Square Glass Bottle, with GL45 Screw Cap | Corning Inc. | 1396-1L | Equipment |
| Media Storage Bottle -PYREX 2 L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw Cap | Corning Inc. | 1397-2L | Equipment |
| Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34 cm2, sterile, 108/cs | MilliporeSigma | Z707902 | |
| Mixer - Vortex Genie 2 | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | Equipment |
| Motorized pipette controller, PIPETBOY2 | INTEGRA Biosciences Corp. | Equipment | |
| PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4369542 | |
| Petri Dish Rotator - bioWORLD Inoculation Turntable | Fisher Scientific International, Inc | 3489E20 | Equipment |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm) | Fisher Scientific International, Inc | FB0875713 | |
| Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8 | Mettler Toledo | 30389273 | |
| Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10 | Mettler Toledo | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10 | Mettler Toledo | 30389276 | |
| Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettors | Thermo Fisher Scientific Inc. | 8093-11 | |
| Realtime PCR - 7500 Real-Time PCR system | (Applied Biosystems, Foster City, CA) | Equipment | |
| reverse primer for cdtA (Sequence 5'-CCTTTGACGGCATTATCTCCTT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| reverse primer for hipO (Sequence 5'-TGCACCAGTGACTATGAATAACG A-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| reverse primer for IAC (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA -3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170356N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170372N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170357N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170376N | |
| Spreader - Fisherbrand L-Shaped Cell Spreaders | Fisher Scientific International, Inc | 14-665-230 | |
| Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter Bags | Thermo Fisher Scientific Inc. | 01-812 | |
| TAMRA probe for IAC (Sequence 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCC ACCA-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700) | Applied Biosystems | Equipment | |
| Water Filtration - Elga Veolia Purelab Flex | Elga LabWater | PF2XXXXM1-US | Equipment |
References
- Rushton, S. P., et al. Climate, human or environment: Individual-based modelling of Campylobacter seasonality and strategies to reduce disease burden. J Transl Med. 17 (1), 34 (2019).
- Facciolà, A., et al. Campylobacter: From microbiology to prevention. J Prev Med Hyg. 58 (2), E79-E92 (2017).
- Perez-Arnedo, I., Gonzalez-Fandos, E. Prevalence of Campylobacter spp. In poultry in three spanish farms, a slaughterhouse and a further processing plant. Foods. 8 (3), 111 (2019).
- Nachamkin, I., Allos, B. M., Ho, T. Campylobacter species and guillain-barré syndrome. Clin Microbiol Rev. 11 (3), 555-567 (1998).
- Department of Food Administration.
- USDA Office of Public Health Science. Isolating and identifying Campylobacter jejuni/coli/lari from poultry rinsate, sponge and raw product samples. Microbiology Laboratory Guidebook. , (2022).
- Singh, H., Rathore, R. S., Singh, S., Cheema, P. S. Comparative analysis of cultural isolation and PCR based assay for detection of Campylobacter jejuni in food and faecal samples. Braz J Microbiol. 42 (1), 181-186 (2011).
- Kralik, P., Ricchi, M. A basic guide to real time pcr in microbial diagnostics: Definitions, parameters, and everything. Front Microbiol. 8, (2017).
- Linton, D., Lawson, A. J., Owen, R. J., Stanley, J. PCR detection, identification to species level, and fingerprinting of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli direct from diarrheic samples. J Clin Microbiol. 35 (10), 2568-2572 (1997).
- Kabiraz, M. P., Majumdar, P. R., Mahmud, M. M. C., Bhowmik, S., Ali, A. Conventional and advanced detection techniques of foodborne pathogens: A comprehensive review. Heliyon. 9 (4), e15482 (2023).
- Kaakoush, N. O., Castaño-Rodríguez, N., Mitchell, H. M., Man, S. M.
- Gilbreath, J. J., Cody, W. L., Merrell, D. S., Hendrixson, D. R. Change is good: Variations in common biological mechanisms in the epsilonproteobacterial genera Campylobacter and Helicobacter. Microbiol Mol Biol Rev. 75 (1), 84-132 (2011).
- Lertsethtakarn, P., Ottemann, K. M., Hendrixson, D. R. Motility and chemotaxis in campylobacter and helicobacter. Annu Rev Microbiol. 65, 389-410 (2011).
- Jokinen, C. C., et al. An enhanced technique combining pre-enrichment and passive filtration increases the isolation efficiency of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from water and animal fecal samples. J Microbiol Methods. 91 (3), 506-513 (2012).
- Engberg, J., On, S. L., Harrington, C. S., Gerner-Smidt, P. Prevalence of Campylobacter, Arcobacter, Helicobacter, and Sutterella spp. In human fecal samples as estimated by a reevaluation of isolation methods for Campylobacters. J Clin Microbiol. 38 (1), 286-291 (2000).
- Lastovica, A. J., Le Roux, E. Efficient isolation of campylobacteria from stools. J Clin Microbiol. 38 (7), 2798-2799 (2000).
- USDA. Salmonella and Campylobacter verification program for raw poultry products. FSIS Directive 10250.1. 10000 Series: Laboratory Services. USDA. , (2021).
- He, Y., et al. Simultaneous detection and differentiation of Campylobacter jejuni, c. Coli, and c. Lari in chickens using a multiplex real-time PCR assay. Food Anal Methods. 3, 321-329 (2010).
- Suo, B., He, Y., Tu, S. -I., Shi, X. A multiplex real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of salmonella spp., escherichia coli o157, and listeria monocytogenes in meat products. Foodborne Pathog Dis. 7 (6), 619-628 (2010).
- Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. A 6 x 6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, listeria monocytogenes, and escherichia coli. J Microbiol Methods. 55 (2), 475-479 (2003).
- Speegle, L., Miller, M. E., Backert, S., Oyarzabal, O. A. Use of cellulose filters to isolate Campylobacter spp. From naturally contaminated retail broiler meat. J Food Prot. 72 (12), 2592-2596 (2009).
- Guirin, G. F., Brusa, V., Adriani, C. D., Leotta, G. A. Prevalence of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from broilers at conventional and kosher abattoirs and retail stores. Rev Argent Microbiol. 52 (3), 217-220 (2020).
- Noormohamed, A., Fakhr, M. K. A higher prevalence rate of Campylobacter in retail beef livers compared to other beef and pork meat cuts. Int J Environ Res Public Health. 10 (5), 2058-2068 (2013).
- Walker, L. J., et al. Prevalence of Campylobacter coli and Campylobacter jejuni in retail chicken, beef, lamb, and pork products in three Australian states. J Food Prot. 82 (12), 2126-2134 (2019).
- Zhao, C., et al. Prevalence of Campylobacter spp., Escherichia coli, and Salmonella serovars in retail chicken, turkey, pork, and beef from the greater Washington, D.C., area. Appl Environ Microbiol. 67 (12), 5431-5436 (2001).
- Honsheng, H., Manuel Mariano, G. Campylobacter. Guillermo, T. -I., Saeed, E. -A. , IntechOpen. Rijeka. (2022).
- He, Y., et al. Rapid identification and classification of Campylobacter spp. using laser optical scattering technology. Food Microbiol. 47, 28-35 (2015).
- Steele, T. W., Mcdermott, S. N. The use of membrane filters applied directly to the surface of agar plates for the isolation of Campylobacter jejuni from feces. Pathology. 16 (3), 263-265 (1984).
- Bourke, B., Chan, V. L., Sherman, P.
- Berrang, M. E., Meinersmann, R. J., Cox, N. A. Passage of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli subtypes through 0.45- and 0.65-micrometer-pore-size nitrocellulose filters. J Food Prot. 80 (12), 2029-2032 (2017).
- Hill, G. N., et al. Optimizing enrichment of Campylobacter on poultry. J App Poult Res. 26 (3), 307-315 (2017).
- Kim, J. C., Oh, E., Kim, J., Jeon, B. Regulation of oxidative stress resistance in Campylobacter jejuni, a microaerophilic foodborne pathogen. Front Microbiol. 6, 751 (2015).
- Nennig, M., et al. Metaphenotypes associated with recurrent genomic lineages of Campylobacter jejuni responsible for human infections in luxembourg. Front Microbiol. 13, (2022).
- Moore, J. E. Bacterial dormancy in Campylobacter: Abstract theory or cause for concern. Int J Food Sci Technol. 36 (6), 593-600 (2001).
- Saha, S., Saha, S., Sanyal, S. Recovery of injured Campylobacter jejuni cells after animal passage. Appl Environ Microbiol. 57 (11), 3388-3389 (1991).
- Baylis, C. L., Macphee, S., Martin, K. W., Humphrey, T. J., Betts, R. P. Comparison of three enrichment media for the isolation of Campylobacter spp. From foods. J Appl Microbiol. 89 (5), 884-891 (2000).
- Line, J. E. Development of a selective differential agar for isolation and enumeration of Campylobacter spp. J Food Prot. 64 (11), 1711-1715 (2001).
- Armstrong, C. M., et al. Impacts of clarification techniques on sample constituents and pathogen retention. Foods. 8 (12), 636 (2019).
