Summary
العطيفة هي السبب الرئيسي لالتهاب المعدة والأمعاء البكتيري المنقول بالغذاء في جميع أنحاء العالم. على الرغم من أن المؤسسات تسن تدابير للحد من الانتشار في جميع أنحاء منشآتها ، فإن المنتجات الملوثة تصل باستمرار إلى المستهلكين. تعالج التقنية التي تم تطويرها على مدار الاثني عشر عاما الماضية قيود الطرق الحالية لعزل واكتشاف العطيفة spp. من اللحوم النيئة.
Abstract
تقدم هذه المقالة بروتوكولا سريعا وقويا لعزل العطيفة spp. من اللحوم النيئة ، مع التركيز بشكل خاص على العطيفة الصائمية والعطيفة القولونية. يعتمد البروتوكول على الأساليب المعمول بها ، مما يضمن التوافق مع التقنيات السائدة التي تستخدمها الهيئات التنظيمية مثل إدارة الغذاء والدواء (FDA) ووزارة الزراعة الأمريكية (USDA) في الولايات المتحدة الأمريكية ، وكذلك المنظمة الدولية للتوحيد القياسي (ISO) في أوروبا. من الأمور المركزية في هذا البروتوكول جمع الشطف ، الذي يتركز ويعاد تعليقه في وسائط مرق بولتون التي تحتوي على دم الحصان. وقد ثبت أن هذه الوسيلة تسهل استعادة خلايا العطيفة المجهدة وتقلل من مدة التخصيب المطلوبة بنسبة 50٪. ثم يتم نقل العينات المخصبة إلى أغشية النيتروسليلوز على ألواح البروسيلا. لتحسين حساسية وخصوصية الطريقة ، تم تقييم أغشية مرشح بحجم المسام 0.45 ميكرومتر و 0.65 ميكرومتر. كشفت البيانات عن زيادة بمقدار 29 ضعفا في استعادة الخلايا باستخدام مرشح حجم المسام 0.65 ميكرومتر مقارنة بحجم المسام 0.45 ميكرومتر دون التأثير على الخصوصية. تسمح الخصائص عالية الحركة للكامبيلوباكتر للخلايا بالتحرك بنشاط عبر مرشحات الغشاء نحو وسط الآجار ، مما يتيح عزلا فعالا لمستعمرات العطيفة النقية. ويشتمل البروتوكول على مقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي المتعدد في الوقت الحقيقي (mqPCR) لتحديد العزلات على مستوى الأنواع. توفر هذه التقنية الجزيئية وسيلة موثوقة وفعالة لتحديد الأنواع. أظهرت التحقيقات التي أجريت على مدى السنوات الاثني عشر الماضية والتي شملت بيع اللحوم بالتجزئة قدرة هذه الطريقة على تعزيز استعادة العطيفة من عينات اللحوم الملوثة طبيعيا مقارنة بالطرق المرجعية الحالية. علاوة على ذلك ، يتميز هذا البروتوكول بوقت إعداد ومعالجة أقل. نتيجة لذلك ، فإنه يقدم بديلا واعدا للاسترداد الفعال للكامبيلوباكتر من اللحوم. علاوة على ذلك ، يمكن دمج هذا الإجراء بسلاسة مع الأساليب القائمة على الحمض النووي ، مما يسهل الفحص السريع للعينات الإيجابية جنبا إلى جنب مع تحليل تسلسل الجينوم الكامل الشامل.
Introduction
العطيفة spp. هي السبب الرئيسي لالتهاب المعدة والأمعاء البكتيري المنقول بالغذاء في جميع أنحاء العالم ، مع ما يقدر بنحو 800 مليون حالة سنويا1. كبكتيريا حيوانية المنشأ رئيسية ، تستعمر العطيفة بشكل طبيعي المسالك المعدية المعوية لمجموعة واسعة من ، بما في ذلك الطيور البرية المزرعة الأليفة2. أثناء الذبح أو معالجة الأغذية ، العطيفة النيابة. كثيرا ما تلوث الذبائح أو منتجات اللحوم3. عادة ما يرتبط داء العطيفة باستهلاك الدواجن غير المطبوخة جيدا أو التلوث المتبادل للأطعمة الأخرى بواسطة عصائر الدواجن النيئة2. يمكن أن يسبب مضاعفات خطيرة ، مثل متلازمة غيلان باريه ، والتهاب المفاصل التفاعلي ، وتسمم الدم لدى الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة4. يعد الكشف عن العطيفة وعزلها عن مصادر الغذاء ، وخاصة منتجات الدواجن ، أمرا ضروريا لترصد الصحة العامة والتحقيق في الفاشيات وتقييم المخاطر.
الطرق التقليدية القائمة على الثقافة هي الطرق التقليدية والقياسية للكشف عن العطيفة 5,6. ومع ذلك ، هناك العديد من القيود ، بما في ذلك أوقات الحضانة الطويلة (48 ساعة أو أكثر) ، والحساسية المنخفضة (تصل إلى 50٪) ، وليست شاملة لجميع السلالات (قد لا تنمو بعض خلايا العطيفة المجهدة بشكل جيد أو على الإطلاق في الوسائط)7. الطرق الجزيئية ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، أكثر سرعة وحساسية من الطرق القائمة على الثقافة ، لكنها لا توفر عزلات قابلة للتطبيق لمزيد من التوصيف 8,9.
الطرق المناعية هي طرق بديلة وتكميلية للكشف عن العطيفة . هذه سريعة وبسيطة ومتعددة الاستخدامات ، ولكن لها أيضا العديد من القيود ، بما في ذلك التفاعل المتبادل (قد ترتبط بعض الأجسام المضادة بالبكتيريا غير العطيفة أو غيرها من المواد التي تشترك في مستضدات مماثلة) ، وخصوصية منخفضة (قد لا ترتبط بعض الأجسام المضادة بجميع سلالات العطيفة أو الأنماط المصلية) ، ومتطلبات تحضير العينات (غالبا ما تتطلب الطرق المناعية معالجة مسبقة للعينات لإزالة المواد المتداخلة لتعزيز ارتباط الأجسام المضادة)10.
ضمن جنس العطيفة ، تسبب C. jejuni و C. coli معظم عدوى العطيفة البشرية (81٪ و 8.4٪ على التوالي)11. كلاهما بكتيريا حلزونية الشكل ، محبة للحرارة ، ومحبة للحرارة تحتوي على سوط أحادي القطب أو سوط ثنائي القطب. يعتبر دوران السوط في كل قطب القوة الدافعة الأساسية لحركته اللولبية المميزة وحاسما في التسبب في المرض لأنه يسمح للبكتيريا بالسباحة عبر الغشاء المخاطي اللزج في الجهاز الهضمي المضيف. يتم التحكم في حركة العطيفة من خلال نظامها الحسي الكيميائي الذي يسمح للخلايا بالتحرك نحو بيئات مواتية12,13. استنادا إلى مورفولوجيا الخلية والخصائص الفسيولوجية للكامبيلوباكتر ، استخدمت بعض الدراسات الترشيح الغشائي لعزل العطيفة spp. من العينات البرازيةوالبيئية 14،15،16.
تقدم هذه الدراسة بروتوكولا سريعا وقويا للعزل والكشف اللاحق عن C. jejuni و C. coli من اللحوم النيئة ، مما يتغلب على عيوب الطرق الحالية ويوفر العديد من المزايا. يمكن تأكيد المستعمرات المؤقتة على أنها Campylobacter spp. باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق ، مثل الفحص المجهري ، والاختبارات الكيميائية الحيوية (على سبيل المثال ، مقايسات نشاط الكاتلاز والأوكسيديز) ، أو الطرق الجزيئية6. تحدد الطريقة العزلات على مستوى الأنواع باستخدام اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد في الوقت الفعلي (mqPCR) الذي يستهدف الجينات الفريدة ل C. jejuni و C. coli. هذه الطريقة غير مكلفة نسبيا وسريعة وانتقائية ، مما يجعلها مناسبة للاستخدام في مجموعة متنوعة من الإعدادات ، بما في ذلك مرافق تجهيز الأغذية والمختبرات السريرية ومختبرات الأبحاث.
Protocol
يجب إجراء جميع الأعمال المرتبطة بهذا البروتوكول داخل خزانة السلامة البيولوجية (BSC) للحفاظ على ظروف التعقيم وتقليل مخاطر تلوث العينات أو تعرض المشغل لمسببات الأمراض الميكروبية. عند نقل العينات خارج BSC ، استخدم حاويات محكمة الغلق لمنع الانسكاب في حالة السقوط العرضي ، مع الحفاظ على سلامة العينة. على نحو مفضل ، يجب استخدام المكونات التي تستخدم لمرة واحدة طوال الإجراء للتخفيف من إمكانية التلوث المتبادل. في الحالات التي تكون فيها المستهلكات غير مجدية ، تأكد من أن جميع المعدات والمواد معقمة قبل الاستخدام. الإدارة السليمة للنفايات أمر بالغ الأهمية. يجب التخلص من جميع المكونات المستخدمة التي تستخدم لمرة واحدة كنفايات بيولوجية. مواد الأوتوكلاف قبل التخلص منها لضمان التعقيم المناسب وتجنب احتواء المواد التي يحتمل أن تكون خطرة. لا يحمي الالتزام بهذه الاحتياطات سلامة العينات فحسب ، بل يقلل أيضا من مخاطر تعرض المشغل لمسببات الأمراض الميكروبية. يصور الشكل 1 سير عمل تحضير العينات ، والتخصيب الانتقائي ، والعزل القائم على المرشح ، والتمايز mqPCR لأنواع العطيفة . يصور الملف التكميلي 1 سير عمل وصورا أكثر تفصيلا طوال العملية.
1. تحضير عينات اللحوم
- الحصول على عينات اللحوم
- احصل على العديد من عبوات اللحوم الطازجة ، بما في ذلك أفخاذ الدجاج والأجنحة وأعواد الطبل والكبد من تجار التجزئة المحليين.
- نقل جميع العينات إلى التخزين في درجة حرارة 4 درجة مئوية ومعالجتها في غضون 24 ساعة بعد الاستلام.
ملاحظة: سيؤثر تخزين العينات الطازجة في درجات حرارة منخفضة ، مثل أقل من درجة التجمد ، على التعافي.
- تجهيز عينات اللحوم
- اتبع نسبة المكونات المنصوص عليها في إرشادات أخذ العينات FSIS 6,17.
- قطع 450 جرام من قطع الدجاج من كل عبوة وضعها في كيس المعدة (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يتم اقتراح أكياس المعدة لأنها تتمتع بقوة ميكانيكية كافية لضمان العمليات النهائية ، ولن تتمزق أو تتسرب. - تحضير ماء الببتون المخزن (BPW).
- قم بإذابة 20 جم من المسحوق (انظر جدول المواد) في 1 لتر من الماء النقي. الأوتوكلاف الحل على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تمييع الحل في الماء المعقم إلى تركيز 0.1 ٪.
- أضف 200 مل 0.1٪ BPW إلى كيس المعدة الذي يحتوي على الدجاج.
- قم بتدليك / جس العينة يدويا من خارج كيس المعدة لمدة 2 دقيقة.
- اجمع كل شطف الدجاج من الجانب المصفى من الكيس باستخدام وحدة تحكم ماصة آلية (انظر جدول المواد).
- ضعي شطف الدجاج في زجاجات طرد مركزي معقمة. جهاز طرد مركزي عند 10000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- اجمع المادة الطافية بعناية باستخدام وحدة تحكم ماصة آلية مع ماصة بلاستيكية مصلية سعة 25 مل يمكن التخلص منها. تجنب إزعاج الحبيبات.
- كرر العملية حسب الضرورة لضمان إزالة كل المادة الطافية.
- تخلص من المادة الطافية التي تم جمعها.
2. التخصيب الانتقائي للكامبيلوباكتر من اللحوم النيئة
- إعداد مرق بولتون مع المكملات الغذائية
- قم بإذابة 13.8 جم من المسحوق (انظر جدول المواد) في 500 مل من الماء النقي. تعقيم المرق عن طريق التعقيم لمدة 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
- أضف 25 مل من دم الحصان المكبوت (انظر جدول المواد) إلى مرق بولتون المعقم سعة 500 مل.
ملاحظة: تعمل إضافة دم الحصان كعامل تبريد للأكسجين للمساعدة في استعادة خلايا العطيفة المصابة من مصفوفة الطعام. - إعادة تشكيل 1 قارورة من ملحق المضادات الحيوية (سيفوبيرازون ، سيكلوهيكسيميد ، تريميثوبريم ، وفانكومايسين ، انظر جدول المواد) في 5 مل 50٪ إيثانول.
- أضف مكمل المضادات الحيوية المعاد تشكيله إلى مرق بولتون.
- إجراء التخصيب
- أعد تعليق الحبيبات في 50 مل من مرق بولتون الذي يحتوي على دم الحصان والمضادات الحيوية.
- ضع العينات (بأغطية مفكوكة) داخل حاوية محكمة الغلق تحافظ على خليط غاز 85٪ N2 و 10٪ CO2 و 5٪ O2.
- تأكد من أن الغطاء مفكوك ، لكن الحاوية محكمة الغلق لإنتاج متطلبات النمو المحبة للحرارة والمحبة للحرارة من العطيفة.
ملاحظة: يمكن استخدام عبوات الغاز التي تحافظ على جو 85٪ N2 و 10٪ CO2 و 5٪ O2 في حالة عدم توفر الغرف البيئية. - احتضان العينات عند 42 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- تأكد من أن الغطاء مفكوك ، لكن الحاوية محكمة الغلق لإنتاج متطلبات النمو المحبة للحرارة والمحبة للحرارة من العطيفة.
3. عزل وتنقية C. jejuni و C. coli من الدجاج النيء
- تحضير ألواح أجار البروسيلا
- قم بإذابة 28 جم من مسحوق البروسيلا (انظر جدول المواد) في 1 لتر من الماء النقي. حل 15 غرام من أجار في محلول البروسيلا.
- عقم أجار البروسيلا بالتعقيم لمدة 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية. يبرد مزيج الآجار المتوسط في حمام مائي بدرجة حرارة 55 درجة مئوية.
- صب 20 مل من أجار البروسيلا في كل طبق بتري قطره 100 مم.
- طريقة التصفية وزراعة المستعمرة
- قم بتقييم تأثير الرطوبة على العطيفة التي تمر عبر المرشحات عن طريق تجفيف ألواح أجار البروسيلا مع فتح الأغطية في خزانة السلامة الحيوية لمدة 0 ساعة و 1 ساعة و 2 ساعة و 3 ساعات.
- قم بإعداد عنصر تحكم بدون مرشح عن طريق نشر 80 ميكرولتر من العينة مباشرة على لوحة أجار البروسيلا.
- ضع مرشح أسيتات السليلوز (0.45 ميكرومتر أو 0.65 حجم المسام ، انظر جدول المواد) في وسط صفيحة أجار البروسيلا.
- ماصة 4 قطرات / مرشح و 20 ميكرولتر / قطرة من العينة المخصبة على الفلتر.
- ضع القطرات بالقرب من مركز المرشح للتأكد من أن السائل الذي يصل إلى اللوحة يمر عبر المرشح وليس حول الفلتر.
- ضع القطرات بطريقة تضمن عدم انتشارها وتجميعها.
- احتضان قطرات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة وإزالة المرشحات بعناية.
ملاحظة: تتيح هذه الخطوة وقتا كافيا لخلايا العطيفة لاجتياز الغشاء والوصول إلى وسط الآجار دون تجفيف مفرط. - احتضان الألواح عند 42 درجة مئوية لمدة 24 ساعة تقريبا في ظل الظروف الهوائية الدقيقة الموصوفة سابقا.
- اختر مستعمرات العطيفة المميزة ذات السمات المحددة.
ملاحظة: عادة ما تكون مستعمرات العطيفة مستديرة ذات حواف ناعمة ولامعة وشفافة صفراء أو ورديةاللون 6. - قم بتخطيط المستعمرات على ألواح أجار البروسيلا للتنقية. كرر هذه الخطوة حتى يتم الحصول على لوحات ذات مورفولوجيا مستعمرة موحدة واحدة.
- تحضير العينات للتخزين طويل الأجل.
- تحضير مرق بولتون كما هو موضح سابقا. أضف مستعمرة واحدة من اللوحة مع مورفولوجيا مستعمرة موحدة.
- تنمو بين عشية وضحاها (24 ساعة) في ظل الظروف الدقيقة الموصوفة سابقا. أضف 900 ميكرولتر من المستزرع الليلي إلى 2 مل كريوفيال يحتوي على 100 ميكرولتر من DMSO.
- تبرد بسرعة في حمام جاف من الإيثانول المثلج (حوالي -72 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق. انقله إلى فريزر -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
4. تحديد أنواع C. jejuni و C. coli
- إجراء تحديد على مستوى الأنواع ل C. jejuni و C. coli باستخدام مقايسة qPCR متعددة الإرسال (mqPCR) تم تطويرها مسبقا18،19.
- إجراء تحلل سريع للخلايا واستخراج الحمض النووي الجينومي في شكل لوحة 96 بئرا.
ملاحظة: يوصى بشدة بالنظر في استخدام مجموعات تجارية (انظر جدول المواد) للتأكد من أن العينة خالية بما فيه الكفاية من مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل المعروفة.- تفريق مستعمرات العطيفة المنقاة إلى 100 ميكرولتر من محلول الاستخراج.
- عينات Lyse عند 99 درجة مئوية لمدة 10 دقائق متبوعة بالتبريد عند 20 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة في جهاز تدوير حراري.
- جهاز طرد مركزي اللوحة عند 8000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة 2 ميكرولتر من قسمة المادة الطافية لمقايسة mqPCR.
- قم بإعداد خليط تفاعل 20 ميكرولتر يتكون من 10 ميكرولتر من 2x Master Mix ، و 2.0 ميكرولتر من عينة الحمض النووي ، و 104 نسخ من قالب التحكم في التضخيم الداخلي (IAC) ، و 200 نانومتر لكل تمهيدي ومسبار (انظر جدول المواد).
ملاحظة: البادئات ومجسات hipO و cdtA هي الجينات المستهدفة الحصرية ل C. jejuni و C. coli ، على التوالي. يتكون IAC من جزء DNA 79-bp من الفيروس الغدي البشري ويتم تضمينه كعنصر تحكم إيجابي لضمان نشاط ثابت لبوليميراز الحمض النووي عبر جميع العينات.
- قم بتحميل جميع العينات في ثلاث نسخ في لوحة بصرية ذات 96 بئرا مغطاة بفيلم بصري وضعها في نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (انظر جدول المواد).
- ابدأ تنشيط بدء التشغيل الساخن لبوليميراز الحمض النووي عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. اتبع مع 40 دورة من تمسخ في 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية والتلدين / التمديد عند 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
- إجراء تحلل سريع للخلايا واستخراج الحمض النووي الجينومي في شكل لوحة 96 بئرا.
5. تعداد تعليق الخلية
- تعداد معلقات الخلايا باستخدام إجراء لوحة إسقاط 6 × 620. ارجع إلى الملف التكميلي 1 للحصول على صور تصور طريقة لوحة الإسقاط 6 × 6.
- جفف ألواح أجار البروسيلا في الهواء مع إزالة الغطاء في غطاء التدفق الصفحي لمدة 45 دقيقة.
- أضف 200 ميكرولتر من المعلق البكتيري إلى ستة صفوف (A-F) في العمود الأول من لوحة 96 بئرا.
- وزع 180 ميكرولتر من وسط البروسيلا على ستة صفوف من الأعمدة المتبقية (2-12).
- تحضير التخفيفات التسلسلية عشرة أضعاف باستخدام عمليات نقل 20 ميكرولتر.
- على سبيل المثال ، نقل 20 ميكرولتر من العينة من العمود الأول إلى العمود الثاني. كرر هذه العملية لمدة لا تقل عن 6 أعمدة.
- خلط الجزر كل تعليق عشر مرات باستخدام ماصة ، وتغيير النصائح بين كل نقل.
- استخدم ماصة متعددة القنوات لإيداع 7 ميكرولتر من ستة صفوف من عمود على سطح صفيحة أجار بروسيلا.
- كرر لإنشاء صفيف 6 × 6 ، مع التأكد من أن الصفوف هي نسخ متماثلة تقنية عبر الأعمدة.
- جفف الألواح في الهواء لمدة 5 دقائق ، ثم اقلب اللوحة. احتضان لوحات في 42 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- احسب عدد المستعمرات في كل تخفيف تمثيلي.
Representative Results
تأثير الرطوبة في ألواح أجار البروسيلا للترشيح السلبي للكامبيلوباكتر
تحتوي العطيفة على جينوم صغير وتفتقر إلى العديد من جينات الاستجابة للإجهاد التي تحدث عادة في البكتيريا الأخرى ، مثل E. coli O157: H7 والسالمونيلا. لذلك ، فهو أكثر حساسية للضغوط البيئية المختلفة ولا يمكنه تحمل الجفاف أو مستويات الأكسجين المحيطة. على العكس من ذلك ، يمكن لوسط أجار شديد الرطوبة أن يغمر الفلتر. هذا لا يؤدي فقط إلى انتشار العينة إلى خارج المرشح ، ولكن أيضا يزيد من وقت التعرض للأكسجين21.
لتحديد الظروف المناسبة للعزل القائم على المرشح للكامبيلوباكتر ، تم تجفيف ألواح أجار البروسيلا مع إزالة الأغطية لمدة 0 ساعة و 1 ساعة و 2 ساعة و 3 ساعات داخل خزانة أمان بيولوجي وتقييم كفاءة خلايا العطيفة لاجتياز مرشح بحجم المسام 0.65 ميكرومتر. تم سحب أربع حصص 20 ميكرولتر من مزارع C. jejuni S27 بتركيزات 1.53 × 104 و 1.53 × 105 CFU / mL على كل غشاء مرشح تم وضعه فوق صفيحة البروسيلا. بعد 15 دقيقة من الاختراق ، تمت إزالة المرشحات ، وتم تحضين الألواح بين عشية وضحاها لنمو الخلايا.
ثم تم عد الخلايا من 5 لوحات مكررة وتدوينها في الجدول 1. أشارت النتائج إلى أن ألواح الآجار المجففة لمدة 2 ساعة و 3 ساعات كان أداؤها مشابها مع أعداد متساوية تقريبا من الخلايا المستعادة من الترشيح السلبي. ومن الملاحظ أن الألواح المجففة في ظل هذه الظروف لمدة 0 ساعة و 1 ساعة لم تسمح للخلايا باجتياز الغشاء بالكامل خلال فترة زمنية مدتها 15 دقيقة المستخدمة.
مقارنة بين أغشية مرشح مختلفة بحجم المسام لعزل العطيفة من كبد الدجاج
بالنظر إلى أحجام خلايا العطيفة (0.5-5 ميكرومتر في الطول و 0.2-0.9 ميكرومتر في العرض) ومجموعة واسعة من أحجام جزيئات الطعام ، تم اختبار مرشحات خلات السليلوز بأحجام مسام 0.45 ميكرومتر و 0.65 ميكرومتر لكفاءة مرور العطيفة عند إعطائها وقت حضانة مدته 15 دقيقة. تم استخدام عينات الطعام التي تتكون من 450 جراما من كبد الدجاج مع 153 CFU من C. jejuni ثم تم تخصيبها بين عشية وضحاها للتجربة. كعنصر تحكم بدون مرشح ، تم تضمين الطلاء المباشر لعينة التخصيب بالتوازي. أظهرت النتائج (الشكل 2) من 5 لوحات مكررة باستمرار أن مرشح حجم المسام 0.65 ميكرومتر سمح لعدد أكبر من الخلايا بالعبور من مرشحات حجم المسام 0.45 ميكرومتر ، مما أدى إلى زيادة ~ 29 ضعفا في الخلايا التي تم الحصول عليها. احتفظ مرشح حجم المسام 0.45 ميكرومتر بعدد كبير جدا من الخلايا على الجانب العلوي من المرشح ، مما أدى إلى استرداد أقل بكثير من العطيفة من الطعام مقارنة بمرشح حجم المسام 0.65 ميكرومتر. كما هو متوقع ، كان هناك عشب من الكائنات الحية الخلفية المختلفة تنمو على لوحات التحكم بدون مرشح.
تطبيق الترشيح السلبي في عزل العطيفة من دجاج التجزئة
بسبب الحركة غير العادية لخلايا العطيفة ، تم اختيار تقنية الترشيح السلبي لعزل C. jejuni و C. coli من منتجات اللحوم بالتجزئة ، والتي عادة ما تكون ملوثة بالعديد من الكائنات الحية الخلفية. بين عامي 2014-2023 ، تم جمع ما مجموعه 79 عبوة من اللحوم النيئة ، بما في ذلك أجزاء مختلفة من لحم الدجاج وكبد الدجاج وكبد البقر وكبد العجل ، من مختلف محلات السوبر ماركت المحلية. من كل عبوة ، تم أخذ عينات من 450 جم لعزل العطيفة spp. من خلال الجمع بين التخصيب الانتقائي للكامبيلوباكتر في مرق بولتون المحتوي على الدم والترشيح السلبي للخلايا من خلال مرشح خلات السليلوز بحجم 0.65 ميكرومتر مباشرة على صفيحة أجار البروسيلا ، تم عزل 49 سلالة من العطيفة بنجاح من 79 عينة لحم (الجدول 2). يمثل الشكل 3 نتيجة عزل سلالة جديدة من العطيفة من كبد الدجاج. وقد ثبت مرارا وتكرارا أن هذه الطريقة حساسة ومحددة وفعالة من حيث التكلفة.
تحديد وتمايز عزلات C. jejuni و C. coli
للتحقق من الجنس والتمييز بين أنواع عزلات العطيفة التي تم الحصول عليها من اللحوم النيئة ، تم استخدام اختبار qPCR متعدد الإرسال لتضخيم الأهداف الجينية المحددة (hipO و cdtA) ل C. jejuni و C. coli ، والتحكم في التضخيم الداخلي (IAC). تم تضمين IAC كمؤشر سلبي كاذب في التضخيم المتزامن لجينات متعددة. تم تنفيذ الفحص بتنسيق 96 بئرا مع تحلل سريع للخلايا واستخراج الحمض النووي باستخدام كاشف متاح تجاريا (انظر جدول المواد). يلخص الجدول 2 نتيجة تحديد الأنواع لسلالات C. jejuni و C. coli . وكتحقق إضافي، أكدت نتائج تسلسل الجينوم الكامل أنواع جميع العزلات (البيانات غير معروضة).
الشكل 1: مخطط سير عمل لعزل أنواع العطيفة وتحديدها من اللحوم المباعة بالتجزئة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تأثير حجم المرشح على استعادة العطيفة. تشير النتائج إلى أن مرشح 0.65 ميكرومتر يمكنه استعادة ما معدله 900 ± 138 مستعمرة ، بينما يستعيد مرشح 0.45 ميكرومتر 31 ± 7 مستعمرات. تم إنشاء النتائج من N = 20 (5 لوحات مع 4 قطرات / لوحة) ويشير اختبار t للطالب إلى أن الوسائل مختلفة إحصائيا (p < 0.0001). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: عزل العطيفة عن طريق الترشيح السلبي لعينات الدواجن المخصبة. (أ) يصور أربع قطرات سعة 20 ميكرولتر من العينة المخصبة المودعة على مرشح غشاء النيتروسليلوز. تم جمع الصورة خلال 15 دقيقة من الترشيح السلبي. (ب) يصور اللوحة بعد إزالة مرشح النيتروسليلوز. تشير البقع الأربع إلى المكان الذي اجتازت فيه العينة المخصبة الغشاء. (ج) يصور اللوحة بعد حضانة 24 ساعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: تأثير وقت تجفيف ألواح أجار البروسيلا على الترشيح السلبي ل C. jejuni. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: سلالات C. jejuni و C. coliمعزولة عن اللحوم النيئة. خلال الفترة الزمنية التي تتراوح من 2008 إلى 2023 ، تم عزل 36 سلالة من C. jejuni و 13 C. coli من 79 عبوة لحوم عبر 24 منتجا فريدا للبيع بالتجزئة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الملف التكميلي 1: الصور طوال عمليات العزل والتعداد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
أهمية البروتوكول
C. jejuni و C. coli هما النوعان الرئيسيان من العطيفة التي وجد أنها منتشرة في الدواجن22 وكبد23،24. في هذه الدراسة ، تم جمع عينات اللحوم من أجزاء الدجاج (الأرجل والأجنحة والفخذين) وكبد الدجاج وكبد البقر بشكل عشوائي خلال فترات زمنية مختلفة ، ومن متاجر البيع بالتجزئة والشركات المصنعة المختلفة لعزل العطيفة spp. ومن بين مجموع سلالات العطيفة المعزولة البالغ عددها 49 سلالة، تم تحديد 36 سلالة على أنها C. jejuni و 13 سلالة من بكتيريا C. coli، مع عدم العثور على أنواع أخرى من العطيفة ، وهو ما يتفق مع التقارير الأخرى25.
يعتمد الفحص على مورفولوجيا الخلية الحلزونية الشكل والحركة المميزة الشبيهة بالمفتاح ل Campylobacter spp. تم استخدام تقنية ترشيح سلبية بسيطة ولكنها فعالة26,27 استغلت مورفولوجيا الخلية الحلزونية الشكل (طويلة ، نحيلة ، 0.2-0.9 × 0.5-5 ميكرومتر) وحركة المفتاح القوية لفصل العطيفة عن خليط من الكائنات الحية الخلفية. سمحت الحركة العالية للكامبيلوباكتر للخلايا باجتياز مرشحات الغشاء والتحرك نحو ظروف مواتية موجودة داخل وسط أجار ، في حين أن الكائنات الحية الدقيقة الخلفية الأخرى من منتجات اللحوم لم تتمكن من المرور. هذه الطريقة غير مكلفة نسبيا وسريعة وانتقائية ، مما يجعلها مناسبة للاستخدام في مجموعة متنوعة من الإعدادات ، بما في ذلك مرافق تجهيز الأغذية والمختبرات السريرية ومختبرات الأبحاث.
غالبا ما يتم الاستشهاد بمقال رائد ينص على أن مرشح 0.45 ميكرومتر يعمل بشكل جيد لدرجة أن 0.65 ميكرومتر لم يتم تقييمه28. تشير نتائج هذه الدراسة الحالية إلى أن مرشح حجم المسام 0.65 ميكرومتر كان أفضل بكثير من حجم المسام 0.45 ميكرومتر ، مما أدى إلى زيادة 29 ضعفا في عدد الخلايا المستعادة من التخصيب. هذا مهم لأن المرشحات المحددة لا تعرض انتقائية مخفضة كما تم الإبلاغ عنه سابقا29. علاوة على ذلك ، كما هو معروف أن الترشيح سيقلل بشكل كبير من كمية العطيفة المستردة مقارنة بالطلاء المباشر30 ، وبالتالي ، فإن زيادة حجم المسام يحسن استعادة الكائنات الحية الدقيقة ، وهو ما يتوافق مع النتائج المبلغ عنها سابقا21. هذا أمر مهم لأن جميع الخلايا التي اجتازت المرشحات شكلت مستعمرات كامبيلوباكتر موحدة ، مما يشير إلى أن كلا المرشحين كانا كافيين لمنع البكتيريا الدقيقة الأخرى وجزيئات الطعام من المرور. بالإضافة إلى ذلك ، يشير المخطط الانسيابيFSIS 7 إلى إمكانية إنتاج نتائج ممتدة بسبب إعادة عزل الخطوط على ألواح Campy-Cefex التي تحتوي على مضادات حيوية. وعلى النقيض من ذلك، فإن البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة، والذي يجمع بين استخدام الترشيح والتخصيب الانتقائي مع سيفوبيرازون وسيكلوهكسيميد وتريميثوبريم وفانكومايسين، لم يستلزم إعادة الخطوط.
تتوافق الطريقة الحالية المستخدمة مع برامج أخذ العينات والتحقق FSIS الحالية17. نظرا لأن مستوى تلوث العطيفة يمكن أن يكون منخفضا (153 CFU / 450 جم دجاج) ، يتم شطف الشطف بالطرد المركزي لتركيز العينة بعامل أربعة ، مما يزيد من حساسية الفحص. بعد تركيز الشطف بعامل 4x ، يتم إثراء العينات لمدة 48 ساعة وفحصها بنظام الكشف الجزيئي (MDS) لتكرار الطريقة المستخدمة من قبل مختبرات FSIS (البيانات غير معروضة). والجدير بالذكر أن الطريقة الموصوفة لم تفشل بعد في تحديد السلالات الإيجابية في غضون 24 ساعة والتي تم اكتشافها بواسطة نظام الكشف الجزيئي باستخدام 48 ساعة من التخصيب (البيانات غير معروضة). أخيرا ، هناك فائدة إضافية لهذا البروتوكول وهي أنه يمكن أن يوفر معلومات تتعلق بالأنواع البكتيرية وتحديد ما إذا كانت العطيفة هي C.coli أو C. jejuni أو C. lari ، في حين أن MDS المعتمدة في MLG 41.07 يمكن أن توفر فقط استجابة إيجابية / سلبية ثنائية ل Campylobacter.
خطوات حاسمة
يتطلب بروتوكول عزل العطيفة وتحديدها الدقة أثناء الطرد المركزي والترشيح والتحليل الجزيئي. تعتبر التخفيفات الدقيقة وظروف الحضانة المناسبة والالتزام الدقيق بظروف فحص qPCR أمرا محوريا لتحديد الأنواع بشكل موثوق.
باعتبارها بكتيريا محبة للهواء الدقيق ، فإن العطيفة هشة للغاية وحساسة للضغوط البيئية المختلفة وتتطلب ظروفا فريدة من نوعها للنمو31،32،33. في عينات الطعام التي تمر عادة بفترات طويلة من النقل والتخزين ، ربما تكون العديد من خلايا العطيفة في حالة سكون أو إصابة شبه مميتة / مميتة34,35. وبالتالي ، من المهم استعادة الخلايا المجهدة من مصفوفات الطعام وتنميتها إلى تركيز أعلى. في الخطوة الأولى من الإجراء ، استخدمنا مرق بولتون المكمل بدم الحصان والمضادات الحيوية للتخصيب الانتقائي للكامبيلوباكتر من الطعام. كان الدم الإضافي بمثابة عامل تبريد الأكسجين للتغلب على الآثار الضارة لجذور الأكسجين الحرة36. تم استخدام المضادات الحيوية لمنع نمو البكتيريا الخلفية37.
لتقليل وقت تعرض العطيفة للأكسجين الجوي المحيط ، تم اختيار فترة حضانة مدتها 15 دقيقة للسماح للخلايا باجتياز المرشح. أيضا ، لعبت رطوبة لوحة أجار البروسيلا تحت المرشح دورا مهما في معدل المرور. على وجه التحديد ، أشارت نتائج اختبار ألواح أجار المجففة لمدة 0 ساعة و 1 ساعة و 2 ساعة و 3 ساعات إلى أن محتوى الرطوبة العالي في المرشح يمنع الخلايا من المرور. بنفس القدر من الأهمية هو الوضع الدقيق للمرشحات والقطرات على الألواح والمرشحات ، وكلاهما يؤثر على نجاح عزل الخلايا.
المزالق والقيود المحتملة
أثناء تقديم نهج منظم لعزل وتحديد أنواع العطيفة من عينات الدجاج النيئة ، فإن العديد من قيود هذا البروتوكول تستحق الاهتمام. التلوث الخارجي ، والألواح غير المجففة بشكل كاف ، وانسداد المرشحات التي تعوق الحركة الميكروبية ، وحبس الكائنات الحية الدقيقة داخل الحبيبات ، والختم غير الكامل لغرفة الغلاف الجوي ، والقطرات التي تنتشر خارج حدود المرشح هي من بين المزالق الأولية.
قد يؤدي الفصل غير الكافي للكائنات الحية الدقيقة عن أسطح الطعام أو حبسها داخل الجزء الأكبر من العينة إلى إعاقة عزلها باستخدام هذه الطريقة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاعتماد على الحركة الميكروبية للاجتياز من خلال المرشحات السلبية يمثل قيدا ملحوظا. من الممكن أن تكون أغشية المرشح قد احتفظت ببعض سلالات العطيفة الأقل حركة ، حيث ثبت أن المرشحات يمكن أن تقلل من كفاءة التقاط مسببات الأمراض الميكروبية في الغذاء38. تشمل القيود الإضافية طبيعة الدفعات لعمليات الطرد المركزي والترشيح ، والقابلية لانسداد المرشح ، وعدم الكفاءة في تشتيت الحبيبات المتكونة ، مما سيؤثر على دقة الأحمال الميكروبية. وتؤكد هذه القيود مجتمعة على الحاجة إلى توخي الحذر والمنهجيات التكميلية لضمان التحليل الشامل، لا سيما عند التعامل مع أنواع متنوعة من العينات أو البحث عن قدرات إنتاجية عالية.
اقتراحات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها
لاستباق المشكلات المحتملة ، تأكد في البداية من أن جميع المواد تلتزم بمعايير الجودة اللازمة ولم تنته صلاحيتها. استكشاف أخطاء المرشحات المسدودة وإصلاحها عن طريق استخدام ترشيح إضافي لإزالة أي ملوثات كبيرة قد تقيد مرور العطيفة عبر غشاء النيتروسليلوز. إذا لوحظ تلوث ، تحقق من أن القطرات لم توضع بالقرب من حافة المرشح وسمحت للسائل بالوصول إلى الآجار عن طريق الدوران حول المرشح بدلا من المسام. إذا لم يكن هناك نمو كاف بعد التخصيب ، فتحقق من أن أختام الحاويات الجوية محكمة ولا تتسرب.
التحسين والتوسع المحتمل
قد يؤدي استكشاف مواد ترشيح بديلة إلى تعزيز الاجتياز الميكروبي وتمكين توسيع هذا البروتوكول لاستخدامه في عزل الكائنات الحية الدقيقة المتحركة الأخرى من المخاليط غير المتجانسة مثل الطعام. ينصح بتحديد الضوابط للاحتفاظ بمتغيرات العطيفة الأقل حركة دون التأثير سلبا على الخصوصية. بالإضافة إلى ذلك ، في حين ثبت أن مقايسة qPCR متعددة الإرسال المستخدمة في هذه الدراسة لديها القدرة على اكتشاف C.lari، يمكن تضمين 18 نوعا آخر من العطيفة ذات الأهمية في هذا الفحص.
باختصار ، من خلال تقييم المعلمات والإعدادات المختلفة ، تم تحديد الظروف المناسبة للعزل القائم على الترشيح وتحديد مستوى الأنواع ل C. jejuni و C. coli من الطعام. وقد ثبت أن هذه الطريقة حساسة ومحددة وقوية وفعالة من حيث التكلفة. من خلال تطبيقه على عينات غذائية حقيقية ، تمكن البروتوكول من عزل 36 سلالة C. jejuni و 13 سلالة C. coli من 79 عبوة لحوم.
يتماشى البروتوكول مع توجيه FSIS 10,250.117 ، الذي يحدد إجراءات أخذ عينات أجزاء الدجاج النيئة ، و MLG 41.076 لعزل وتحديد العطيفة. تشير البيانات إلى أن تركيز العينة بمقدار 4 أضعاف وإثرائها لمدة 24 ساعة ، إلى جانب الترشيح والطلاء ، ينتج مستعمرات معزولة ومؤكدة في غضون 48 ساعة مقابل 96 ساعة. يتوافق البروتوكول مع الأساليب القائمة على الحمض النووي مثل تسلسل الجينوم لتوفير توصيف شامل لسلالات العطيفة ، بما في ذلك ملامح مقاومة مضادات الميكروبات ، والتنبؤات بالفوعة ، والعلاقات التطورية. ويمثل البروتوكول بديلا واعدا للتعافي الفعال وعزل العطيفة من الدواجن النيئة، مما يمكن أن يسهل الدراسات الوبائية وتدخلات الصحة العامة.
Disclosures
يعلن جميع المؤلفين أنه لا يوجد تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا البحث من قبل وزارة الزراعة الأمريكية ، خدمة البحوث الزراعية (USDA-ARS) ، البرنامج الوطني 108 ، أرقام نظام معلومات البحث الحالي 8072-42000-093 و 8072-42000-094-000-D. ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذه المقالة هو فقط لغرض توفير معلومات محددة ولا يعني توصية أو تأييد من وزارة الزراعة الأمريكية. وزارة الزراعة الأمريكية هي مزود تكافؤ الفرص وصاحب العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar - Solidifying Agent (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 281230 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | JL602-G/L | Equipment |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S | Equipment |
| Antibiotic supplements cefoperazone, cycloheximide, trimethoprim, vancomycin | Oxoid Ltd. | SR0183E | |
| Atmosphere Control Gas Pak (Campy, 85% N2, 10% CO2, and 5% O2) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260680 | |
| Atmosphere Control Vessel, GasPak EZ CampyPak container system | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260678 | |
| Autoclave - Amsco Lab250, Laboratory Steam Sterilizer | Steris plc | LV-250 | Equipment |
| Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+ | Labconco Corporation | 302411101 | Equipment |
| Bolton broth | Oxoid Ltd. | CM0983 | |
| Brucella broth (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 211088 | |
| Buffered Peptone Water | Bio-Rad Laboratories Inc. | 3564684 | |
| Centrifuge Microcentrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 | Equipment |
| Centrifuge, Avanti J-25 | Beckman Coulter, Inc. | Equipment | |
| Chicken thighs, wings, drumsticks, livers | Local retailers | ||
| DNA Extraction - PreMan Ultra Sample Preparation Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4318930 | |
| FAM probe for hipO (Sequence 5'-TTGCAACCTCACTAGCAAAATCC ACAGCT-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Filter - 0.45 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | DAWP04700 | |
| Filter - 0.65 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | HAWG04700 | |
| forward primer for cdtA (Sequence 5'-TGTCAAACAAAAAACACCAAGCT T-3' ') |
Integrated DNA Technologies | ||
| forward primer for hipO (Sequence 5'-TCCAAAATCCTCACTTGCCATT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| forward primer for IAC (Sequence 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| HEX probe for cdtA (Sequence 5'-AAAATTTCCCGCCATACCACTTG TCCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Incubator - Inova 4230 refrigerated incubator shaker | New Brunswick Scientific | 4230 | Equipment |
| Inoculating Loop - Combi Loop 10µL and 1µL | Fisher Scientific International, Inc | 22-363-602 | |
| Internal Amplification Control (IAC) DNA fragment (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTAT GTGGTGGCATTGTCTTCTCCC GTTGTAACTATCCACTGAGATG TGTTAGGCGCGCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Laked horse blood | Remel Inc. | R54072 | |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Mettler Toledo | 17014382 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | Mettler Toledo | 17014384 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | Mettler Toledo | 17014388 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Mettler Toledo | 17014391 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Mettler Toledo | 17014392 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Mettler Toledo | 17013805 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+ | Mettler Toledo | 17013803 | Equipment |
| Media Storage Bottle -PYREX 1 L Square Glass Bottle, with GL45 Screw Cap | Corning Inc. | 1396-1L | Equipment |
| Media Storage Bottle -PYREX 2 L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw Cap | Corning Inc. | 1397-2L | Equipment |
| Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34 cm2, sterile, 108/cs | MilliporeSigma | Z707902 | |
| Mixer - Vortex Genie 2 | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | Equipment |
| Motorized pipette controller, PIPETBOY2 | INTEGRA Biosciences Corp. | Equipment | |
| PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4369542 | |
| Petri Dish Rotator - bioWORLD Inoculation Turntable | Fisher Scientific International, Inc | 3489E20 | Equipment |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm) | Fisher Scientific International, Inc | FB0875713 | |
| Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8 | Mettler Toledo | 30389273 | |
| Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10 | Mettler Toledo | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10 | Mettler Toledo | 30389276 | |
| Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettors | Thermo Fisher Scientific Inc. | 8093-11 | |
| Realtime PCR - 7500 Real-Time PCR system | (Applied Biosystems, Foster City, CA) | Equipment | |
| reverse primer for cdtA (Sequence 5'-CCTTTGACGGCATTATCTCCTT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| reverse primer for hipO (Sequence 5'-TGCACCAGTGACTATGAATAACG A-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| reverse primer for IAC (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA -3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170356N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170372N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170357N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170376N | |
| Spreader - Fisherbrand L-Shaped Cell Spreaders | Fisher Scientific International, Inc | 14-665-230 | |
| Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter Bags | Thermo Fisher Scientific Inc. | 01-812 | |
| TAMRA probe for IAC (Sequence 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCC ACCA-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700) | Applied Biosystems | Equipment | |
| Water Filtration - Elga Veolia Purelab Flex | Elga LabWater | PF2XXXXM1-US | Equipment |
References
- Rushton, S. P., et al. Climate, human or environment: Individual-based modelling of Campylobacter seasonality and strategies to reduce disease burden. J Transl Med. 17 (1), 34 (2019).
- Facciolà, A., et al. Campylobacter: From microbiology to prevention. J Prev Med Hyg. 58 (2), E79-E92 (2017).
- Perez-Arnedo, I., Gonzalez-Fandos, E. Prevalence of Campylobacter spp. In poultry in three spanish farms, a slaughterhouse and a further processing plant. Foods. 8 (3), 111 (2019).
- Nachamkin, I., Allos, B. M., Ho, T. Campylobacter species and guillain-barré syndrome. Clin Microbiol Rev. 11 (3), 555-567 (1998).
- Department of Food Administration.
- USDA Office of Public Health Science. Isolating and identifying Campylobacter jejuni/coli/lari from poultry rinsate, sponge and raw product samples. Microbiology Laboratory Guidebook. , (2022).
- Singh, H., Rathore, R. S., Singh, S., Cheema, P. S. Comparative analysis of cultural isolation and PCR based assay for detection of Campylobacter jejuni in food and faecal samples. Braz J Microbiol. 42 (1), 181-186 (2011).
- Kralik, P., Ricchi, M. A basic guide to real time pcr in microbial diagnostics: Definitions, parameters, and everything. Front Microbiol. 8, (2017).
- Linton, D., Lawson, A. J., Owen, R. J., Stanley, J. PCR detection, identification to species level, and fingerprinting of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli direct from diarrheic samples. J Clin Microbiol. 35 (10), 2568-2572 (1997).
- Kabiraz, M. P., Majumdar, P. R., Mahmud, M. M. C., Bhowmik, S., Ali, A. Conventional and advanced detection techniques of foodborne pathogens: A comprehensive review. Heliyon. 9 (4), e15482 (2023).
- Kaakoush, N. O., Castaño-Rodríguez, N., Mitchell, H. M., Man, S. M.
- Gilbreath, J. J., Cody, W. L., Merrell, D. S., Hendrixson, D. R. Change is good: Variations in common biological mechanisms in the epsilonproteobacterial genera Campylobacter and Helicobacter. Microbiol Mol Biol Rev. 75 (1), 84-132 (2011).
- Lertsethtakarn, P., Ottemann, K. M., Hendrixson, D. R. Motility and chemotaxis in campylobacter and helicobacter. Annu Rev Microbiol. 65, 389-410 (2011).
- Jokinen, C. C., et al. An enhanced technique combining pre-enrichment and passive filtration increases the isolation efficiency of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from water and animal fecal samples. J Microbiol Methods. 91 (3), 506-513 (2012).
- Engberg, J., On, S. L., Harrington, C. S., Gerner-Smidt, P. Prevalence of Campylobacter, Arcobacter, Helicobacter, and Sutterella spp. In human fecal samples as estimated by a reevaluation of isolation methods for Campylobacters. J Clin Microbiol. 38 (1), 286-291 (2000).
- Lastovica, A. J., Le Roux, E. Efficient isolation of campylobacteria from stools. J Clin Microbiol. 38 (7), 2798-2799 (2000).
- USDA. Salmonella and Campylobacter verification program for raw poultry products. FSIS Directive 10250.1. 10000 Series: Laboratory Services. USDA. , (2021).
- He, Y., et al. Simultaneous detection and differentiation of Campylobacter jejuni, c. Coli, and c. Lari in chickens using a multiplex real-time PCR assay. Food Anal Methods. 3, 321-329 (2010).
- Suo, B., He, Y., Tu, S. -I., Shi, X. A multiplex real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of salmonella spp., escherichia coli o157, and listeria monocytogenes in meat products. Foodborne Pathog Dis. 7 (6), 619-628 (2010).
- Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. A 6 x 6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, listeria monocytogenes, and escherichia coli. J Microbiol Methods. 55 (2), 475-479 (2003).
- Speegle, L., Miller, M. E., Backert, S., Oyarzabal, O. A. Use of cellulose filters to isolate Campylobacter spp. From naturally contaminated retail broiler meat. J Food Prot. 72 (12), 2592-2596 (2009).
- Guirin, G. F., Brusa, V., Adriani, C. D., Leotta, G. A. Prevalence of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from broilers at conventional and kosher abattoirs and retail stores. Rev Argent Microbiol. 52 (3), 217-220 (2020).
- Noormohamed, A., Fakhr, M. K. A higher prevalence rate of Campylobacter in retail beef livers compared to other beef and pork meat cuts. Int J Environ Res Public Health. 10 (5), 2058-2068 (2013).
- Walker, L. J., et al. Prevalence of Campylobacter coli and Campylobacter jejuni in retail chicken, beef, lamb, and pork products in three Australian states. J Food Prot. 82 (12), 2126-2134 (2019).
- Zhao, C., et al. Prevalence of Campylobacter spp., Escherichia coli, and Salmonella serovars in retail chicken, turkey, pork, and beef from the greater Washington, D.C., area. Appl Environ Microbiol. 67 (12), 5431-5436 (2001).
- Honsheng, H., Manuel Mariano, G. Campylobacter. Guillermo, T. -I., Saeed, E. -A. , IntechOpen. Rijeka. (2022).
- He, Y., et al. Rapid identification and classification of Campylobacter spp. using laser optical scattering technology. Food Microbiol. 47, 28-35 (2015).
- Steele, T. W., Mcdermott, S. N. The use of membrane filters applied directly to the surface of agar plates for the isolation of Campylobacter jejuni from feces. Pathology. 16 (3), 263-265 (1984).
- Bourke, B., Chan, V. L., Sherman, P.
- Berrang, M. E., Meinersmann, R. J., Cox, N. A. Passage of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli subtypes through 0.45- and 0.65-micrometer-pore-size nitrocellulose filters. J Food Prot. 80 (12), 2029-2032 (2017).
- Hill, G. N., et al. Optimizing enrichment of Campylobacter on poultry. J App Poult Res. 26 (3), 307-315 (2017).
- Kim, J. C., Oh, E., Kim, J., Jeon, B. Regulation of oxidative stress resistance in Campylobacter jejuni, a microaerophilic foodborne pathogen. Front Microbiol. 6, 751 (2015).
- Nennig, M., et al. Metaphenotypes associated with recurrent genomic lineages of Campylobacter jejuni responsible for human infections in luxembourg. Front Microbiol. 13, (2022).
- Moore, J. E. Bacterial dormancy in Campylobacter: Abstract theory or cause for concern. Int J Food Sci Technol. 36 (6), 593-600 (2001).
- Saha, S., Saha, S., Sanyal, S. Recovery of injured Campylobacter jejuni cells after animal passage. Appl Environ Microbiol. 57 (11), 3388-3389 (1991).
- Baylis, C. L., Macphee, S., Martin, K. W., Humphrey, T. J., Betts, R. P. Comparison of three enrichment media for the isolation of Campylobacter spp. From foods. J Appl Microbiol. 89 (5), 884-891 (2000).
- Line, J. E. Development of a selective differential agar for isolation and enumeration of Campylobacter spp. J Food Prot. 64 (11), 1711-1715 (2001).
- Armstrong, C. M., et al. Impacts of clarification techniques on sample constituents and pathogen retention. Foods. 8 (12), 636 (2019).
