Summary
Campylobacter är den främsta orsaken till bakteriell livsmedelsburen gastroenterit över hela världen. Trots att anläggningar vidtar åtgärder för att minska förekomsten i sina anläggningar når kontaminerade produkter konsekvent konsumenterna. Tekniken som utvecklats under de senaste tolv åren tar itu med begränsningar i befintliga metoder för att isolera och detektera Campylobacter spp. från rått kött.
Abstract
Denna artikel presenterar ett snabbt men robust protokoll för att isolera Campylobacter spp. från rått kött, med särskilt fokus på Campylobacter jejuni och Campylobacter coli. Protokollet bygger på etablerade metoder och säkerställer kompatibilitet med de rådande tekniker som används av tillsynsorgan som Food and Drug Administration (FDA) och US Department of Agriculture (USDA) i USA, samt International Organization for Standardization (ISO) i Europa. Centralt i detta protokoll är att samla upp ett sköljmedel, som koncentreras och återsuspenderas i Bolton Broth-media som innehåller hästblod. Detta medium har visat sig underlätta återhämtningen av stressade Campylobacter-celler och minska den nödvändiga anrikningstiden med 50 %. De anrikade proverna överförs sedan till nitrocellulosamembran på brucellaplattor. För att förbättra metodens sensitivitet och specificitet utvärderades filtermembran med porstorlek på 0,45 μm och 0,65 μm. Data visade en 29-faldig ökning av cellåterhämtningen med filtret med 0,65 μm porstorlek jämfört med 0,45 μm porstorlek utan att påverka specificiteten. De mycket rörliga egenskaperna hos Campylobacter gör det möjligt för cellerna att aktivt röra sig genom membranfiltren mot agarmediet, vilket möjliggör effektiv isolering av rena Campylobacter-kolonier . Protokollet innehåller multiplex kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion (mqPCR) analys för att identifiera isolaten på artnivå. Denna molekylära teknik erbjuder ett tillförlitligt och effektivt sätt att identifiera arter. Undersökningar som genomförts under de senaste tolv åren med kött i detaljhandeln har visat att denna metod kan förbättra återvinningen av Campylobacter från naturligt kontaminerade köttprover jämfört med nuvarande referensmetoder. Dessutom har detta protokoll minskad förberedelse- och bearbetningstid. Som ett resultat presenterar det ett lovande alternativ för effektiv återhämtning av Campylobacter från kött. Dessutom kan denna procedur integreras sömlöst med DNA-baserade metoder, vilket underlättar snabb screening av positiva prover tillsammans med omfattande helgenomsekvenseringsanalys.
Introduction
Campylobacter spp. är den främsta orsaken till bakteriell livsmedelsburen gastroenterit i världen, med uppskattningsvis 800 miljoner fall årligen1. Som en stor zoonotisk bakterie koloniserar Campylobacter naturligt mag-tarmkanalerna hos ett brett spektrum av djur, inklusive vilda fåglar, husdjur och husdjur. Vid slakt eller livsmedelsbearbetning kontaminerar Campylobacter spp. ofta slaktkroppar eller köttprodukter3. Campylobacterios är vanligtvis förknippad med konsumtion av dåligt tillagat fjäderfä eller korskontaminering av andra livsmedel med rå fjäderfäjuice2. Det kan orsaka allvarliga komplikationer, såsom Guillain-Barrés syndrom, reaktiv artrit och blodförgiftning hos personer med nedsatt immunförsvar4. Att upptäcka och isolera Campylobacter från livsmedelskällor, särskilt fjäderfäprodukter, är avgörande för folkhälsoövervakning, utredning av utbrott och riskbedömning.
Konventionella odlingsbaserade metoder är de traditionella och standardmetoderna för detektion av Campylobacter 5,6. Det finns dock flera begränsningar, inklusive långa inkubationstider (48 timmar eller mer), låg känslighet (upp till 50 %) och är inte inkluderande för alla stammar (vissa stressade Campylobacter-celler kanske inte växer bra eller inte alls i media)7. Molekylära metoder, såsom polymeraskedjereaktion (PCR), är snabbare och känsligare än odlingsbaserade metoder, men de ger inte livskraftiga isolat för vidare karakterisering 8,9.
Immunologiska metoder är alternativa och kompletterande metoder för detektion av Campylobacter . Dessa är snabba, enkla och mångsidiga, men har också flera begränsningar, inklusive korsreaktivitet (vissa antikroppar kan binda till icke-Campylobacter-bakterier eller andra ämnen som delar liknande antigener), låg specificitet (vissa antikroppar kanske inte binder till alla Campylobacter-stammar eller serotyper) och provberedningskrav (immunologiska metoder kräver ofta förbehandling av proverna för att avlägsna störande ämnen för att förbättra bindningen av antikropparna)10. – Herr talman,
Inom släktet Campylobacter orsakar C. jejuni och C. coli de flesta Campylobacterinfektioner hos människa (81 % respektive 8,4 %)11. Båda är spiralformade, mikroaerofila och termofila bakterier som innehåller en unipolär flagell eller bipolär flagell. Rotation av en flagell vid varje pol anses vara både den primära drivkraften för dess karakteristiska korkskruvsrörlighet och avgörande för dess patogenes eftersom det gör det möjligt för bakterien att simma genom den trögflytande slemhinnan i värdens mag-tarmkanal. Motiliteten hos Campylobacter styrs av dess kemosensoriska system som gör att cellerna kan röra sig mot gynnsamma miljöer12,13. Baserat på cellmorfologin och fysiologiska egenskaperna hos Campylobacter har några studier använt membranfiltrering för isolering av Campylobacter spp. från fekala och miljömässiga prover 14,15,16.
Denna studie presenterar ett snabbt och robust protokoll för isolering och efterföljande detektion av C. jejuni och C. coli från rått kött, vilket övervinner nackdelarna med de befintliga metoderna och erbjuder flera fördelar. Tentativa kolonier kan bekräftas som Campylobacter spp. med hjälp av en mängd olika metoder, såsom mikroskopi, biokemiska tester (t.ex. katalas- och oxidasaktivitetsanalyser) eller molekylära metoder6. Metoden identifierar isolaten på artnivå med hjälp av en multiplex realtids-PCR-analys (mqPCR) som riktar sig mot gener som är unika för C. jejuni och C. coli. Denna metod är relativt billig, snabb och selektiv, vilket gör den lämplig för användning i en mängd olika miljöer, inklusive livsmedelsbearbetningsanläggningar, kliniska laboratorier och forskningslaboratorier.
Protocol
Allt arbete i samband med detta protokoll bör utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp (BSC) för att upprätthålla aseptiska förhållanden och minimera risken för provkontaminering eller operatörsexponering för mikrobiella patogener. När du överför samples utanför BSC, använd förseglade behållare för att förhindra spill i händelse av oavsiktliga droppar, bibehåll sample integritet. Helst bör engångskomponenter användas under hela proceduren för att minska risken för korskontaminering. I de fall där engångsartiklar inte är möjliga, se till att all utrustning och material är sterila före användning. Korrekt avfallshantering är avgörande. Alla använda engångskomponenter ska kasseras som biologiskt farligt avfall. Autoklavera material innan de kasseras för att säkerställa korrekt sterilisering och undvika inneslutning av potentiellt farliga material. Att följa dessa försiktighetsåtgärder skyddar inte bara provets integritet utan minimerar också risken för operatörens exponering för mikrobiella patogener. Figur 1 visar arbetsflödet för provberedning, selektiv berikning, filterbaserad isolering och mqPCR-differentiering av Campylobacter-arter . Tilläggsfil 1 visar ett mer detaljerat arbetsflöde och bilder under hela processen.
1. Beredning av köttprover
- Anskaffning av köttprover
- Skaffa olika färska köttpaket, inklusive kycklinglår, vingar, trumpinnar och lever från lokala återförsäljare.
- Överför alla prover till lagring vid 4 °C och bearbeta inom 24 timmar efter mottagandet.
OBS: Förvaring av de färska samples vid lägre temperaturer, såsom under fryspunkten, kommer att påverka återhämtningen.
- Bearbetning av köttprover
- Följ det förhållande mellan komponenterna som föreskrivs i FSIS provtagningsriktlinje 6,17.
- Skär 450 g kycklingbitar från varje förpackning och lägg dem i en magpåse (se Materialförteckning).
OBS: Stomacher-påsar rekommenderas eftersom de har tillräcklig mekanisk styrka för att säkerställa nedströmsprocesserna och inte kommer att spricka eller läcka. - Förbered buffrat peptonvatten (BPW).
- Lös upp 20 g av pulvret (se materialförteckning) i 1 l renat vatten. Autoklavera lösningen vid 121 °C i 15 minuter. Späd lösningen i sterilt vatten till en koncentration av 0,1 %.
- Tillsätt 200 ml 0,1 % BPW i påsen med kycklingen.
- Massera/palpera provet manuellt från utsidan av stomacherpåsen i 2 min.
- Samla upp all kycklingsköljning från den filtrerade sidan av påsen med hjälp av en motoriserad pipettkontroll (se materialförteckning).
- Fördela kycklingsköljningen i sterila centrifugflaskor. Centrifugera vid 10 000 x g i 10 minuter i rumstemperatur.
- Samla försiktigt upp supernatanten med hjälp av en motoriserad pipettkontroll med en 25 ml serologisk engångspipett av plast. Undvik att störa pelleten.
- Upprepa processen vid behov för att säkerställa att all supernatant har avlägsnats.
- Kassera den insamlade supernatanten.
2. Selektiv berikning av Campylobacter från rått kött
- Beredning av Boltonbuljong med kosttillskott
- Lös upp 13,8 g pulver (se materialtabell) i 500 ml renat vatten. Sterilisera buljongen i autoklav i 15 minuter vid 121 °C.
- Tillsätt 25 ml lakat hästblod (se materialförteckning) till den steriliserade 500 ml Boltonbuljongen.
OBS: Tillsatsen av hästblod fungerar som ett syresläckande medel för att hjälpa till att återhämta skadade Campylobacter-celler från fodermatrisen. - Bered 1 injektionsflaska med antibiotikatillskott (cefoperazon, cykloheximid, trimetoprim och vankomycin, se Materialförteckning) i 5 ml 50 % etanol.
- Tillsätt det rekonstituerade antibiotikatillskottet till Boltonbuljongen.
- Förfarande för anrikning
- Återsuspendera pelleten i 50 ml Boltonbuljong som innehåller lakat hästblod och antibiotika.
- Placera samples (med lossade lock) i en förseglad behållare som håller en gasblandning på 85 % N2 , 10 % CO2 och 5 % O2 .
- Se till att locket är löst, men att behållaren är tätt försluten för att producera de mikroaerofila och termofila tillväxtkraven för Campylobacter.
OBS: Gaspaket som upprätthåller en atmosfär på 85 % N2 , 10 % CO 2 och 5 % O2 kan användas när miljökammare inte är tillgängliga. - Inkubera proverna vid 42 °C i 24 timmar.
- Se till att locket är löst, men att behållaren är tätt försluten för att producera de mikroaerofila och termofila tillväxtkraven för Campylobacter.
3. Isolering och rening av C. jejuni och C. coli från rå kyckling
- Beredning av Brucella-agarplattor
- Lös upp 28 g brucellapulver (se materialtabell) i 1 l renat vatten. Lös upp 15 g agar i Brucella-lösningen.
- Sterilisera Brucella-agar i autoklav i 15 minuter vid 121 °C. Kyl medelagarblandningen i ett 55 °C vattenbad.
- Häll 20 ml Brucella-agar i varje petriskål med en diameter på 100 mm.
- Filtermetod och koloniodling
- Utvärdera effekten av fukt på Campylobacter som passerar genom filter genom att torka Brucella-agarplattor med öppna lock i ett biosäkerhetsskåp i 0 timmar, 1 timmar, 2 timmar och 3 timmar.
- Bered en kontroll utan filter genom att direkt sprida 80 μL av provet på Brucella-agarplattan.
- Placera ett cellulosaacetatfilter (0.45 μm eller 0.65 porstorlek, se materialtabell) i mitten av en Brucella-agarplatta.
- Pipettera över 4 droppar/filter och 20 μl/droppe anrikat prov på filtret.
- Placera dropparna nära mitten av filtret för att säkerställa att vätskan som når plattan går genom filtret, inte runt filtret.
- Placera dropparna på ett sätt som säkerställer att de inte sprids och aggregeras.
- Inkubera dropparna i rumstemperatur i 15 minuter och ta försiktigt bort filtren.
OBS: Detta steg ger tillräckligt med tid för Campylobacter-cellerna att passera membranet och nå agarmediet utan överdriven torkning. - Inkubera plattorna vid 42 °C i cirka 24 timmar under de mikroaeroba förhållanden som beskrivits ovan.
- Välj karakteristiska Campylobacter-kolonier med specifika egenskaper.
OBS: Campylobacterkolonier är vanligtvis runda med släta kanter, glittrande och genomskinlig gulaktig eller rosaaktig färg6. - Stryk kolonier på Brucella-agarplattor för rening. Upprepa detta steg tills plattor med en enda enhetlig kolonimorfologi erhålls.
- Förbered prover för långtidsförvaring.
- Förbered Boltonbuljong enligt beskrivningen ovan. Lägg till ett samhälle från plattan med enhetlig kolonimorfologi.
- Odla över natten (24 timmar) under mikroaerofila förhållanden som beskrivits tidigare. Tillsätt 900 μl av nattkulturen till en 2 ml kryovial som innehåller 100 μl DMSO.
- Låt svalna snabbt i ett torris-etanolbad (ca -72 °C) i 10 min. Överför till en frys på -80 °C för långtidsförvaring.
4. Identifiering av C. jejuni- och C. coli-arter
- Utför artnivåidentifiering av C. jejuni och C. coli med hjälp av en multiplex qPCR (mqPCR) analys som tidigare utvecklats18,19.
- Utför snabb celllys och genomisk DNA-extraktion i ett 96-brunnars plattformat.
OBS: Det rekommenderas starkt att överväga att använda kommersiella kit (se materialförteckning) för att säkerställa att sample är tillräckligt fri från kända hämmare av PCR.- Späd upp renade Campylobacterkolonier i 100 μl extraktionslösning.
- Lyseproverna vid 99 °C i 10 minuter följt av kylning vid 20 °C i 2 minuter i en termocykler.
- Centrifugera plattan vid 8 000 x g i 10 minuter i rumstemperatur. Avlägsna 2 μl alikvoter av supernatanten för mqPCR-testet.
- Bered en 20 μL reaktionsblandning bestående av 10 μL 2x Master Mix, 2.0 μL DNA-prov, 104 kopior av IAC-mallen (Internal Amplification Control) och 200 nM av varje primer och sond (se materialförteckning).
OBS: Primrarna och proberna för hipO och cdtA är de exklusiva målgenerna för C. jejuni respektive C. coli. IAC består av ett 79-bp DNA-segment av det humana adenoviruset och ingår som en positiv kontroll för att säkerställa konsekvent aktivitet av DNA-polymeras i alla prover.
- Ladda alla prover i tre exemplar i en 96-håls optisk platta täckt med en optisk film och placera dem i ett realtids-PCR-system (se materialförteckning).
- Initiera en varmstartsaktivering av DNA-polymeraset vid 95 °C i 10 minuter. Följ med 40 cykler av denaturering vid 95 °C i 15 s och glödgning/förlängning vid 60 °C i 1 min.
- Utför snabb celllys och genomisk DNA-extraktion i ett 96-brunnars plattformat.
5. Räkna upp cellsuspensioner
- Räkna upp cellsuspensioner med hjälp av en 6 x 6 droppplatta-procedur20. Se Supplemental File 1 för bilder som visar metoden med 6 x 6 droppplatta.
- Lufttorka Brucella-agarplattorna med locket av i en laminär flödeshuv i 45 min.
- Tillsätt 200 μl bakteriesuspension till sex rader (AF) i den första kolonnen på en platta med 96 hål.
- Fördela 180 μL Brucella-medium över sex rader i de återstående kolonnerna (2-12).
- Bered tiofaldiga seriespädningar med 20 μL-transfer.
- Överför t.ex. 20 μL prov från kolumn ett till kolumn två. Upprepa denna process i minst 6 kolumner.
- Återflöde Blanda varje suspension tio gånger med hjälp av pipetten, byt spetsar mellan varje överföring.
- Använd en flerkanalspipett för att deponera 7 μL droppar från sex rader i en kolonn på ytan av en Brucella-agarplatta.
- Upprepa för att skapa en 6 x 6-matris och se till att rader är tekniska repliker mellan kolumner.
- Lufttorka plattorna i 5 minuter och vänd sedan plattan upp och ner. Inkubera plattorna vid 42 °C i 24 timmar.
- Räkna antalet kolonier i varje representativ utspädning.
Representative Results
Effekt av fukt i Brucella-agarplattor för passiv filtrering av Campylobacter
Campylobacter har en liten arvsmassa och saknar flera stressresponsgener som är vanligt förekommande hos andra bakterier, till exempel E. coli O157:H7 och Salmonella. Därför är den mer känslig för olika miljöpåfrestningar och tål inte uttorkning eller omgivande syrenivåer. Omvänt kan ett alltför fuktigt agarmedium översvämma filtret. Detta orsakar inte bara diffusion av provet till utanför filtret, utan ökar också exponeringstiden för syre21.
För att bestämma lämpliga förhållanden för filterbaserad isolering av Campylobacter torkades Brucella-agarplattorna med locken borttagna i 0 timmar, 1 timme, 2 timmar och 3 timmar i ett biologiskt säkerhetsskåp och bedömdes med avseende på Campylobacter-cellernas effektivitet när det gäller att passera ett filter med en porstorlek på 0,65 μm. Fyra 20 μL alikvoter av C. jejuni S27-kulturer i koncentrationerna 1,53 x 104 och 1,53 x 105 CFU/ml pipetterades på varje filtermembran som hade placerats ovanpå en Brucella-platta. Efter 15 minuters penetration togs filtren bort och plattorna inkuberades över natten för celltillväxt.
Celler från 5 replikerade plattor räknades sedan och noterades i tabell 1. Resultaten indikerade att agarplattorna som torkats i 2 timmar och 3 timmar presterade på liknande sätt med nästan lika många celler som återfanns från passiv filtrering. Märkbart är att plattorna som torkade under dessa förhållanden i 0 timmar och 1 timme inte tillät cellerna att helt passera membranet inom den 15 minuter långa tidsperiod som användes.
Jämförelse av filtermembran i olika porstorlekar för isolering av Campylobacter från kycklinglever
Med tanke på Campylobacter-cellstorlekarna (0,5-5 μm i längd och 0,2-0,9 μm i bredd) och ett brett spektrum av matpartikelstorlekar, testades cellulosaacetatfilter med 0,45 μm och 0,65 μm porstorlekar för effektiviteten av Campylobacter-passagen när de fick en inkubationstid på 15 minuter. Livsmedelsprover bestående av 450 g kycklinglever spetsade med 153 CFU av C. jejuni och sedan berikade över natten användes för experimentet. Som en no-filter-kontroll inkluderades direkt plätering av anrikningsprovet parallellt. Resultaten (Figur 2) från 5 replikatplattor visade konsekvent att filtret med en porstorlek på 0,65 μm tillät fler celler att passera än filtren med en porstorlek på 0,45 μm, vilket resulterade i ökningar på ~29 gånger fler erhållna celler. Filtret med en porstorlek på 0,45 μm behöll för många celler på filtrets ovansida, vilket resulterade i en betydligt lägre återvinning av Campylobacter från föda jämfört med filtret med en porstorlek på 0,65 μm. Som väntat fanns det en gräsmatta med olika bakgrundsorganismer som växte på kontrollplattorna utan filter.
Applicering av passiv filtrering vid isolering av Campylobacter från kyckling i detaljhandeln
På grund av den ovanliga rörligheten hos Campylobacter-celler valdes den passiva filtreringstekniken för isolering av C. jejuni och C. coli från köttprodukter i detaljhandeln, som vanligtvis är kontaminerade med många bakgrundsorganismer. Mellan åren 2014-2023 samlades totalt 79 råa köttförpackningar, inklusive olika delar av kycklingkött, kycklinglever, nötlever och kalvlever, in från olika lokala stormarknader. Från varje förpackning provtogs 450 g för isolering av Campylobacter spp. Genom att kombinera selektiv anrikning av Campylobacter i blodhaltig Boltonbuljong och passiv filtrering av cellerna genom ett cellulosaacetatfilter med en porstorlek på 0,65 μm direkt på en Brucella-agarplatta har 49 Campylobacterstammar framgångsrikt isolerats från 79 köttprover (tabell 2). Figur 3 visar resultatet av att isolera en ny Campylobacter-stam från kycklinglever. Metoden har upprepade gånger visat sig vara känslig, specifik och kostnadseffektiv.
Identifiering och differentiering av C. jejuni- och C. coli-isolat
För att verifiera släktet och särskilja arterna av Campylobacter-isolat erhållna från rått kött, användes en multiplex qPCR-analys som amplifierade de specifika genmålen (hipO och cdtA) för C. jejuni och C. coli, och en intern amplifieringskontroll (IAC). IAC inkluderades som en falskt negativ indikator i den samtidiga amplifieringen av flera gener. Analysen genomfördes i ett 96-hålsformat med snabb celllys och DNA-extraktion med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt reagens (se materialtabell). Tabell 2 sammanfattar resultatet av artbestämningen av stammarna C. jejuni och C. coli . Som ytterligare verifiering bekräftade helgenomsekvenseringsresultaten arten av alla isolat (data visas inte).
Figur 1: Ett arbetsflödesdiagram för isolering och identifiering av Campylobacter-arter från kött i detaljhandeln. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Effekten av filterstorlek på återhämtning av Campylobacter. Resultaten indikerar att 0,65 μm-filtret kan återvinna i genomsnitt 900 ± 138 samhällen, medan 0,45 μm-filtret återvinner 31 ± 7 samhällen. Resultaten genererades från N = 20 (5 plattor med 4 droppar/platta) och ett Students t-test indikerar att medelvärdena är statistiskt olika (p < 0,0001). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Isolering av Campylobacter genom passiv filtrering av berikade fjäderfäprover. A) Avbildar de fyra 20 μL dropparna av anrikat prov som deponerats på nitrocellulosamembranfiltret. Bilden samlades in under de 15 minuterna av passiv filtrering. (B) Avbildar plattan efter att nitrocellulosafiltret tagits bort. De fyra fläckarna anger var det anrikade provet passerade membranet. (C) Avbildar plattan efter 24 timmars inkubation. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Effekten av torktiden för Brucella-agarplattor på den passiva filtreringen av C. jejuni. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Stammar av C. jejuni och C. coli isolerade från rått kött. Under tidsperioden 2008–2023 isolerades 36 C. jejuni - och 13 C. coli-stammar från 79 köttförpackningar i 24 unika detaljhandelsprodukter. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tilläggsfil 1: Bilder under isolerings- och uppräkningsprocesserna. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Protokollets betydelse
C. jejuni och C. coli var de två viktigaste arterna av Campylobacter som var vanliga hos fjäderfä22 och djurlever23,24. I denna studie samlades köttprover från kycklingdelar (ben, vingar och lår), kycklinglever och nötlever slumpmässigt in under olika tidsperioder och från olika butiker och tillverkare för isolering av Campylobacter spp. Av de totalt 49 isolerade Campylobacter-stammarna identifierades 36 som C. jejuni och 13 som C. coli, utan att några andra Campylobacter-arter hittades, vilket överensstämmer med andra rapporter25.
Analysen är baserad på den spiralformade cellmorfologin och den karakteristiska korkskruvsliknande motiliteten hos Campylobacter spp. En enkel, men effektiv, passiv filtreringsteknik26,27 som utnyttjade dess spiralformade cellmorfologi (lång, smal, 0,2-0,9 x 0,5-5 μm) och starka korkskruvsrörlighet användes för att separera Campylobacter från en blandning av bakgrundsorganismer. Den höga rörligheten hos Campylobacter gjorde det möjligt för cellerna att passera membranfiltren och röra sig mot gynnsamma förhållanden som finns i agarmediet, medan andra bakgrundsmikroorganismer från köttprodukterna inte kunde passera igenom. Denna metod är relativt billig, snabb och selektiv, vilket gör den lämplig för användning i en mängd olika miljöer, inklusive livsmedelsbearbetningsanläggningar, kliniska laboratorier och forskningslaboratorier.
En banbrytande artikel som ofta citeras säger att 0,45 μm-filtret fungerade så bra att 0,65 μm inte utvärderades28. Resultaten från den aktuella studien indikerar att filtret med en porstorlek på 0,65 μm presterade betydligt bättre än ett porstorlek på 0,45 μm, vilket resulterade i en 29-faldig ökning av antalet celler som återhämtades från anrikningen. Detta är viktigt eftersom de valda filtren inte visar minskad selektivitet som tidigare rapporterats29. Vidare, eftersom det är känt att filtrering avsevärt minskar mängden Campylobacter som återvinns jämfört med direkt plätering30, förbättrar därför en ökning av porstorleken återhämtningen av mikroorganismen, vilket överensstämmer med tidigare rapporterade fynd21. Detta är viktigt eftersom alla celler som passerade filtren bildade enhetliga Campylobacter-kolonier , vilket tyder på att båda filtren var tillräckliga för att hindra annan mikroflora och matpartiklar från att passera igenom. Dessutom noterar FSIS-flödesschema7 potentialen för förlängd resultatproduktion på grund av återstrimmiga isolat på Campy-Cefex-plattor som innehåller antibiotika. Däremot har det protokoll som beskrivs i detta manuskript, som kombinerar användningen av filtrering och selektiv anrikning med cefoperazon, cykloheximid, trimetoprim och vankomycin, inte krävt omstrykning.
Den nuvarande metoden som används överensstämmer med FSIS nuvarande provtagnings- och kontrollprogram17. Eftersom nivån av Campylobacter-kontamination kan vara låg (153 CFU/450 g kyckling) centrifugeras sköljningen så att provet koncentreras med en faktor fyra, vilket ökar analysens känslighet. Efter att ha koncentrerat sköljet med en faktor 4 x anrikas proverna i 48 timmar och screenas med Molecular Detection System (MDS) för att replikera den metod som används av FSIS-laboratorier (data visas inte). Noterbart är att den beskrivna metoden ännu inte har misslyckats med att identifiera positiva stammar inom 24 timmar som detekterades av det molekylära detektionssystemet med 48 timmars anrikning (data visas inte). Slutligen är en ytterligare fördel med detta protokoll att det kan ge information relaterad till bakteriearten och identifiera om Campylobacter är C. coli, C. jejuni eller C. lari, medan MDS som används i MLG 41.07 endast kan ge ett binärt positivt/negativt svar för Campylobacter.
Kritiska steg
Protokollet för isolering och identifiering av Campylobacter kräver precision under centrifugering, filtrering och molekylär analys. Noggranna utspädningar, korrekta inkubationsförhållanden och noggrann efterlevnad av qPCR-analysförhållanden är avgörande för tillförlitlig artidentifiering.
Som en mikroaerofil bakterie är Campylobacter mycket ömtålig och känslig för olika miljöpåfrestningar och kräver unika krångliga förhållanden för tillväxt 31,32,33. I livsmedelsprover som vanligtvis genomgår långa perioder av transport och lagring är många Campylobacter-celler kanske i en dvala eller subletalt/dödligt skadat tillstånd34,35. Därför är det viktigt att återvinna de stressade cellerna från deras matmatriser och odla dem till en högre koncentration. I det första steget av proceduren använde vi Bolton buljong kompletterad med lakat hästblod och antibiotika för selektiv berikning av Campylobacter från mat. Tilläggsblodet fungerade som ett syresläckningsmedel för att övervinna de negativa effekterna av fria syreradikaler36. Antibiotikan användes för att hämma tillväxten av bakgrundsmikrofloran37.
För att minimera exponeringstiden för Campylobacter för omgivande atmosfäriskt syre valdes en inkubationstid på 15 minuter för att tillåta cellerna att passera filtret. Fukten i Brucella-agarplattan under filtret spelade också en viktig roll för passagehastigheten. Specifikt tydde resultaten från testning av agarplattor som torkats i 0 h, 1 h, 2 h och 3 h på att en hög fukthalt i filtret hindrade celler från att passera igenom. Lika viktigt är den exakta placeringen av filter och droppar på plattorna och filtren, som båda påverkar framgången med att isolera celler.
Potentiella fallgropar och begränsningar
Samtidigt som man presenterar ett strukturerat tillvägagångssätt för att isolera och identifiera Campylobacter-arter från råa kycklingprover, förtjänar flera begränsningar i detta protokoll att uppmärksammas. Extern kontaminering, otillräckligt torkade plattor, igensättning av filter som hindrar mikrobiell rörelse, instängning av mikroorganismerna i pelleten, ofullständig tätning av den atmosfäriska kammaren och droppar som sprider sig utanför filtergränserna är bland de främsta fallgroparna.
Otillräcklig separation av mikroorganismerna från livsmedlens ytor eller deras inneslutning i huvuddelen av provet kan hindra isoleringen av dem med denna metod. Att förlita sig på mikrobiell rörlighet för passage genom passiva filter utgör dessutom en anmärkningsvärd begränsning; Det är möjligt att filtermembranen behöll några mindre rörliga Campylobacter-stammar , eftersom det har visats att filter kan minska infångningseffektiviteten hos mikrobiella patogener i livsmedel38. Ytterligare begränsningar omfattar centrifugerings- och filtreringsprocessernas satsvisa karaktär, känslighet för igensättning av filter och ineffektivitet vid spridning av den bildade pelleten, vilket kommer att påverka noggrannheten hos mikrobiella belastningar. Dessa begränsningar betonar sammantaget behovet av försiktighet och kompletterande metoder för att säkerställa omfattande analys, särskilt när man hanterar olika provtyper eller söker kapacitet med hög genomströmning.
Förslag på felsökning
För att förebygga potentiella problem, se först till att allt material följer de nödvändiga kvalitetsstandarderna och inte har gått ut. Felsök igensatta filter genom att eventuellt använda en extra filtrering för att avlägsna alla stora föroreningar som kan begränsa passagen av Campylobacter genom nitrocellulosamembranet. Om kontaminering observeras, kontrollera att dropparna inte placerades för nära filtrets kant och tillät vätska att nå agarn genom att gå runt filtret i motsats till genom porerna. Om det inte finns tillräcklig tillväxt efter anrikning, kontrollera att tätningarna på de atmosfäriska behållarna är täta och inte läcker.
Potentiell förfining och expansion
Att utforska alternativa filtermaterial kan förbättra mikrobiell passage och göra det möjligt att utöka detta protokoll för användning för att isolera andra rörliga mikroorganismer från heterogena blandningar som livsmedel. Det rekommenderas att identifiera kontroller för att behålla mindre rörliga Campylobacter-varianter utan att påverka specificiteten negativt. Dessutom, medan den multiplexerade qPCR-analysen som användes i denna studie visade sig ha förmågan att detektera C.lari18 , kan andra Campylobacter-arter av intresse inkluderas i denna analys.
Sammanfattningsvis, genom att utvärdera olika parametrar och inställningar, fastställdes lämpliga förhållanden för filterbaserad isolering och artnivåidentifiering av C. jejuni och C. coli från livsmedel. Metoden har visat sig vara känslig, specifik, robust och kostnadseffektiv. Genom att tillämpa det på riktiga livsmedelsprover kunde protokollet isolera 36 C. jejuni - och 13 C. coli-stammar från 79 köttförpackningar.
Protokollet är anpassat till FSIS-direktivet 10,250.117, som beskriver förfarandet för provtagning av råa kycklingdelar, och MLG 41.076 för isolering och identifiering av Campylobacter. Data tyder på att koncentration av provet med 4x och anrikning i 24 timmar, i kombination med filtrering och plätering, ger isolerade, bekräftade kolonier inom 48 timmar i motsats till 96 timmar. Protokollet är kompatibelt med DNA-baserade metoder som genomsekvensering för att ge en omfattande karakterisering av Campylobacter-stammar , inklusive deras antimikrobiella resistensprofiler, virulensförutsägelser och fylogenetiska relationer. Protokollet utgör ett lovande alternativ för effektiv återhämtning och isolering av Campylobacter spp. från rått fjäderfä, vilket kan underlätta epidemiologiska studier och folkhälsoinsatser.
Disclosures
Samtliga författare förklarar att det inte föreligger någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service (USDA-ARS), National Program 108, Current Research Information System-nummer 8072-42000-093 och 8072-42000-094-000-D. Omnämnande av handelsnamn eller kommersiella produkter i denna artikel är endast i syfte att tillhandahålla specifik information och innebär inte rekommendation eller godkännande av U.S. Department of Agriculture. USDA är en leverantör av lika möjligheter och arbetsgivare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar - Solidifying Agent (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 281230 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | JL602-G/L | Equipment |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S | Equipment |
| Antibiotic supplements cefoperazone, cycloheximide, trimethoprim, vancomycin | Oxoid Ltd. | SR0183E | |
| Atmosphere Control Gas Pak (Campy, 85% N2, 10% CO2, and 5% O2) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260680 | |
| Atmosphere Control Vessel, GasPak EZ CampyPak container system | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260678 | |
| Autoclave - Amsco Lab250, Laboratory Steam Sterilizer | Steris plc | LV-250 | Equipment |
| Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+ | Labconco Corporation | 302411101 | Equipment |
| Bolton broth | Oxoid Ltd. | CM0983 | |
| Brucella broth (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 211088 | |
| Buffered Peptone Water | Bio-Rad Laboratories Inc. | 3564684 | |
| Centrifuge Microcentrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 | Equipment |
| Centrifuge, Avanti J-25 | Beckman Coulter, Inc. | Equipment | |
| Chicken thighs, wings, drumsticks, livers | Local retailers | ||
| DNA Extraction - PreMan Ultra Sample Preparation Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4318930 | |
| FAM probe for hipO (Sequence 5'-TTGCAACCTCACTAGCAAAATCC ACAGCT-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Filter - 0.45 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | DAWP04700 | |
| Filter - 0.65 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | HAWG04700 | |
| forward primer for cdtA (Sequence 5'-TGTCAAACAAAAAACACCAAGCT T-3' ') |
Integrated DNA Technologies | ||
| forward primer for hipO (Sequence 5'-TCCAAAATCCTCACTTGCCATT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| forward primer for IAC (Sequence 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| HEX probe for cdtA (Sequence 5'-AAAATTTCCCGCCATACCACTTG TCCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Incubator - Inova 4230 refrigerated incubator shaker | New Brunswick Scientific | 4230 | Equipment |
| Inoculating Loop - Combi Loop 10µL and 1µL | Fisher Scientific International, Inc | 22-363-602 | |
| Internal Amplification Control (IAC) DNA fragment (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTAT GTGGTGGCATTGTCTTCTCCC GTTGTAACTATCCACTGAGATG TGTTAGGCGCGCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Laked horse blood | Remel Inc. | R54072 | |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Mettler Toledo | 17014382 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | Mettler Toledo | 17014384 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | Mettler Toledo | 17014388 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Mettler Toledo | 17014391 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Mettler Toledo | 17014392 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Mettler Toledo | 17013805 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+ | Mettler Toledo | 17013803 | Equipment |
| Media Storage Bottle -PYREX 1 L Square Glass Bottle, with GL45 Screw Cap | Corning Inc. | 1396-1L | Equipment |
| Media Storage Bottle -PYREX 2 L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw Cap | Corning Inc. | 1397-2L | Equipment |
| Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34 cm2, sterile, 108/cs | MilliporeSigma | Z707902 | |
| Mixer - Vortex Genie 2 | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | Equipment |
| Motorized pipette controller, PIPETBOY2 | INTEGRA Biosciences Corp. | Equipment | |
| PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4369542 | |
| Petri Dish Rotator - bioWORLD Inoculation Turntable | Fisher Scientific International, Inc | 3489E20 | Equipment |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm) | Fisher Scientific International, Inc | FB0875713 | |
| Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8 | Mettler Toledo | 30389273 | |
| Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10 | Mettler Toledo | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10 | Mettler Toledo | 30389276 | |
| Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettors | Thermo Fisher Scientific Inc. | 8093-11 | |
| Realtime PCR - 7500 Real-Time PCR system | (Applied Biosystems, Foster City, CA) | Equipment | |
| reverse primer for cdtA (Sequence 5'-CCTTTGACGGCATTATCTCCTT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| reverse primer for hipO (Sequence 5'-TGCACCAGTGACTATGAATAACG A-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| reverse primer for IAC (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA -3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170356N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170372N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170357N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170376N | |
| Spreader - Fisherbrand L-Shaped Cell Spreaders | Fisher Scientific International, Inc | 14-665-230 | |
| Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter Bags | Thermo Fisher Scientific Inc. | 01-812 | |
| TAMRA probe for IAC (Sequence 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCC ACCA-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700) | Applied Biosystems | Equipment | |
| Water Filtration - Elga Veolia Purelab Flex | Elga LabWater | PF2XXXXM1-US | Equipment |
References
- Rushton, S. P., et al. Climate, human or environment: Individual-based modelling of Campylobacter seasonality and strategies to reduce disease burden. J Transl Med. 17 (1), 34 (2019).
- Facciolà, A., et al. Campylobacter: From microbiology to prevention. J Prev Med Hyg. 58 (2), E79-E92 (2017).
- Perez-Arnedo, I., Gonzalez-Fandos, E. Prevalence of Campylobacter spp. In poultry in three spanish farms, a slaughterhouse and a further processing plant. Foods. 8 (3), 111 (2019).
- Nachamkin, I., Allos, B. M., Ho, T. Campylobacter species and guillain-barré syndrome. Clin Microbiol Rev. 11 (3), 555-567 (1998).
- Department of Food Administration.
- USDA Office of Public Health Science. Isolating and identifying Campylobacter jejuni/coli/lari from poultry rinsate, sponge and raw product samples. Microbiology Laboratory Guidebook. , (2022).
- Singh, H., Rathore, R. S., Singh, S., Cheema, P. S. Comparative analysis of cultural isolation and PCR based assay for detection of Campylobacter jejuni in food and faecal samples. Braz J Microbiol. 42 (1), 181-186 (2011).
- Kralik, P., Ricchi, M. A basic guide to real time pcr in microbial diagnostics: Definitions, parameters, and everything. Front Microbiol. 8, (2017).
- Linton, D., Lawson, A. J., Owen, R. J., Stanley, J. PCR detection, identification to species level, and fingerprinting of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli direct from diarrheic samples. J Clin Microbiol. 35 (10), 2568-2572 (1997).
- Kabiraz, M. P., Majumdar, P. R., Mahmud, M. M. C., Bhowmik, S., Ali, A. Conventional and advanced detection techniques of foodborne pathogens: A comprehensive review. Heliyon. 9 (4), e15482 (2023).
- Kaakoush, N. O., Castaño-Rodríguez, N., Mitchell, H. M., Man, S. M.
- Gilbreath, J. J., Cody, W. L., Merrell, D. S., Hendrixson, D. R. Change is good: Variations in common biological mechanisms in the epsilonproteobacterial genera Campylobacter and Helicobacter. Microbiol Mol Biol Rev. 75 (1), 84-132 (2011).
- Lertsethtakarn, P., Ottemann, K. M., Hendrixson, D. R. Motility and chemotaxis in campylobacter and helicobacter. Annu Rev Microbiol. 65, 389-410 (2011).
- Jokinen, C. C., et al. An enhanced technique combining pre-enrichment and passive filtration increases the isolation efficiency of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from water and animal fecal samples. J Microbiol Methods. 91 (3), 506-513 (2012).
- Engberg, J., On, S. L., Harrington, C. S., Gerner-Smidt, P. Prevalence of Campylobacter, Arcobacter, Helicobacter, and Sutterella spp. In human fecal samples as estimated by a reevaluation of isolation methods for Campylobacters. J Clin Microbiol. 38 (1), 286-291 (2000).
- Lastovica, A. J., Le Roux, E. Efficient isolation of campylobacteria from stools. J Clin Microbiol. 38 (7), 2798-2799 (2000).
- USDA. Salmonella and Campylobacter verification program for raw poultry products. FSIS Directive 10250.1. 10000 Series: Laboratory Services. USDA. , (2021).
- He, Y., et al. Simultaneous detection and differentiation of Campylobacter jejuni, c. Coli, and c. Lari in chickens using a multiplex real-time PCR assay. Food Anal Methods. 3, 321-329 (2010).
- Suo, B., He, Y., Tu, S. -I., Shi, X. A multiplex real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of salmonella spp., escherichia coli o157, and listeria monocytogenes in meat products. Foodborne Pathog Dis. 7 (6), 619-628 (2010).
- Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. A 6 x 6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, listeria monocytogenes, and escherichia coli. J Microbiol Methods. 55 (2), 475-479 (2003).
- Speegle, L., Miller, M. E., Backert, S., Oyarzabal, O. A. Use of cellulose filters to isolate Campylobacter spp. From naturally contaminated retail broiler meat. J Food Prot. 72 (12), 2592-2596 (2009).
- Guirin, G. F., Brusa, V., Adriani, C. D., Leotta, G. A. Prevalence of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from broilers at conventional and kosher abattoirs and retail stores. Rev Argent Microbiol. 52 (3), 217-220 (2020).
- Noormohamed, A., Fakhr, M. K. A higher prevalence rate of Campylobacter in retail beef livers compared to other beef and pork meat cuts. Int J Environ Res Public Health. 10 (5), 2058-2068 (2013).
- Walker, L. J., et al. Prevalence of Campylobacter coli and Campylobacter jejuni in retail chicken, beef, lamb, and pork products in three Australian states. J Food Prot. 82 (12), 2126-2134 (2019).
- Zhao, C., et al. Prevalence of Campylobacter spp., Escherichia coli, and Salmonella serovars in retail chicken, turkey, pork, and beef from the greater Washington, D.C., area. Appl Environ Microbiol. 67 (12), 5431-5436 (2001).
- Honsheng, H., Manuel Mariano, G. Campylobacter. Guillermo, T. -I., Saeed, E. -A. , IntechOpen. Rijeka. (2022).
- He, Y., et al. Rapid identification and classification of Campylobacter spp. using laser optical scattering technology. Food Microbiol. 47, 28-35 (2015).
- Steele, T. W., Mcdermott, S. N. The use of membrane filters applied directly to the surface of agar plates for the isolation of Campylobacter jejuni from feces. Pathology. 16 (3), 263-265 (1984).
- Bourke, B., Chan, V. L., Sherman, P.
- Berrang, M. E., Meinersmann, R. J., Cox, N. A. Passage of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli subtypes through 0.45- and 0.65-micrometer-pore-size nitrocellulose filters. J Food Prot. 80 (12), 2029-2032 (2017).
- Hill, G. N., et al. Optimizing enrichment of Campylobacter on poultry. J App Poult Res. 26 (3), 307-315 (2017).
- Kim, J. C., Oh, E., Kim, J., Jeon, B. Regulation of oxidative stress resistance in Campylobacter jejuni, a microaerophilic foodborne pathogen. Front Microbiol. 6, 751 (2015).
- Nennig, M., et al. Metaphenotypes associated with recurrent genomic lineages of Campylobacter jejuni responsible for human infections in luxembourg. Front Microbiol. 13, (2022).
- Moore, J. E. Bacterial dormancy in Campylobacter: Abstract theory or cause for concern. Int J Food Sci Technol. 36 (6), 593-600 (2001).
- Saha, S., Saha, S., Sanyal, S. Recovery of injured Campylobacter jejuni cells after animal passage. Appl Environ Microbiol. 57 (11), 3388-3389 (1991).
- Baylis, C. L., Macphee, S., Martin, K. W., Humphrey, T. J., Betts, R. P. Comparison of three enrichment media for the isolation of Campylobacter spp. From foods. J Appl Microbiol. 89 (5), 884-891 (2000).
- Line, J. E. Development of a selective differential agar for isolation and enumeration of Campylobacter spp. J Food Prot. 64 (11), 1711-1715 (2001).
- Armstrong, C. M., et al. Impacts of clarification techniques on sample constituents and pathogen retention. Foods. 8 (12), 636 (2019).
