Summary
Campylobacter er den ledende årsaken til bakteriell matbåren gastroenteritt over hele verden. Til tross for at virksomheter iverksetter tiltak for å redusere utbredelsen i sine anlegg, når forurensede produkter konsekvent forbrukerne. Teknikken utviklet de siste tolv årene adresserer begrensninger i eksisterende metoder for å isolere og oppdage Campylobacter spp. fra rått kjøtt.
Abstract
Denne artikkelen presenterer en rask, men robust protokoll for å isolere Campylobacter spp. fra rått kjøtt, spesielt med fokus på Campylobacter jejuni og Campylobacter coli. Protokollen bygger på etablerte metoder, og sikrer kompatibilitet med de rådende teknikkene som brukes av reguleringsorganer som Food and Drug Administration (FDA) og US Department of Agriculture (USDA) i USA, samt International Organization for Standardization (ISO) i Europa. Sentralt i denne protokollen er å samle et skylling, som er konsentrert og resuspendert i Bolton Broth media som inneholder hesteblod. Dette mediet har vist seg å lette utvinningen av stressede Campylobacter-celler og redusere den nødvendige anrikningsvarigheten med 50%. De berikede prøvene overføres deretter til nitrocellulosemembraner på brucellaplater. For å forbedre metodens sensitivitet og spesifisitet ble 0,45 μm og 0,65 μm porestørrelsesfiltermembraner evaluert. Data viste en 29 ganger økning i celleutvinning med 0,65 μm porestørrelsesfilter sammenlignet med 0,45 μm porestørrelse uten å påvirke spesifisiteten. De svært bevegelige egenskapene til Campylobacter tillater celler å bevege seg aktivt gjennom membranfiltrene mot agarmediet, noe som muliggjør effektiv isolering av rene Campylobacter-kolonier . Protokollen inkorporerer multiplex kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjonsanalyse (mqPCR) for å identifisere isolatene på artsnivå. Denne molekylære teknikken gir et pålitelig og effektivt middel for artsidentifikasjon. Undersøkelser utført de siste tolv årene med detaljhandel kjøtt har vist evnen til denne metoden for å øke utvinningen av Campylobacter fra naturlig forurenset kjøtt prøver sammenlignet med dagens referansemetoder. Videre har denne protokollen redusert forberedelses- og behandlingstid. Som et resultat presenterer det et lovende alternativ for effektiv utvinning av Campylobacter fra kjøtt. Videre kan denne prosedyren integreres sømløst med DNA-baserte metoder, noe som muliggjør rask screening av positive prøver sammen med omfattende helgenomsekvenseringsanalyse.
Introduction
Campylobacter spp. er den ledende årsaken til bakteriell matbåren gastroenteritt over hele verden, med anslagsvis 800 millioner tilfeller årlig1. Som en stor zoonotisk bakterie koloniserer Campylobacter naturlig mage-tarmkanalen til et bredt spekter av dyr, inkludert ville fugler, husdyr og kjæledyr2. Under slakting eller matforedling forurenser Campylobacter spp. ofte eller kjøttprodukter3. Campylobacteriosis er vanligvis forbundet med forbruk av underkokt fjærfe eller krysskontaminering av andre matvarer av rå fjærfejuice2. Det kan forårsake alvorlige komplikasjoner, som Guillain-Barré syndrom, reaktiv artritt og septikemi hos immunkompromitterte individer4. Påvisning og isolering av Campylobacter fra matkilder, spesielt fjærfeprodukter, er avgjørende for folkehelseovervåking, utbruddsetterforskning og risikovurdering.
Konvensjonelle dyrkningsbaserte metoder er de tradisjonelle og standardmetodene for Campylobacter deteksjon 5,6. Det er imidlertid flere begrensninger, inkludert lange inkubasjonstider (48 timer eller mer), lav følsomhet (opptil 50 %), og er ikke inkluderende for alle stammer (noen stressede Campylobacter-celler vokser kanskje ikke bra eller i det hele tatt i media)7. Molekylære metoder, som polymerasekjedereaksjon (PCR), er raskere og mer følsomme enn kulturbaserte metoder, men de gir ikke levedyktige isolater for videre karakterisering 8,9.
Immunologiske metoder er alternative og komplementære metoder for påvisning av Campylobacter . Disse er raske, enkle og allsidige, men har også flere begrensninger, inkludert kryssreaktivitet (noen antistoffer kan binde seg til ikke-Campylobacter-bakterier eller andre stoffer som deler lignende antigener), lav spesifisitet (noen antistoffer binder seg kanskje ikke til alle Campylobacter-stammer eller serotyper) og krav til prøvepreparering (immunologiske metoder krever ofte forbehandling av prøvene for å fjerne forstyrrende stoffer for å forbedre bindingen av antistoffene)10.
Innenfor slekten Campylobacter forårsaker C. jejuni og C. coli de fleste humane Campylobacter-infeksjoner (henholdsvis 81 % og 8,4 %)11. Begge er spiralformede, mikroaerofile og termofile bakterier som inneholder et unipolart flagellum eller bipolar flagella. Rotasjon av et flagellum ved hver pol regnes både som den primære drivkraften for sin karakteristiske korketrekkermotilitet og avgjørende for dens patogenese fordi den tillater bakterien å svømme gjennom den viskøse slimhinnen i vertens mage-tarmkanal. Motiliteten til Campylobacter styres av dens kjemosensoriske system som gjør at cellene kan bevege seg mot gunstige miljøer12,13. Basert på cellemorfologien og fysiologiske egenskapene til Campylobacter, har noen få studier benyttet membranfiltrering for isolering av Campylobacter spp. fra fekale og miljømessige prøver 14,15,16.
Denne studien presenterer en rask og robust protokoll for isolering og etterfølgende påvisning av C. jejuni og C. coli fra rå kjøtt, som overvinter ulempene ved eksisterende metoder og gir flere fordeler. Tentative kolonier kan bekreftes som Campylobacter spp. ved hjelp av en rekke metoder, for eksempel mikroskopi, biokjemiske tester (f.eks. katalase- og oksidaseaktivitetsanalyser) eller molekylære metoder6. Metoden identifiserer isolatene på artsnivå ved hjelp av en multiplex real-time PCR (mqPCR) analyse som retter seg mot gener som er unike for C. jejuni og C. coli. Denne metoden er relativt billig, rask og selektiv, noe som gjør den egnet for bruk i en rekke innstillinger, inkludert matforedlingsanlegg, kliniske laboratorier og forskningslaboratorier.
Protocol
Alt arbeid knyttet til denne protokollen skal utføres innenfor et biologisk sikkerhetskabinett (BSC) for å opprettholde aseptiske forhold og minimere risikoen for prøvekontaminering eller operatøreksponering for mikrobielle patogener. Når du overfører prøver utenfor BSC, bruk forseglede beholdere for å forhindre søl i tilfelle utilsiktede fall, og oppretthold prøveintegriteten. Fortrinnsvis bør engangskomponenter brukes under hele prosedyren for å redusere muligheten for krysskontaminering. I tilfeller der engangsartikler ikke er mulig, må du sørge for at alt utstyr og materialer er sterile før bruk. Riktig avfallshåndtering er avgjørende; Alle brukte engangskomponenter skal kastes som biologisk farlig avfall. Autoklavmaterialer før kassering for å sikre riktig sterilisering og unngå inneslutning av potensielt farlige materialer. Overholdelse av disse forholdsreglene sikrer ikke bare prøvens integritet, men minimerer også risikoen for operatørens eksponering for mikrobielle patogener. Figur 1 viser arbeidsflyten for prøvepreparering, selektiv berikelse, filterbasert isolasjon og mqPCR-differensiering av Campylobacter-arter . Tilleggsfil 1 viser en mer detaljert arbeidsflyt og bilder gjennom hele prosessen.
1. Fremstilling av kjøttprøver
- Anskaffelse av kjøttprøver
- Skaff deg ulike ferske kjøttpakker, inkludert kyllinglår, vinger, trommestikker og lever fra lokale forhandlere.
- Overfør alle prøver til lagring ved 4 °C og behandle innen 24 timer etter mottak.
MERK: Lagring av ferske prøver ved lavere temperaturer, for eksempel under frysepunktet, vil påvirke utvinningen.
- Behandling av kjøttprøver
- Følg forholdet mellom komponenter foreskrevet i FSIS-prøvetakingsretningslinjen 6,17.
- Skjær 450 g kyllingbiter fra hver pakke og legg dem i en magepose (se materialfortegnelse).
MERK: Magesekker er foreslått fordi de har tilstrekkelig mekanisk styrke til å sikre nedstrøms prosesser, og vil ikke sprekke eller lekke. - Forbered bufret peptonvann (BPW).
- Løs opp 20 g av pulveret (se materialfortegnelse) i 1 liter renset vann. Autoklav oppløsningen ved 121 °C i 15 minutter. Fortynn løsningen i sterilt vann til en konsentrasjon på 0,1%.
- Tilsett 200 ml 0,1% BPW i magesekken som inneholder kyllingen.
- Masser/palpere prøven manuelt fra utsiden av magesekken i 2 min.
- Samle all kyllingskyll fra den filtrerte siden av posen ved hjelp av en motorisert pipettekontroller (se materialfortegnelse).
- Skyll kyllingen i sterile sentrifugeflasker. Sentrifuge ved 10 000 x g i 10 minutter ved romtemperatur.
- Oppsamling supernatanten forsiktig ved hjelp av en motorisert pipettekontroller med en 25 ml serologisk engangsplastpipette. Unngå å forstyrre pelleten.
- Gjenta prosessen etter behov for å sikre at all supernatanten fjernes.
- Kast den oppsamlede supernatanten.
2. Selektiv anrikning av Campylobacter fra rått kjøtt
- Tilberedning av Bolton Broth med kosttilskudd
- Løs opp 13,8 g pulver (se materialfortegnelse) i 500 ml renset vann. Steriliser buljongen ved autoklavering i 15 minutter ved 121 °C.
- Tilsett 25 ml innsjøet hesteblod (se materialfortegnelse) til den steriliserte 500 ml Bolton-buljongen.
MERK: Tilsetning av hesteblod fungerer som et oksygenslukkemiddel for å hjelpe til med utvinning av skadede Campylobacter-celler fra matmatrisen. - Rekonstituer 1 hetteglass med antibiotikatilskudd (cefoperazon, cykloheksimid, trimetoprim og vankomycin, se materialfortegnelse) i 5 ml 50 % etanol.
- Tilsett det rekonstituerte antibiotikatilskuddet til Bolton Broth.
- Berikelse prosedyre
- Resuspender pelleten i 50 ml Bolton buljong som inneholder innsjøhestblod og antibiotika.
- Plasser prøver (med løsnede lokk) inne i en forseglet beholder som opprettholder en gassblanding på 85% N2, 10% CO2 og 5% O2.
- Sørg for at hetten er løs, men beholderen er tett forseglet for å produsere de mikroaerofile og termofile vekstkravene til Campylobacter.
MERK: Gasspakker som opprettholder en atmosfære på 85% N2, 10% CO2 og 5% O2 kan brukes når miljøkamre ikke er tilgjengelige. - Inkuber prøvene ved 42 °C i 24 timer.
- Sørg for at hetten er løs, men beholderen er tett forseglet for å produsere de mikroaerofile og termofile vekstkravene til Campylobacter.
3. Isolering og rensing av C. jejuni og C. coli fra rå kylling
- Fremstilling av Brucella agarplater
- Løs opp 28 g Brucella pulver (se materialfortegnelse) i 1 liter renset vann. Løs opp 15 g agar i Brucella-oppløsningen.
- Steriliser Brucella-agaren ved autoklavering i 15 minutter ved 121 °C. Avkjøl blandingen av medium-agar i et vannbad på 55 °C.
- Hell 20 ml Brucella-agar i hver petriskål med diameter på 100 mm.
- Filtermetode og kolonidyrking
- Evaluer effekten av fuktighet på Campylobacter som passerer gjennom filtre ved å tørke Brucella-agarplater med lokk åpnet i et biosikkerhetsskap i 0 timer, 1 time, 2 timer og 3 timer.
- Forbered en ikke-filterkontroll ved å spre 80 μL av prøven direkte på Brucella-agarplaten.
- Plasser et celluloseacetatfilter (0,45 μm eller 0,65 porestørrelse, se Materialfortegnelse) i midten av en Brucella-agarplate.
- Pipette 4 dråper/filter og 20 μL/dråpe beriket prøve på filteret.
- Plasser dråpene nær midten av filteret for å sikre at væsken som når platen går gjennom filteret, ikke rundt filteret.
- Plasser dråpene på en måte som sikrer at de ikke sprer seg og aggregerer.
- Inkuber dråper ved romtemperatur i 15 minutter og fjern forsiktig filtrene.
MERK: Dette trinnet gir tilstrekkelig tid for Campylobacter-cellene til å krysse membranen og nå agarmediet uten overdreven tørking. - Inkuber plater ved 42 °C i ca. 24 timer under de mikroaerobe forholdene beskrevet tidligere.
- Velg karakteristiske Campylobacter-kolonier med spesifikke egenskaper.
MERK: Campylobacter-kolonier er vanligvis runde med glatte kanter, glinsende og gjennomsiktig gulaktig eller rosa farge6. - Strekkolonier på Brucella agarplater for rensing. Gjenta dette trinnet til plater med en enkelt ensartet kolonimorfologi er oppnådd.
- Forbered prøver for langtidslagring.
- Forbered Bolton Broth som beskrevet tidligere. Legg til en koloni fra platen med ensartet kolonimorfologi.
- Vokse over natten (24 timer) under mikroaerofile forhold beskrevet tidligere. Tilsett 900 μL av nattens kultur til en 2 ml kryovial inneholdende 100 μL DMSO.
- Avkjøles raskt i et tørris-etanolbad (ca. -72 °C) i 10 minutter. Overfør til en -80 °C fryser for langtidsoppbevaring.
4. Identifisering av C. jejuni og C. coli-arter
- Utføre artsnivåidentifikasjon av C. jejuni og C. coli ved hjelp av en multiplex qPCR (mqPCR) analyse tidligere utviklet18,19.
- Utføre rask cellelyse og genomisk DNA-ekstraksjon i et 96-brønns plateformat.
MERK: Det anbefales sterkt å vurdere å bruke kommersielle sett (se materialfortegnelse) for å sikre at prøven er tilstrekkelig fri for kjente PCR-hemmere.- Spred rensede Campylobacter-kolonier i 100 μL ekstraksjonsløsning.
- Lyse prøver ved 99 °C i 10 minutter etterfulgt av kjøling ved 20 °C i 2 minutter i en termosyklist.
- Sentrifuger platen ved 8000 x g i 10 minutter ved romtemperatur. Fjern 2 μL alikoter av supernatanten for mqPCR-analysen.
- Forbered en 20 μL reaksjonsblanding bestående av 10 μL 2x Master Mix, 2,0 μL DNA-prøve, 104 kopier av IAC-mal (Internal Amplification Control) og 200 nM av hver primer og sonde (se materialtabell).
MERK: Primerne og probene til hipO og cdtA er de eksklusive målgenene for henholdsvis C. jejuni og C. coli. IAC består av et 79-bp DNA-segment av humant adenovirus og er inkludert som en positiv kontroll for å sikre konsistent aktivitet av DNA-polymerase over alle prøver.
- Legg alle prøvene i triplikater i en 96-brønns optisk plate dekket med en optisk film og plasser dem i et sanntids PCR-system (se materialfortegnelse).
- Start en varmstartaktivering av DNA-polymerasen ved 95 °C i 10 minutter. Følg med 40 sykluser med denaturering ved 95 °C i 15 s og glødning/forlengelse ved 60 °C i 1 min.
- Utføre rask cellelyse og genomisk DNA-ekstraksjon i et 96-brønns plateformat.
5. Oppsummer cellesuspensjoner
- List opp cellesuspensjoner ved hjelp av en 6 x 6 dråpeplateprosedyre20. Se tilleggsfil 1 for bilder som viser fallplatemetoden på 6 x 6.
- Lufttørre Brucella-agarplater med lokket av i en avtrekkshette med laminær luftstrøm i 45 minutter.
- Tilsett 200 μL bakteriell suspensjon til seks rader (A-F) i den første kolonnen i en 96-brønnsplate.
- Fordel 180 μL Brucella medium over seks rader av de resterende kolonnene (2-12).
- Tilbered ti ganger serielle fortynninger ved bruk av 20 μL overføringer.
- Overfør for eksempel 20 μL prøve fra kolonne en til kolonne to. Gjenta denne prosessen i minst 6 kolonner.
- Reflux blander hver suspensjon ti ganger ved hjelp av pipetten, og endrer spissene mellom hver overføring.
- Bruk en flerkanals pipette til å sette inn 7 μL dråper fra seks rader av en kolonne på overflaten av en Brucella-agarplate.
- Gjenta for å opprette en matrise på 6 x 6, slik at radene replikeres teknisk på tvers av kolonner.
- Lufttørk platene i 5 min, og snu deretter platen. Inkuber plater ved 42 °C i 24 timer.
- Tell antall kolonier i hver representativ fortynning.
Representative Results
Effekt av fuktighet i Brucella agarplater for passiv filtrering av Campylobacter
Campylobacter har et lite genom og mangler flere stressresponsgener som ofte forekommer i andre bakterier, som E. coli O157:H7 og Salmonella. Derfor er det mer følsomt for ulike miljøbelastninger og kan ikke tolerere dehydrering eller omgivende oksygennivå. Omvendt kan et altfor fuktig agarmedium oversvømme filteret. Dette fører ikke bare til diffusjon av prøven til utsiden av filteret, men øker også eksponeringstiden for oksygen21.
For å bestemme passende forhold for filterbasert isolering av Campylobacter, ble Brucella-agarplater tørket med lokkene fjernet i 0 timer, 1 time, 2 timer og 3 timer inne i et biologisk sikkerhetsskap og vurdert for effektiviteten til Campylobacter-celler for å krysse et 0,65 μm porefilter. Fire 20 μL alikoter av C. jejuni S27 kulturer i konsentrasjoner på 1,53 x 104 og 1,53 x 105 CFU / ml ble pipettert på hver filtermembran som hadde blitt plassert på toppen av en Brucella-plate. Etter 15 min penetrasjon ble filtre fjernet, og plater ble inkubert over natten for cellevekst.
Celler fra 5 replikerte plater ble deretter talt og notert i tabell 1. Resultatene indikerte at agarplatene tørket i 2 timer og 3 timer utførte på samme måte med nesten like mange celler gjenvunnet fra passiv filtrering. Det er merkbart at platene tørket under disse forholdene i 0 timer og 1 time ikke tillot celler å krysse membranen fullt ut innen 15 minutters tidsperiode som ble brukt.
Sammenligning av forskjellige porestørrelsesfiltermembraner for isolering av Campylobacter fra kyllingelever
Tatt i betraktning Campylobacter-cellestørrelsene (0,5-5 μm i lengde og 0,2-0,9 μm i bredde) og et bredt spekter av matpartikkelstørrelser, ble celluloseacetatfiltre med 0,45 μm og 0,65 μm porestørrelser testet for effektiviteten av Campylobacter-passasjen når den ble gitt en inkubasjonstid på 15 minutter. Matprøver bestående av 450 g kyllinglever tilsatt 153 CFU C . jejuni og deretter beriket over natten ble brukt til forsøket. Som en ikke-filterkontroll ble direkte plating av anrikningsprøven inkludert parallelt. Resultatene (figur 2) fra 5 replikatplater viste konsekvent at porestørrelsesfilteret på 0,65 μm tillot flere celler å krysse enn de 0,45 μm porestørrelsesfiltrene, noe som resulterte i økninger på ~ 29 ganger flere celler oppnådd. Porestørrelsesfilteret på 0,45 μm beholdt for mange celler på oversiden av filteret, noe som resulterte i en betydelig lavere utvinning av Campylobacter fra mat sammenlignet med porestørrelsesfilteret på 0,65 μm. Som forventet var det en plen av forskjellige bakgrunnsorganismer som vokste på kontrollplatene uten filter.
Påføring av passiv filtrering i Campylobacter-isolasjon fra detaljistkylling
På grunn av den uvanlige motiliteten til Campylobacter-celler , ble den passive filtreringsteknikken valgt for isolering av C. jejuni og C. coli fra detaljhandel kjøttprodukter, som vanligvis er forurenset med mange bakgrunnsorganismer. Mellom årene 2014-2023 ble totalt 79 rå kjøttpakker, inkludert forskjellige deler av kyllingkjøtt, kyllinglever, bifflever og kalvelever, samlet inn fra forskjellige lokale supermarkeder. Fra hver pakke ble det tatt prøver av 450 g for isolering av Campylobacter spp. Ved å kombinere selektiv anrikning av Campylobacter i blodholdig Bolton-buljong og passiv filtrering av cellene gjennom et cellulosefilter på 0,65 μm porestørrelse direkte på en Brucella-agarplate, har 49 Campylobacter-stammer blitt isolert fra 79 kjøttprøver (tabell 2). Figur 3 viser resultatet av å isolere en ny Campylobacter-stamme fra kyllingelever. Metoden har gjentatte ganger vist seg å være sensitiv, spesifikk og kostnadseffektiv.
Identifisering og differensiering av C. jejuni og C. coli isolater
For å verifisere slekten og skille artene av Campylobacter-isolater oppnådd fra rått kjøtt, ble en multiplex qPCR-analyse som forsterker de spesifikke genmålene (hipO og cdtA) for C. jejuni og C. coli, og en intern amplifikasjonskontroll (IAC) anvendt. IAC ble inkludert som en falsk-negativ indikator i samtidig amplifisering av flere gener. Analysen ble implementert i et 96-brønns format med rask cellelyse og DNA-ekstraksjon ved bruk av et kommersielt tilgjengelig reagens (se materialtabell). Tabell 2 oppsummerer resultatet av artsbestemmelse av C. jejuni - og C. coli-stammene . Som ytterligere verifisering bekreftet helgenomsekvenseringsresultatene arten av alle isolatene (data ikke vist).
Figur 1: Et arbeidsflytdiagram for isolering og identifisering av Campylobacter-arter fra detaljsolgt kjøtt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Filterstørrelsens innvirkning på gjenvinning av Campylobacter. Resultatene indikerer at 0,65 μm filteret kan gjenvinne et gjennomsnitt på 900 ± 138 kolonier, mens 0,45 μm filteret gjenvinner 31 ± 7 kolonier. Resultatene ble generert fra N = 20 (5 plater med 4 dråper/plate) og en Student t-test indikerer at gjennomsnittet er statistisk forskjellig (p < 0,0001). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Isolering av Campylobacter ved passiv filtrering av berikede fjørfeprøver. (A) Viser de fire 20 μL dråpene av beriket prøve avsatt på nitrocellulosemembranfilteret. Bildet ble samlet i løpet av 15 minutter med passiv filtrering. (B) Viser platen etter at nitrocellulosefilteret ble fjernet. De fire flekkene indikerer hvor den berikede prøven krysset membranen. (C) Viser platen etter 24 timers inkubasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Effekten av tørketiden til Brucella agarplater på passiv filtrering av C. jejuni. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: C. jejuni og C. coli-stammerisolert fra rått kjøtt. I perioden fra 2008 til 2023 ble 36 C. jejuni og 13 C. coli-stammer isolert fra 79 kjøttpakker fordelt på 24 unike detaljhandelsprodukter. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggsfil 1: Bilder gjennom isolasjons- og opplistingsprosessene. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Betydningen av protokollen
C. jejuni og C. coli var de to store artene av Campylobacter funnet å være utbredt i fjærfe22 og dyrelever23,24. I denne studien ble kjøttprøver av kyllingdeler (ben, vinger og lår), kyllinglever og bifflever tilfeldig samlet inn i forskjellige tidsperioder, og fra forskjellige butikker og produsenter for isolering av Campylobacter spp. Av de totalt 49 isolerte Campylobacter-stammene ble 36 identifisert som C. jejuni og 13 var C. coli, uten andre Campylobacter-arter funnet, noe som stemmer overens med andre rapporter25.
Analysen er basert på den spiralformede cellemorfologien og den karakteristiske korketrekkerlignende motiliteten til Campylobacter spp. En enkel, men effektiv, passiv filtreringsteknikk26,27 som utnyttet dens spiralformede cellemorfologi (lang, slank, 0,2-0,9 x 0,5-5 μm) og sterk korketrekkermotilitet ble brukt til å skille Campylobacter fra en blanding av bakgrunnsorganismer. Den høye motiliteten til Campylobacter tillot cellene å krysse membranfiltrene og bevege seg mot gunstige forhold som finnes i agarmediet, mens andre bakgrunnsmikroorganismer fra kjøttproduktene ikke kunne passere gjennom. Denne metoden er relativt billig, rask og selektiv, noe som gjør den egnet for bruk i en rekke innstillinger, inkludert matforedlingsanlegg, kliniske laboratorier og forskningslaboratorier.
En banebrytende artikkel som ofte siteres, sier at 0,45 μm-filteret fungerte så bra at 0,65 μm ikke ble evaluert28. Resultatene fra denne studien indikerer at porestørrelsesfilteret på 0,65 μm presterte betydelig bedre enn porestørrelsen på 0,45 μm, noe som resulterte i en 29 ganger økning i antall celler gjenvunnet fra anrikningen. Dette er viktig fordi de valgte filtrene ikke viser redusert selektivitet som tidligere rapportert29. Videre, som det er kjent at filtrering vil redusere mengden Campylobacter som gjenvinnes betydelig sammenlignet med direkte plating30, og øker derfor porestørrelsen utvinningen av mikroorganismen, noe som stemmer overens med tidligere rapporterte funn21. Dette er viktig fordi alle cellene som krysset filtrene dannet ensartede Campylobacter-kolonier , noe som indikerer at begge filtrene var tilstrekkelige til å forhindre at andre mikroflora og matpartikler passerte gjennom. I tillegg noterer FSIS-flytskjema7 potensialet for utvidet resultatproduksjon på grunn av re-strekende isolater på Campy-Cefex-plater som inneholder antibiotika. Derimot har protokollen beskrevet i dette manuskriptet, som kombinerer bruk av filtrering og selektiv anrikning med cefoperazon, cykloheksimid, trimetoprim og vankomycin, ikke nødvendiggjort nye streker.
Dagens metode er konsistent med gjeldende FSIS prøvetakings- og verifikasjonsprogrammer17. Siden nivået av Campylobacter-kontaminering kan være lavt (153 CFU/450 g kylling), sentrifugeres skyllingen for å konsentrere prøven med en faktor på fire, noe som øker følsomheten til analysen. Etter å ha konsentrert skyllingen med en faktor på 4x, blir prøvene anriket i 48 timer og screenet med Molecular Detection System (MDS) for å replikere metoden som brukes av FSIS-laboratorier (data ikke vist). Spesielt har den beskrevne metoden ennå ikke klart å identifisere positive stammer innen 24 timer som ble oppdaget av Molecular Detection System ved bruk av 48 timer med anrikning (data ikke vist). Til slutt er en ekstra fordel med denne protokollen at den kan gi informasjon relatert til bakteriearten og identifisere om Campylobacter er C.coli, C. jejuni eller C. lari, mens MDS vedtatt i MLG 41.07 bare kan gi en binær positiv / negativ respons for Campylobacter.
Kritiske skritt
Protokollen for isolering og identifisering av Campylobacter krever presisjon under sentrifugering, filtrering og molekylær analyse. Nøyaktige fortynninger, riktige inkubasjonsforhold og omhyggelig overholdelse av qPCR-analysebetingelser er avgjørende for pålitelig artsidentifikasjon.
Som en mikroaerofil bakterie er Campylobacter svært skjør og følsom for ulike miljøbelastninger og krever unike kresne forhold for vekst 31,32,33. I matprøver som vanligvis gjennomgår lengre perioder med transport og lagring, er mange Campylobacter-celler kanskje i dvale eller sublethal/dødelig skadet tilstand34,35. Derfor er det viktig å gjenopprette de stressede cellene fra matmatrisene og dyrke dem til en høyere konsentrasjon. I det første trinnet i prosedyren brukte vi Bolton Broth supplert med innsjøhestblod og antibiotika for selektiv anrikning av Campylobacter fra mat. Tilleggsblodet fungerte som et oksygenslukkemiddel for å overvinne de negative effektene av frie oksygenradikaler36. Antibiotika ble brukt til å hemme veksten av bakgrunnsmikroflora37.
For å minimere eksponeringstiden for Campylobacter for atmosfærisk oksygen fra omgivelsene, ble en inkubasjonsperiode på 15 minutter valgt for å tillate cellene å krysse filteret. Også fuktigheten til Brucella-agarplaten under filteret spilte en viktig rolle i passasjehastigheten. Spesielt resultatene fra testing av agarplater tørket i 0 timer, 1 time, 2 timer og 3 timer antydet at et høyt fuktighetsinnhold i filteret forhindret celler i å passere gjennom. Like kritisk er den nøyaktige plasseringen av filtre og dråper på platene og filtrene, som begge påvirker suksessen til å isolere celler.
Potensielle fallgruver og begrensninger
Mens du presenterer en strukturert tilnærming for å isolere og identifisere Campylobacter-arter fra rå kyllingprøver, fortjener flere begrensninger i denne protokollen oppmerksomhet. Ekstern forurensning, utilstrekkelig tørkede plater, tilstopping av filtre som hindrer mikrobiell bevegelse, innfangning av mikroorganismer i pelleten, ufullstendig forsegling av atmosfærisk kammer og dråper som sprer seg utover filtergrenser er blant de primære fallgruvene.
Utilstrekkelig separasjon av mikroorganismer fra matoverflatene eller deres innesperring i hoveddelen av prøven kan hindre deres isolasjon ved hjelp av denne metoden. I tillegg gir det en bemerkelsesverdig begrensning å stole på mikrobiell motilitet for traversering gjennom passive filtre; det er mulig at filtermembranene beholdt noen mindre bevegelige Campylobacter-stammer , da det har vist seg at filtre kan redusere fangsteffektiviteten av mikrobielle patogener i mat38. Ytterligere begrensninger omfatter batchkarakteren av sentrifugerings- og filtreringsprosesser, følsomhet for filtertilstopping og ineffektivitet ved dispergering av pelleten som dannes, noe som vil påvirke nøyaktigheten av mikrobielle belastninger. Disse begrensningene understreker samlet behovet for forsiktighet og supplerende metoder for å sikre omfattende analyser, særlig når det gjelder ulike utvalgstyper eller søker evner med høy gjennomstrømning.
Forslag til feilsøking
For å forhindre potensielle problemer, må du først sørge for at alle materialer overholder de nødvendige kvalitetsstandardene og ikke er utløpt. Feilsøk tilstoppede filtre ved potensielt å bruke en ekstra filtrering for å fjerne store forurensninger som kan begrense passasjen av Campylobacter gjennom nitrocellulosemembranen. Hvis forurensning observeres, må du kontrollere at dråpene ikke ble plassert for nær kanten av filteret og tillot væske å nå agar ved å gå rundt filteret i motsetning til gjennom porene. Hvis det ikke er tilstrekkelig vekst etter anrikning, må du kontrollere at tetningene til atmosfæriske beholdere er tette og ikke lekker.
Potensiell forbedring og utvidelse
Utforsking av alternative filtermaterialer kan forbedre mikrobiell traversering og gjøre det mulig å utvide denne protokollen for bruk til å isolere andre motile mikroorganismer fra heterogene blandinger som mat. Det anbefales å identifisere kontroller for å beholde mindre bevegelige Campylobacter-varianter uten å påvirke spesifisiteten negativt. I tillegg, mens den multipleksede qPCR-analysen som ble brukt i denne studien, ble vist å ha evnen til å oppdage C.lari18 , kan andre Campylobacter-arter av interesse inkluderes i denne analysen.
Oppsummert, gjennom evaluering av forskjellige parametere og innstillinger, ble de passende forholdene for filterbasert isolasjon og artsnivåidentifikasjon av C. jejuni og C. coli fra mat etablert. Metoden har vist seg å være sensitiv, spesifikk, robust og kostnadseffektiv. Ved å bruke den på ekte matprøver, var protokollen i stand til å isolere 36 C. jejuni og 13 C. coli-stammer fra 79 kjøttpakker.
Protokollen er i tråd med FSIS-direktiv 10,250.117, som skisserer prosedyren for prøvetaking av rå kyllingdeler, og MLG 41.076 for isolering og identifisering av Campylobacter. Dataene antyder at konsentrering av prøven med 4x og berikelse i 24 timer, kombinert med filtrering og plating, gir isolerte, bekreftede kolonier innen 48 timer i motsetning til 96 timer. Protokollen er kompatibel med DNA-baserte metoder som genomsekvensering for å gi en omfattende karakterisering av Campylobacter-stammer , inkludert deres antimikrobielle resistensprofiler, virulensforutsigelser og fylogenetiske forhold. Protokollen representerer et lovende alternativ for effektiv utvinning og isolering av Campylobacter spp. fra rå fjærfe, noe som kan lette epidemiologiske studier og folkehelseintervensjoner.
Disclosures
Alle forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av US Department of Agriculture, Agricultural Research Service (USDA-ARS), National Program 108, Current Research Information System nummer 8072-42000-093 og 8072-42000-094-000-D. Omtale av handelsnavn eller kommersielle produkter i denne artikkelen er utelukkende med det formål å gi spesifikk informasjon og innebærer ikke anbefaling eller godkjenning av US Department of Agriculture. USDA er en likestillingsleverandør og arbeidsgiver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar - Solidifying Agent (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 281230 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | JL602-G/L | Equipment |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S | Equipment |
| Antibiotic supplements cefoperazone, cycloheximide, trimethoprim, vancomycin | Oxoid Ltd. | SR0183E | |
| Atmosphere Control Gas Pak (Campy, 85% N2, 10% CO2, and 5% O2) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260680 | |
| Atmosphere Control Vessel, GasPak EZ CampyPak container system | Becton, Dickinson and Company (BD) | 260678 | |
| Autoclave - Amsco Lab250, Laboratory Steam Sterilizer | Steris plc | LV-250 | Equipment |
| Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+ | Labconco Corporation | 302411101 | Equipment |
| Bolton broth | Oxoid Ltd. | CM0983 | |
| Brucella broth (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 211088 | |
| Buffered Peptone Water | Bio-Rad Laboratories Inc. | 3564684 | |
| Centrifuge Microcentrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 | Equipment |
| Centrifuge, Avanti J-25 | Beckman Coulter, Inc. | Equipment | |
| Chicken thighs, wings, drumsticks, livers | Local retailers | ||
| DNA Extraction - PreMan Ultra Sample Preparation Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4318930 | |
| FAM probe for hipO (Sequence 5'-TTGCAACCTCACTAGCAAAATCC ACAGCT-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Filter - 0.45 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | DAWP04700 | |
| Filter - 0.65 µm sterile cellulose acetate filter | Merck-Millipore LTD | HAWG04700 | |
| forward primer for cdtA (Sequence 5'-TGTCAAACAAAAAACACCAAGCT T-3' ') |
Integrated DNA Technologies | ||
| forward primer for hipO (Sequence 5'-TCCAAAATCCTCACTTGCCATT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| forward primer for IAC (Sequence 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| HEX probe for cdtA (Sequence 5'-AAAATTTCCCGCCATACCACTTG TCCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Incubator - Inova 4230 refrigerated incubator shaker | New Brunswick Scientific | 4230 | Equipment |
| Inoculating Loop - Combi Loop 10µL and 1µL | Fisher Scientific International, Inc | 22-363-602 | |
| Internal Amplification Control (IAC) DNA fragment (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTAT GTGGTGGCATTGTCTTCTCCC GTTGTAACTATCCACTGAGATG TGTTAGGCGCGCC-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Laked horse blood | Remel Inc. | R54072 | |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Mettler Toledo | 17014382 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | Mettler Toledo | 17014384 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | Mettler Toledo | 17014388 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Mettler Toledo | 17014391 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Mettler Toledo | 17014392 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Mettler Toledo | 17013805 | Equipment |
| Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+ | Mettler Toledo | 17013803 | Equipment |
| Media Storage Bottle -PYREX 1 L Square Glass Bottle, with GL45 Screw Cap | Corning Inc. | 1396-1L | Equipment |
| Media Storage Bottle -PYREX 2 L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw Cap | Corning Inc. | 1397-2L | Equipment |
| Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34 cm2, sterile, 108/cs | MilliporeSigma | Z707902 | |
| Mixer - Vortex Genie 2 | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | Equipment |
| Motorized pipette controller, PIPETBOY2 | INTEGRA Biosciences Corp. | Equipment | |
| PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4369542 | |
| Petri Dish Rotator - bioWORLD Inoculation Turntable | Fisher Scientific International, Inc | 3489E20 | Equipment |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm) | Fisher Scientific International, Inc | FB0875713 | |
| Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8 | Mettler Toledo | 30389273 | |
| Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10 | Mettler Toledo | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10 | Mettler Toledo | 30389276 | |
| Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettors | Thermo Fisher Scientific Inc. | 8093-11 | |
| Realtime PCR - 7500 Real-Time PCR system | (Applied Biosystems, Foster City, CA) | Equipment | |
| reverse primer for cdtA (Sequence 5'-CCTTTGACGGCATTATCTCCTT-3') | Integrated DNA Technologies | ||
| reverse primer for hipO (Sequence 5'-TGCACCAGTGACTATGAATAACG A-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| reverse primer for IAC (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA -3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170356N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170372N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170357N | |
| Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170376N | |
| Spreader - Fisherbrand L-Shaped Cell Spreaders | Fisher Scientific International, Inc | 14-665-230 | |
| Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter Bags | Thermo Fisher Scientific Inc. | 01-812 | |
| TAMRA probe for IAC (Sequence 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCC ACCA-3') |
Integrated DNA Technologies | ||
| Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700) | Applied Biosystems | Equipment | |
| Water Filtration - Elga Veolia Purelab Flex | Elga LabWater | PF2XXXXM1-US | Equipment |
References
- Rushton, S. P., et al. Climate, human or environment: Individual-based modelling of Campylobacter seasonality and strategies to reduce disease burden. J Transl Med. 17 (1), 34 (2019).
- Facciolà, A., et al. Campylobacter: From microbiology to prevention. J Prev Med Hyg. 58 (2), E79-E92 (2017).
- Perez-Arnedo, I., Gonzalez-Fandos, E. Prevalence of Campylobacter spp. In poultry in three spanish farms, a slaughterhouse and a further processing plant. Foods. 8 (3), 111 (2019).
- Nachamkin, I., Allos, B. M., Ho, T. Campylobacter species and guillain-barré syndrome. Clin Microbiol Rev. 11 (3), 555-567 (1998).
- Department of Food Administration.
- USDA Office of Public Health Science. Isolating and identifying Campylobacter jejuni/coli/lari from poultry rinsate, sponge and raw product samples. Microbiology Laboratory Guidebook. , (2022).
- Singh, H., Rathore, R. S., Singh, S., Cheema, P. S. Comparative analysis of cultural isolation and PCR based assay for detection of Campylobacter jejuni in food and faecal samples. Braz J Microbiol. 42 (1), 181-186 (2011).
- Kralik, P., Ricchi, M. A basic guide to real time pcr in microbial diagnostics: Definitions, parameters, and everything. Front Microbiol. 8, (2017).
- Linton, D., Lawson, A. J., Owen, R. J., Stanley, J. PCR detection, identification to species level, and fingerprinting of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli direct from diarrheic samples. J Clin Microbiol. 35 (10), 2568-2572 (1997).
- Kabiraz, M. P., Majumdar, P. R., Mahmud, M. M. C., Bhowmik, S., Ali, A. Conventional and advanced detection techniques of foodborne pathogens: A comprehensive review. Heliyon. 9 (4), e15482 (2023).
- Kaakoush, N. O., Castaño-Rodríguez, N., Mitchell, H. M., Man, S. M.
- Gilbreath, J. J., Cody, W. L., Merrell, D. S., Hendrixson, D. R. Change is good: Variations in common biological mechanisms in the epsilonproteobacterial genera Campylobacter and Helicobacter. Microbiol Mol Biol Rev. 75 (1), 84-132 (2011).
- Lertsethtakarn, P., Ottemann, K. M., Hendrixson, D. R. Motility and chemotaxis in campylobacter and helicobacter. Annu Rev Microbiol. 65, 389-410 (2011).
- Jokinen, C. C., et al. An enhanced technique combining pre-enrichment and passive filtration increases the isolation efficiency of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from water and animal fecal samples. J Microbiol Methods. 91 (3), 506-513 (2012).
- Engberg, J., On, S. L., Harrington, C. S., Gerner-Smidt, P. Prevalence of Campylobacter, Arcobacter, Helicobacter, and Sutterella spp. In human fecal samples as estimated by a reevaluation of isolation methods for Campylobacters. J Clin Microbiol. 38 (1), 286-291 (2000).
- Lastovica, A. J., Le Roux, E. Efficient isolation of campylobacteria from stools. J Clin Microbiol. 38 (7), 2798-2799 (2000).
- USDA. Salmonella and Campylobacter verification program for raw poultry products. FSIS Directive 10250.1. 10000 Series: Laboratory Services. USDA. , (2021).
- He, Y., et al. Simultaneous detection and differentiation of Campylobacter jejuni, c. Coli, and c. Lari in chickens using a multiplex real-time PCR assay. Food Anal Methods. 3, 321-329 (2010).
- Suo, B., He, Y., Tu, S. -I., Shi, X. A multiplex real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of salmonella spp., escherichia coli o157, and listeria monocytogenes in meat products. Foodborne Pathog Dis. 7 (6), 619-628 (2010).
- Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. A 6 x 6 drop plate method for simultaneous colony counting and MPN enumeration of Campylobacter jejuni, listeria monocytogenes, and escherichia coli. J Microbiol Methods. 55 (2), 475-479 (2003).
- Speegle, L., Miller, M. E., Backert, S., Oyarzabal, O. A. Use of cellulose filters to isolate Campylobacter spp. From naturally contaminated retail broiler meat. J Food Prot. 72 (12), 2592-2596 (2009).
- Guirin, G. F., Brusa, V., Adriani, C. D., Leotta, G. A. Prevalence of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from broilers at conventional and kosher abattoirs and retail stores. Rev Argent Microbiol. 52 (3), 217-220 (2020).
- Noormohamed, A., Fakhr, M. K. A higher prevalence rate of Campylobacter in retail beef livers compared to other beef and pork meat cuts. Int J Environ Res Public Health. 10 (5), 2058-2068 (2013).
- Walker, L. J., et al. Prevalence of Campylobacter coli and Campylobacter jejuni in retail chicken, beef, lamb, and pork products in three Australian states. J Food Prot. 82 (12), 2126-2134 (2019).
- Zhao, C., et al. Prevalence of Campylobacter spp., Escherichia coli, and Salmonella serovars in retail chicken, turkey, pork, and beef from the greater Washington, D.C., area. Appl Environ Microbiol. 67 (12), 5431-5436 (2001).
- Honsheng, H., Manuel Mariano, G. Campylobacter. Guillermo, T. -I., Saeed, E. -A. , IntechOpen. Rijeka. (2022).
- He, Y., et al. Rapid identification and classification of Campylobacter spp. using laser optical scattering technology. Food Microbiol. 47, 28-35 (2015).
- Steele, T. W., Mcdermott, S. N. The use of membrane filters applied directly to the surface of agar plates for the isolation of Campylobacter jejuni from feces. Pathology. 16 (3), 263-265 (1984).
- Bourke, B., Chan, V. L., Sherman, P.
- Berrang, M. E., Meinersmann, R. J., Cox, N. A. Passage of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli subtypes through 0.45- and 0.65-micrometer-pore-size nitrocellulose filters. J Food Prot. 80 (12), 2029-2032 (2017).
- Hill, G. N., et al. Optimizing enrichment of Campylobacter on poultry. J App Poult Res. 26 (3), 307-315 (2017).
- Kim, J. C., Oh, E., Kim, J., Jeon, B. Regulation of oxidative stress resistance in Campylobacter jejuni, a microaerophilic foodborne pathogen. Front Microbiol. 6, 751 (2015).
- Nennig, M., et al. Metaphenotypes associated with recurrent genomic lineages of Campylobacter jejuni responsible for human infections in luxembourg. Front Microbiol. 13, (2022).
- Moore, J. E. Bacterial dormancy in Campylobacter: Abstract theory or cause for concern. Int J Food Sci Technol. 36 (6), 593-600 (2001).
- Saha, S., Saha, S., Sanyal, S. Recovery of injured Campylobacter jejuni cells after animal passage. Appl Environ Microbiol. 57 (11), 3388-3389 (1991).
- Baylis, C. L., Macphee, S., Martin, K. W., Humphrey, T. J., Betts, R. P. Comparison of three enrichment media for the isolation of Campylobacter spp. From foods. J Appl Microbiol. 89 (5), 884-891 (2000).
- Line, J. E. Development of a selective differential agar for isolation and enumeration of Campylobacter spp. J Food Prot. 64 (11), 1711-1715 (2001).
- Armstrong, C. M., et al. Impacts of clarification techniques on sample constituents and pathogen retention. Foods. 8 (12), 636 (2019).
