Summary
La matrice de rate décellularisée (DSM) a des applications prometteuses dans le domaine de l’ingénierie tissulaire hépatique. Ce protocole décrit la procédure de préparation du DSM chez le rat, qui comprend la récolte de rates de rats, leur décellularisation par perfusion et l’évaluation du DSM résultant pour confirmer ses caractéristiques.
Abstract
La transplantation hépatique est le traitement principal de la maladie hépatique en phase terminale. Cependant, la pénurie et la qualité insuffisante des organes des donneurs nécessitent le développement de thérapies alternatives. Les foies bioartificiels (BAL) utilisant une matrice hépatique décellularisée (DLM) sont apparus comme des solutions prometteuses. Cependant, l’approvisionnement en DLM appropriés reste un défi. L’utilisation d’une matrice de rate décellularisée (DSM) a été explorée comme base pour les BAL, offrant une alternative facilement disponible. Dans cette étude, des rates de rat ont été prélevées et décellularisées à l’aide d’une combinaison de cycles de gel-dégel et de perfusion avec des réactifs de décellularisation. Le protocole a préservé les microstructures et les composants de la matrice extracellulaire (ECM) dans le DSM. Le processus complet de décellularisation a pris environ 11 h, ce qui a permis d’obtenir un ECM intact dans le DSM. L’analyse histologique a confirmé l’élimination des composants cellulaires tout en conservant la structure et la composition de l’ECM. Le protocole présenté fournit une méthode complète pour obtenir le DSM, offrant des applications potentielles en ingénierie tissulaire hépatique et en thérapie cellulaire. Ces résultats contribuent au développement d’approches alternatives pour le traitement de la maladie hépatique en phase terminale.
Introduction
La transplantation hépatique reste le seul traitement définitif de la maladie hépatique en phase terminale 1,2,3. Cependant, la pénurie critique et la baisse de la qualité des organes de donneurs ont accru le besoin de traitements alternatifs4. Dans le domaine de la médecine régénérative, les foies bioartificiels (BAL) utilisant une matrice hépatique décellularisée (DLM) sont apparus comme des solutions prometteuses 5,6,7. Le DLM préserve la structure hépatique d’origine, y compris son réseau microvasculaire complexe et les composants de l’ECM, offrant un échafaudage pour la création de BALs transplantables qui pourraient potentiellement soulager les maladies du foie.
Malgré les promesses, l’adoption de cette technologie se heurte à des défis, notamment en ce qui concerne l’approvisionnement en DLM appropriés. Les DLM d’origine humaine sont rares, tandis que ceux d’origine animale comportent des risques de transmission de maladies et de rejet immunitaire. Dans le cadre d’une approche innovante, notre recherche a exploré l’utilisation d’une matrice de rate décellularisée (DSM) comme base pour les BALs 8,9,10,11. La rate est plus facilement disponible dans diverses situations médicales, telles que l’hypertension portale, la rupture traumatique, le purpura thrombocytopénique idiopathique et le don après une mort cardiaque. Par conséquent, la rate est plus largement disponible que le foie à des fins de recherche. Les patients qui ont subi une splénectomie ne souffrent pas d’affections graves, ce qui confirme encore la dispensabilité de la rate. Le microenvironnement de la rate, en particulier la matrice extracellulaire et les sinusoïdes, est similaire à celui du foie. Cela fait de la rate un organe approprié pour l’adhésion et la prolifération cellulaires dans la recherche sur la transplantation d’hépatocytes. Sur la base de ces résultats, nos recherches antérieures ont démontré que les DSM partagent des microstructures et des composants comparables avec les DLM et peuvent soutenir la survie et la fonction des hépatocytes, y compris la production d’albumine et d’urée. De plus, il a été démontré que les DSM améliorent la différenciation hépatique des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse, conduisant à une fonctionnalité améliorée et cohérente.
En utilisant des DSM traités à l’héparine, nous avons mis au point des BALs fonctionnels capables de démontrer une anticoagulation à court terme efficace et une compensation partielle de la fonction hépatique11. Par conséquent, ce DSM tridimensionnel est très prometteur pour l’avancement de l’ingénierie tissulaire hépatique et de la thérapie cellulaire. Dans ce travail, nous présentons les méthodes détaillées de récolte de la rate de rat et de préparation de la MDS qui préservent les microstructures et les composants de la MEC.
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Protocol
Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université Jiaotong de Xi’an et réalisée conformément aux directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.
1. Prélèvement de la rate
- Utilisez des rats Sprague Dawley mâles pesant de 250 à 280 g. Hébergez les rats dans des pièces à température et humidité contrôlées, et fournissez-leur de la nourriture et de l’eau à volonté, sauf pour jeûner avant la chirurgie.
- Injecter par voie sous-cutanée de la buprénorphine (0,05 mL/kg) comme analgésique 1 h avant l’opération. Anesthésier le rat par inhalation d’isoflurane. Utilisez un débit de 1,5 L/min d’isoflurane à 5 % pour l’anesthésie d’induction dans une boîte en plexiglas et maintenez l’anesthésie avec un débit de 0,6 à 0,8 L/min d’isoflurane à 2 % à travers un masque. Confirmez la profondeur de l’anesthésie en pinçant les orteils.
- Utilisez un rasoir électrique pour raser la peau sur tout l’abdomen. Fixez le rat en position couchée sur la table d’opération. Injecter 2 ml de solution saline héparinée (1 000 U d’héparine) par la veine dorsale du pénis pour obtenir une anticoagulation systémique. Désinfectez la peau rasée avec une solution de povidone iodée et couvrez-la d’un drap stérile.
- Faites une incision cruciforme à l’aide de ciseaux chirurgicaux dans l’abdomen, exposez la cavité abdominale en l’étirant avec la pince hémostatique et retournez le foie vers le diaphragme. Extériorisez le tractus gastro-intestinal sur le côté droit de l’abdomen et couvrez-le de gaze humide.
- Séparez et coupez soigneusement le ligament splénogastrique pour exposer le hile splénique.
REMARQUE : La rate, qui se présente sous la forme d’une structure allongée rougeâtre, d’environ 3,0 cm x 0,6 cm x 0,6 cm, peut être identifiée dans l’abdomen gauche. - Séparez et exposez progressivement l’artère hépatique, l’artère gastroduodénale et l’artère splénique communes en disséquant le long du hile splénique. Lister et couper l’artère gastroduodénale et l’artère hépatique commune tout en dissociant progressivement les tissus environnants.
- Retournez la rate vers le côté droit pour exposer l’aorte abdominale. Effectuez une dissection contondante en douceur et exposez l’aorte abdominale et le tronc cœliaque à l’aide de cotons-tiges. Placez une suture en soie 3-0, d’environ 3 cm de longueur, au-dessus et en dessous des branches du tronc cœliaque, et placez une suture en soie 6-0, d’environ 10 cm de longueur, sur la branche du tronc cœliaque.
- Ligature de l’aorte abdominale au-dessous et au-dessus des branches du tronc cœliaque. Faites une petite incision au niveau de la branche artérielle. Soulevez doucement la suture en soie 6-0, insérez un cathéter veineux de 24 G dans l’artère splénique le long du tronc cœliaque, puis ligaturez-la et fixez-la.
- À l’aide d’un pousse-seringue à un débit de 4 mL/min, perfuser une solution saline normale héparinisée (25 U/mL) à un volume de 50 mL. Dans le même temps, sectionnez la veine porte en tant que canal d’écoulement pour permettre au liquide infusé de s’écouler hors de la rate. L’animal est euthanasié par exsanguination.
- Disséquez soigneusement le tissu environnant de la rate, en évitant d’endommager le pancréas, tout en préservant les principaux vaisseaux accessoires.
- Vérifiez qu’il n’y a pas de fuite autour de la rate, puis retirez la rate et le pancréas et rincez-les dans une solution saline normale.
REMARQUE : La rate et le pancréas des rats sont étroitement liés, le pancréas s’enroulant autour de l’artère splénique. Si la rate est retirée séparément, il peut être difficile de ligaturer de nombreux petits vaisseaux sanguins. Dans cette procédure, la rate est retirée en même temps que le pancréas. Après décellularisation, la rate et le pancréas deviennent transparents et la microvascularisation est visible, ce qui facilite la préservation de la rate avec des vaisseaux sanguins intacts. - Transférez la rate dans un tube à centrifuger de 50 ml rempli de solution saline normale et conservez-la dans un congélateur à -80 °C.
REMARQUE : La rate et le cathéter veineux insérés dans l’artère splénique seront cryoconservés ensemble pour une connexion pratique pendant les expériences de perfusion.
2. Décellularisation de la rate
- Répétez le cycle de congélation-décongélation 3 fois dans un récipient stérile pour lyser les cellules de la rate.
REMARQUE : Le cycle de gel-dégel est une méthode physique utilisée pour la décellularisation des échafaudages. Le tissu de la rate est placé dans un congélateur à -80 °C pendant la nuit pour la congélation, puis retiré de l’environnement à basse température et placé dans un bain-marie à température ambiante ou à 37 °C pour la décongélation. Ce processus de congélation et de décongélation est répété 3 à 6 fois, ce qui perturbe les membranes cellulaires et conduit à la lyse cellulaire. - Mettre en place un système de perfusion à l’intérieur d’une paillasse propre composé d’une pompe péristaltique, d’un réservoir de 2 L, d’un tube en silicone d’un diamètre intérieur de 2,4 mm et d’un piège à bulles (figure 1).
- Remplissez le système de perfusion avec de l’eau déminéralisée (ddH2O) et maintenez-le en marche pendant 10 min.
- Transférez soigneusement la rate prélevée dans le récipient rempli de ddH2O.
- Connectez le tube en silicone au cathéter veineux qui a été inséré dans l’artère splénique.
- Commencer la perfusion avec lejdH2O à raison de 2 mL/min pendant 30 min.
- Poursuivre la perfusion avec lejdH2O à raison de 4 mL/min pendant 30 min.
- Perfuser avec une solution SDS à 0,1 % (p/v) pendant 4 h.
- Perfuser avec une solution Triton X-100 à 1 % (v/v) pendant 2 h.
- Perfuser avec du PBS à raison de 4 mL/min pendant 4 h pour laver le DSM.
REMARQUE : Utilisation de la pompe péristaltique pour la perfusion unidirectionnelle de tous les liquides. - Une fois la perfusion terminée, ligaturez et transectez les branches vasculaires entre le pancréas et la rate, puis retirez le pancréas. Conservez le DSM dans un tube à centrifuger propre et scellé de 50 mL imbibé de PBS contenant 10 % de pénicilline-streptomycine à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à être utilisé pour de futures expériences.
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Representative Results
Ce protocole utilisait une combinaison de cycles répétés de congélation-décongélation et de perfusion avec des réactifs de décellularisation pour la décellularisation de la rate du rat. La décellularisation complète de la rate a été réalisée en environ 11 h (Figure 2A). Tout au long du processus de décellularisation, la couleur de la rate est progressivement passée d’un rouge foncé à un rouge clair tacheté, puis à un blanc translucide (Figure 2B). La morphologie générale est restée relativement intacte, avec des structures vasculaires visibles (Figure 2B).
La coloration à l’hématoxyline-éosine a confirmé l’élimination des composants cellulaires, révélant une MEC intacte dans le DSM. Ceci est en contraste frappant avec la rate native, comme le montre la figure 3A, où les noyaux cellulaires et les éléments cytoplasmiques sont visibles. L’absence de cellules a été confirmée par la coloration au 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et la mesure de l’ADN résiduel (DSM : 10,1 ± 4 ng/mg de poids sec, rate native : 6 200 ± 300 ng/mg de poids sec). Des images au microscope électronique à balayage ont révélé la caractérisation ultrastructurale du DSM, qui a montré une structure en nid d’abeille après l’élimination complète des lymphocytes de la rate (Figure 3C). Cela indiquait que la décellularisation de la rate préservait l’ultrastructure et l’architecture normales de la rate. Pour une évaluation plus complète des protéines ECM cruciales présentes dans le DSM, le trichrome de Masson (Figure 3B) et la coloration par immunofluorescence ont été utilisés. Plus précisément, le collagène I (figure 3D) et la fibronectine (figure 3E) ont été ciblés pour l’analyse. Les résultats ont indiqué que les composants de la membrane structurale et de la membrane basale de l’ECM étaient conservés de la même manière que la rate native.
Figure 1 : Le dispositif expérimental. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Le flux de travail de la décellularisation et des changements morphologiques macroscopiques. (A) Le flux de travail de préparation de la matrice de rate décellularisée. La décellularisation complète de la rate a été réalisée en environ 11 h. (B) Modifications morphologiques macroscopiques de la rate lors de la préparation du DSM. Au cours de ce processus, la couleur de la rate est progressivement passée d’un rouge profond à un rouge clair marbré et, finalement, à un aspect blanc translucide. (B) 1. Après des cycles répétés de gel-dégel et avant la décellularisation. 2. Après rinçage à l’eau déminéralisée pendant 1 h. 3. Après perfusion avec SDS pendant 4 h. 4. Après perfusion avec Triton pendant 2 h. Abréviations : DSM = matrice de rate décellularisée ; SDS = dodécylsulfate de sodium ; PBS = solution saline tamponnée au phosphate ; PS = pénicilline-streptomycine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Observations morphologiques de la matrice de la rate décellularisée. (A) Coloration H&E ; (B) coloration trichrome Masson ; c) MEB ; (D, E) Coloration par immunofluorescence du collagène I et de la fibronectine ; (F) Coloration DAPI. Barres d’échelle = 50 μm (A, B, D-F), 5 μm (C). Abréviations : DSM = matrice de rate décellularisée ; H&E = hématoxyline-éosine ; MEB = microscopie électronique à balayage ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les BAL représentent une approche efficace pour le traitement de la maladie hépatique en phase terminale, en particulier dans les cas où la transplantation hépatique est entravée par la pénurie actuelle d’organes de donneurs6. Une option prometteuse pour la création de BALs est l’utilisation de DLM, qui préserve la MEC naturelle et la structure vasculaire du foie natif. Cependant, la rareté de la DLM humaine et les risques potentiels d’infection et d’immunogénicité associés à la DLM animale posent des limites importantes. Pour relever ce défi, nous proposons une nouvelle stratégie qui consiste à utiliser une matrice de rate décellularisée (DSM) comme échafaudage alternatif pour les BALs 8,9,10,11. La rate est plus facilement accessible dans divers scénarios cliniques et présente des caractéristiques similaires à celles du foie. Dans ce travail, nous présentons des méthodes détaillées de prélèvement de rates et de préparation de la MDS qui préservent les microstructures et les composants de la MEC.
Une méthode de décellularisation idéale permettrait d’éliminer les composants cellulaires tout en conservant la structure, la composition et les propriétés mécaniques d’origine de l’ECM 12,13,14. Les méthodes de décellularisation englobent les traitements physiques, chimiques et enzymatiques, chacun avec ses avantages et ses inconvénientsdistincts 15. Bien que ces méthodes puissent éliminer partiellement les composants cellulaires, elles peuvent également compromettre la composition, la structure et la fonctionnalité de l’ECM restant. La qualité de la décellularisation peut être influencée par des variations de densité cellulaire, d’épaisseur de matrice et de morphologie tissulaire à travers différentes sources de tissus.
À ce jour, il n’existe pas d’étalon-or pour le processus de décellularisation. En règle générale, le simple fait d’utiliser l’une de ces méthodes est insuffisant pour minimiser les effets indésirables sur l’ECM et maximiser l’élimination du contenu cellulaire. Par conséquent, l’approche la plus efficace repose sur les caractéristiques des tissus, ce qui nécessite une combinaison de ces méthodes. Dans cette étude, nous avons utilisé un protocole qui combinait des méthodes physiques (cycles de congélation-décongélation et perfusion) avec des méthodes chimiques (SDS et TritonX-100) pour décellulariser les rates de rats.
Les cycles de congélation-décongélation favorisent la lyse cellulaire et le détachement rapide des cellules de l’ECM16. Simultanément, la perfusion à travers le système vasculaire natif améliore considérablement l’efficacité de la décellularisation et préserve le réseau vasculaire d’origine17. Le dodécylsulfate de sodium (SDS), fonctionnant comme un détergent ionique, dissout efficacement les membranes cellulaires et nucléaires, conduisant à une élimination plus complète des composants cytoplasmiques et nucléaires. Cependant, ce processus inflige également des dommages à l’ultrastructure de l’ECM en raison de l’épuisement des glycosaminoglycanes (GAG) et du collagène.
Des concentrations élevées de SDS étaient corrélées à une diminution de la teneur en ADN résiduel et à une réduction de la résistance mécanique à l’intérieur de l’échafaudage ECM. À l’inverse, des concentrations plus faibles de SDS préservaient une plus grande quantité de collagène et induisaient moins de dénaturation des protéines ECM. En revanche, Triton X-100, servant de détergent non ionique, perturbe efficacement les interactions lipides-lipides, lipides-protéines et ADN-protéines, offrant une approche plus douce de la dissolution de la membrane cellulaire. Néanmoins, elle s’avère insuffisante pour l’élimination complète des noyaux cellulaires et de l’ADN. Par conséquent, il doit être combiné avec de faibles concentrations de SDS et des traitements physiques pour assurer l’élimination complète des composants cellulaires tout en préservant la structure, la composition et les performances d’origine de l’ECM. Il est important de noter que les détergents résiduels peuvent avoir une certaine cytotoxicité, de sorte qu’un rinçage post-traitement avec du PBS stérile ou de l’eau distillée est nécessaire avant le stockage.
L’une des limites de ce protocole est l’absence de quantification pour les FDS résiduelles et le Triton X-100. Cette décision est éclairée à la fois par l’expérience de notre équipe et par des rapports corroborants, qui suggèrent qu’un lavage PBS de 4 heures est suffisant pour éliminer efficacement ces substances. De plus, nos expériences antérieures de culture cellulaire utilisant ce protocole n’ont montré aucun signe de cytotoxicité. Afin de minimiser les dépenses du protocole, le choix délibéré a été fait de renoncer à la quantification des détergents résiduels.
En conclusion, ce protocole présente une méthode réalisable pour la préparation des MNS, démontrant l’efficacité, la stabilité et le caractère invasif minimal. Les DSM préparés à l’aide de ce protocole maintiennent l’architecture inhérente de la rate, sa composition et son réseau vasculaire naturel. De plus, il offre un échafaudage pour l’implantation cellulaire et la culture dynamique tridimensionnelle, établissant ainsi une base pour faire progresser les recherches dans le foie issu de l’ingénierie tissulaire.
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Disclosures
Les auteurs n’ont déclaré aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82000624), le programme de recherche fondamentale en sciences naturelles du Shaanxi (2022JQ-899 et 2021JM-268), le programme de soutien à la capacité d’innovation de la province du Shaanxi (2023KJXX-030), le projet conjoint du plan de R&D de l’université de la province du Shaanxi (2021GXLH-Z-047), la fondation institutionnelle du premier hôpital affilié de l’Université Jiaotong de Xi’an (2021HL-42 et 2021HL-21).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Machine | Harvard Apparatus | tabletop | animal anesthesia |
| bubble trap | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | pore diameter: 5 μm | prevent air bubbles |
| Buprenorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | an analgesic | |
| Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | surgical tool |
| Heparinized Saline | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | prevent the formation of thrombosis | |
| Isoflurane | RWD life Science Co. | anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia | |
| Penicillin-Streptomycin | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | antibiotics in vitro to prevent microbial contamination |
| Peristaltic Pump | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Phosphate-Buffered Saline | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | phosphoric acid buffer salt solution |
| Silicone Tube | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4×0.8mm | |
| Silk Suture | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 and 3-0 | ligate blood vessels |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | ionic detergent, dissolves both cell and nuclear membranes |
| Syringe Pump | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | intravenous infusion |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | non-ionic detergent, disrupts lipid-lipid, lipid-protein, and DNA-protein interactions |
| Venous Catheter | B. Braun Company | 24G | inserting the spleen artery |
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