Summary
Her præsenterer vi en protokol, der demonstrerer brugen af hydrogel som en tredimensionel (3D) cellekulturramme for fedtafledt stamcellekultur (ADSC) og introducerer fotobiomodulation (PBM) for at forbedre spredningen af ADSC'er inden for 3D-kulturindstillingen.
Abstract
Fedtafledte stamceller (ADSC'er), der besidder multipotente mesenkymale egenskaber, der ligner stamceller, anvendes ofte i regenerativ medicin på grund af deres kapacitet til en bred vifte af celledifferentiering og deres evne til at forbedre migration, proliferation og afbøde inflammation. Imidlertid står ADSC'er ofte over for udfordringer med overlevelse og indkapsling i sår, primært på grund af ugunstige inflammatoriske tilstande. For at løse dette problem er hydrogeler blevet udviklet til at opretholde ADSC-levedygtighed i sår og fremskynde sårhelingsprocessen. Her havde vi til formål at vurdere den synergistiske virkning af fotobiomodulation (PBM) på ADSC-proliferation og cytotoksicitet inden for en 3D-cellekulturramme. Udødeliggjorte ADSC'er blev podet i 10 μL hydrogeler med en densitet på 2,5 x 103 celler og udsat for bestråling ved hjælp af 525 nm og 825 nm dioder ved fluenser på 5 J / cm2 og 10 J / cm2. Morfologiske ændringer, cytotoksicitet og proliferation blev evalueret ved 24 timer og 10 dage efter PBM-eksponering. ADSC'erne udviste en afrundet morfologi og blev spredt gennem gelen som individuelle celler eller sfæroidaggregater. Det er vigtigt, at både PBM- og 3D-kulturrammen ikke viste cytotoksiske virkninger på cellerne, mens PBM signifikant forbedrede spredningshastighederne for ADSC'er. Afslutningsvis demonstrerer denne undersøgelse brugen af hydrogel som et passende 3D-miljø til ADSC-kultur og introducerer PBM som en betydelig forstærkningsstrategi, især adressering af de langsomme spredningshastigheder forbundet med 3D-cellekultur.
Introduction
ADSC'er er mesenkymale multipotente stamceller med kapacitet til selvfornyelse og differentiering i flere cellelinjer. Disse celler kan høstes fra den stromale vaskulære fraktion (SVF) af fedtvæv under en lipoaspirationsprocedure1. ADSC'er er opstået som en ideel stamcelletype til brug i regenerativ medicin, fordi disse celler er rigelige, minimalt invasive at høste, let tilgængelige og velkarakteriserede2. Stamcelleterapi tilbyder en mulig vej til sårheling ved at stimulere cellemigration, proliferation, neovaskularisering og reducere inflammation i sår 3,4. Omkring 80% af ADSC'ernes regenerative kapacitet kan tilskrives parakrin signalering via deres sekretom5. Tidligere blev det foreslået, at en direkte lokal injektion af stamceller eller vækstfaktorer i beskadiget væv kunne ulovliggøre tilstrækkelige in vivo-reparationsmekanismer 6,7,8. Denne tilgang stod imidlertid over for flere udfordringer, såsom dårlig overlevelse og reduceret stamcelleindkapsling i beskadiget væv som følge af det inflammatoriske miljø 9. Desuden var en af de nævnte grunde manglen på en ekstracellulær matrix til at understøtte overlevelsen og funktionaliteten af de transplanterede celler10. For at overvinde disse udfordringer lægges der nu vægt på udvikling af biomaterialebærere til støtte for stamcellers levedygtighed og funktion.
Tredimensionel (3D) cellekultur forbedrer celle-til-celle og celle-til-matrix interaktion in vitro for at give et miljø, der bedre ligner in vivo-miljøet 11. Hydrogeler er blevet grundigt undersøgt som en klasse af biomaterialebærere, der giver et 3D-miljø til stamcellekultur. Disse strukturer er lavet af vand og tværbundne polymerer12. Indkapsling af ADSC'er i hydrogel har næsten ingen cytotoksisk virkning på cellerne under dyrkning, samtidig med at cellernes levedygtighedopretholdes 6. Stamceller dyrket i 3D demonstrerer øget fastholdelse af deres stamme og forbedret differentieringskapacitet13. Tilsvarende viste hydrogelfrøede ADSC'er øget levedygtighed og accelereret sårlukning i dyremodeller14. Desuden øger hydrogelindkapsling signifikant indkapsling og tilbageholdelse af ADSC'er i sår15,16. TrueGel3D er lavet af en polymer, enten polyvinylalkohol eller dextran, størknet af en tværbinding, enten cyclodextrin eller polyethylenglycol17. Gelen er en syntetisk hydrogel, der ikke indeholder animalske produkter, der kan forstyrre forsøgene eller udløse en immunreaktion under transplantationen af gelen til en patient, mens den effektivt efterligner en ekstracellulær matrix18. Gelen kan tilpasses fuldt ud ved at ændre sammensætningen og de enkelte komponenter. Det kan rumme forskellige stamceller og understøtte differentieringen af flere celletyper ved at justere stivheden af gelen19. Vedhæftningssteder kan oprettes ved tilsætning af peptider20. Gelen er nedbrydelig ved udskillelse af metalloproteases, hvilket muliggør cellemigration21. Endelig er det klart og giver mulighed for billeddannelsesteknikker.
PBM er en minimalt invasiv og let udført form for laserterapi på lavt niveau, der bruges til at stimulere intracellulære kromoforer. Forskellige bølgelængder fremkalder forskellige virkninger på celler22. Lys i det røde til nær-infrarøde område stimulerer øget adenosintrifosfat (ATP) og produktion af reaktive iltarter (ROS) ved at øge flux gennem elektrontransportkæden23. Lys i de blå og grønne områder stimulerer lyslukkede ionkanaler, hvilket muliggør den ikke-specifikke tilstrømning af kationer, såsom calcium og magnesium, til celler, hvilket vides at forbedre differentiering24. Nettoeffekten er genereringen af sekundære budbringere, der stimulerer transkriptionen af faktorer, der udløser nedstrøms cellulære processer såsom migration, spredning og differentiering25. PBM kan anvendes til at prækonditionere celler til at formere sig eller differentiere, før cellerne transplanteres i et ugunstigt miljø, f.eks. beskadiget væv26. Før og efter transplantation PBM (630 nm og 810 nm) eksponering af ADSC'er forbedrede signifikant levedygtigheden og funktionen af disse celler in vivo i en diabetisk rottemodel27. Regenerativ medicin kræver et tilstrækkeligt antal celler til effektiv reparation af væv28. I 3D-cellekultur har ADSC'er været forbundet med langsommere spredningshastigheder sammenlignet med todimensionel cellekultur6. PBM kan dog bruges til at øge 3D-cellekulturprocessen i ADSC'er ved at forbedre levedygtighed, spredning, migration og differentiering29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer vedrørende alle materialer, reagenser og software, der anvendes i denne protokol. Protokollen er grafisk opsummeret i figur 1.
1. Todimensionel (2D) cellekultur
BEMÆRK: Udødeliggjorte ADSC'er (1 x106 celler) opbevares ved -195,8 °C i flydende nitrogen i et kryopræserveringshætteglas, der indeholder 1 ml cellefrysemedier.
- Klargøring af 2D-cellegenvindingsmediet og 2D-kulturkolben
- 39 ml basalmedium overføres til et 50 ml centrifugeglas
- Berig basalmediet med 20% føtalt bovint serum (FBS; 10 ml) og antibiotika (1 ml) (0,5 ml Penicillin-Streptomycin og 0,5 ml Amphotericin B).
- Konditioner en T75-kolbe ved at overføre 6 ml af cellegenvindingsmediet til kolben og inkubere den ved 37 °C, 5 % CO2 og 85 % fugtighed i 45 minutter (dette kan gøres under udførelse af cellegendannelsestrinnene for at spare tid).
BEMÆRK: Opvarm hele mediet til 37 °C før brug og opbevar det ved 4 °C i højst 1 uge.
- Gendannelse af 2D-celler
- Fjern en kryovital fra opbevaringstanken for flydende nitrogen, og optø hætteglasset hurtigt i vandbad ved 37 °C, indtil det er helt optøet.
- Kryovialt centrifugeres ved hjælp af en centrifuge ved 1006 x g i 5 minutter (20 °C), hvorefter supernatanten fjernes.
- Resuspender de pelleterede celler ved hjælp af 1 ml forvarmet cellegenvindingsmedium.
- De suspenderede celler fordeles jævnt i den konditionerede kolbe (slutvolumen på 7 ml) og inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 og 85 % fugtighed.
- Efter 24 timer kasseres cellegendannelsesmediet og udskiftes.
- Udskift kulturmediet hver 2-3 dage, indtil kolben bliver sammenflydende med celler.
- Høst af 2D-kulturkolbe i enkeltcellesuspension og celletælling
- 2D-kulturkolben fjernes fra inkubatoren, og dyrkningsmediet kasseres i en passende affaldsbeholder.
- Overfør 10 ml skylleopløsning til kolben for at skylle cellerne og fjerne affald og proteinopbygning. Kassér derefter skylleopløsningen.
- Der tilsættes 6 ml løsrivelsesopløsning til dyrkningskolben for at løsne cellerne. Kolben inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 og 85 % fugtighed i 2 min.
BEMÆRK: Overhold kolben under et mikroskop for at bekræfte, at alle celler er blevet løsnet. Hvis ikke, skal du forsigtigt banke på kolben og inkubere i endnu et minut. - Når alle cellerne er løsnet, overføres cellesuspensionen til et 15 ml centrifugerør og tilsættes 1 ml cellegenvindingsmedie (indeholdende 20% FBS) til røret. Dette vil neutralisere effekten af løsrivelsesopløsningen.
- Centrifuger glasset i 5 minutter ved 1711 x g (20 °C).
- Supernatanten fjernes og cellerne resuspenderes i 1 ml hele medier.
- Fjern 10 μL af cellesuspensionen, læg den i et 500 μL mikrocentrifugerør og bland det med 10 μL trypanblåt i forholdet 1:1.
- 10 μL af trypan blue cell-opløsningen blandes i to eksemplarer i et celletællekammer.
- Placer celletællingskammeret i den automatiserede celletæller. Celletælleren angiver det samlede antal celler pr. ml samt antallet af levedygtige og døde celler. Beregn det gennemsnitlige levedygtige celletal og antallet af levedygtige celler, der skal indlejres i 3D-hydrogelen (trin 2.2.6).
2. 3D cellekultur
- Forberedelse af det komplette 3D-kulturmedium
- 44 ml af basalmediet overføres til et 50 ml centrifugeglas.
- Berig medierne med 10% FBS (5 ml) og antibiotika (1 ml) (0,5 ml penicillin-streptomycin og 0,5 ml amphotericin B).
BEMÆRK: Opvarm hele mediet til 37 °C før brug, og opbevar det ved 4 °C i højst en uge.
- Forberedelse af hydrogelen
- Forbered den hurtige dextran ved centrifugering (1000 x g i 30 s ved 20 °C) hætteglasset med hurtig dextran for at koncentrere materialet. Tilsæt 175 μL vand til hætteglasset med hurtig dextran for at opnå en slutkoncentration på 30 mmol / l reaktive grupper.
- Vortex røret (medium hastighed i 30 s), der indeholder hurtig-dextran-opløsningen, indtil materialet er helt opløst. Inkuber det opløste materiale på is i 5 min. Centrifuger røret, hvirvl det kort, og hold det på is under yderligere brug.
- Tværbindingen centrifugeres (1000 x g i 30 s ved 20 °C) for at koncentrere materialet. Tilsæt 188 μL vand til hætteglasset med tværbindingsglas for at opnå en slutkoncentration på 20 mmol/l thiolgrupper.
- Vortex røret (medium hastighed i 30 s), der indeholder tværbindingsopløsningen, indtil alt materiale er opløst. Den opløste tværbinding inkuberes ved stuetemperatur (RT) i 5 min. Centrifuger røret, kort hvirvel, og hold det ved RT under yderligere brug.
- Hydrogelprotokollen tilpasses fra 30 μL til 10 μL for omkostningsreduktion (se tabel 1 for specifikke detaljer).
- Forbered cellesuspensionen for at opnå en såtæthed på 2,5 x 103 celler pr. 10 μL hydrogel.
- Kombiner komponenterne i henhold til tabel 1 for at oprette en masterblanding. Overfør 9 μL af masterblandingen til en brønd i en 96-brønds båndplade.
- Gelen størkner ved at tilsætte 1 μL af den nedbrydelige tværbinding 3 minutter efter, at masterblandingen er overført.
- Dæk hydrogelerne med 170 μL forvarmede komplette kulturmedier. Inkuber i 1 time. Efter 1 time udskiftes kulturmediet.
BEMÆRK: De hydrogelindlejrede celler er klar til yderligere eksperimentering eller analyse inden for 3D-kultursystemet. Følg yderligere protokoller efter behov for downstream-applikationer.
3. Eksponering for fotobiomodulation
- Opsætning af laseren
- Konfigurer diodelasersystemet til enten grønne (525 nm) eller nærinfrarøde (825 nm) bølgelængder. Tænd laserne og lad dem varme op i den anbefalede varighed.
- Stabiliser lasernes effekt ved at lade dem nå en stabil tilstand. Dette sikrer ensartet og nøjagtig bestråling.
- Mål lasernes effekt ved hjælp af en lasereffektmåler. Optag effektværdierne for hver bølgelængde.
- Brug ligning 1 (laserbestrålingstid) til at beregne laserbestrålingstiden. Værdierne fra tabel 2 erstattes af ligning 1 for at bestemme den passende bestrålingstid for hver flydende. I ligning 1 repræsenterer "r" radius af laserens bestrålingszone.
Ligning 1 - Se tabel 2 for de specifikke parametre, der er nødvendige for beregningen, herunder flydende egenskaber (5 J/cm² eller 10 J/cm²) og lasereffekt.
- Bestråling af 3D-cellekulturerne
- Efter udskiftning af hele mediet (trin 2.2.9) anbringes 96-brøndpladen indeholdende hydrogelindlejrede celler under diodelasersystemet. Bestråle hydrogelerne med den beregnede laserbestrålingstid for den valgte flydende temperatur (5 J/cm² eller 10 J/cm²) ved den valgte bølgelængde (grøn eller nær-infrarød). Derfor vil kulturerne kun modtage en enkelt dosis.
- Sørg for, at hver forsøgsgruppe ledsages af en kontrol (n = 4), der består af ADSC'er indlejret i hydrogel uden PBM-eksponering.
BEMÆRK: Brug altid sikkerhedsbriller, der passer til bølgelængden af det lys, du arbejder med. Laserne bruges uden for et sikkerhedsskab; Derfor er det afgørende vigtigt at desinficere området før brug. - Kulturpladerne inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 og 85% fugtighed under forsøgene. Pladerne inkuberes i 24 timer for den første analyse eller 10 dage for den anden analyseperiode efter bestråling.
4. Morfologi
- Omvendt lysmikroskopi
- Tænd for det omvendte lysmikroskop og lad det varme op i et par minutter. Sørg for, at mikroskopet er korrekt justeret og kalibreret.
- Forbered prøven til observation på et mikroskopglas eller en specialiseret cellekulturskål, afhængigt af den eksperimentelle opsætning. Kalibrer mikroskopet for optimale billeddannelsesforhold.
- Juster indstillingerne for fokus, lysstyrke og kontrast efter behov. Vælg 20x objektivlinsen på mikroskopet til observation og registrering af cellemorfologi.
- Placer prøven på mikroskoptrinnet og fokuser på cellerne af interesse ved hjælp af okularet. Brug okularet eller kameravisningen til at observere og registrere cellemorfologien. Vær opmærksom på celleform, størrelse og eventuelle særpræg.
- Fastgør kameramodulet til mikroskopet. Indstil kameraet til digital billedbehandling. Sørg for korrekt forbindelse og kommunikation mellem kameraet og mikroskopet.
- Brug 20x objektivobjektivet til at tage digitale billeder af de observerede celler. Brug kameraets knapper til at justere eksponering, fokus og andre relevante indstillinger.
BEMÆRK: Sørg for, at de optagne billeder er af høj kvalitet og giver et repræsentativt billede af cellemorfologien. - Start billedbehandlingssoftwaren på computeren. Tag billedet, og brug analyseværktøjerne i softwaren til at analysere cellemorfologi.
- Måle celledimensioner, tælle celler eller udføre enhver relevant analyse baseret på de eksperimentelle mål.
- Tilføj en passende skalalinje til billederne ved hjælp af softwaren. Brug den kendte forstørrelse af mikroskopmålet til nøjagtigt at repræsentere billedernes skala.
5. Biokemiske assays
- Gendannelse af celler
BEMÆRK: Cellerne skal genvindes fra hydrogelen i en enkeltcellesuspension for yderligere nedstrøms biokemiske assays.- Forbered den enzymatiske cellegendannelsesopløsning. I et sterilt miljø fremstilles en arbejdsløsning ved at fortynde den enzymatiske cellegenvindingsopløsning med fosfatbufret saltvand (PBS) i et forhold på 1:20 (opløsning: PBS). Hvis det er nødvendigt at genvinde celler fra et bestemt antal geler eller brønde, skal du beregne det samlede krævede volumen baseret på 30 μL genvindingsopløsning pr. Gel.
- Tilsæt 30 μL af arbejdsløsningen til hver gel eller brønd, der indeholder de celler, der skal genvindes. Sørg for en grundig og jævn fordeling af genvindingsopløsningen ved forsigtigt at vippe eller hvirvle pladen. Pladen inkuberes med genvindingsopløsningen i henhold til den anbefalede inkubationstid. Disse oplysninger kan typisk findes i produktdatabladet eller protokollen fra leverandøren.
- Efter inkubationsperioden skal du forsigtigt fjerne pladen fra inkubatoren. Pladerne centrifugeres ved 1409 x g i 5 minutter (20 °C) for at pelletere cellerne. Se produktdatabladet eller protokollen for anbefalede centrifugeringsbetingelser. Når centrifugeringen er afsluttet, kasseres supernatanten forsigtigt, idet man er forsigtig med ikke at forstyrre cellepelleten.
- De pelleterede celler resuspenderes forsigtigt i 220 μL steril PBS. Sørg for grundig blanding for at opnå en homogen enkeltcellesuspension. Cellerne er nu klar til downstream biokemiske assays. Følg de specifikke protokoller for de tilsigtede assays under hensyntagen til arten af de genvundne celler og kravene til den eksperimentelle opsætning.
- Lactat dehydrogenase (LDH) cytotoksicitetsanalyse
- For hvert hul fjernes forsigtigt 50 μL komplette kulturmedier, hvilket sikrer minimal forstyrrelse af cellelaget.
- Der tilsættes 50 μL cytotoksicitetsreagens direkte til hvert hul, der indeholder de resterende 50 μl dyrkningsmedier. Bland forsigtigt ved pipettering op og ned for at sikre grundig blanding af prøven med reagenset.
- Forbered en positiv kontrol. Opsæt tredobbelte brønde med 5 μL 10x lyseopløsning pr. 50 μL positive kontrolceller inkluderet i sættet.
- Inkuber pladen ved den anbefalede temperatur og varighed. Dette trin gør det muligt for cytotoksicitetsreagenset at lyse cellerne og frigive LDH i kulturmediet.
- Efter inkubationsperioden tilsættes 50 μL stopopløsning direkte til hvert hul, der indeholder cytotoksicitetsreagenset og cellelysatet. Bland forsigtigt ved pipettering op og ned for at sikre korrekt standsning af reaktionen.
BEMÆRK: Stopopløsningen stopper yderligere LDH-frigivelse og sikrer stabiliteten af farveudviklingen. - Indstil den spektrofotometriske pladelæser i henhold til producentens anvisninger. Absorbansen af hvert hul registreres ved 490 nm. Denne bølgelængde er specifik for den kolorimetriske påvisning af formazanproduktet genereret af LDH-reaktionen.
- Træk baggrundsabsorbansaflæsninger fra både behandlingsgrupper og kontrolhuller. Få baggrundsaflæsninger fra brønde indeholdende medier og cytotoksicitetsreagenser uden celler.
- De korrigerede absorbansværdier for hver prøve analyseres for at bestemme cytotoksicitetsniveauet. Højere absorbansværdier indikerer øget LDH-frigivelse og følgelig højere cytotoksicitet.
- Sørg for, at hver forsøgsgruppe og kontrol bestod af fire gentagelser (trin 3.2.2) for statistisk nøjagtighed. Den gennemsnitlige absorbans for hver gruppe og kontrol beregnes og importeres til et passende statistisk program.
- Sammenlign resultaterne mellem behandlingsgrupper og passende kontroller for at vurdere de cytotoksiske virkninger nøjagtigt og registrere alle absorbansaflæsninger, beregninger og eksperimentelle betingelser til fremtidig reference.
- ATP-proliferationsanalyse
- I et sterilt miljø blandes 50 μL af de genvundne celler med 50 μL ATP-reagenset i hvert hul.
BEMÆRK: Juster volumen af celler og reagenser baseret på antallet af brønde og eksperimentelt design. Oprethold ensartede forhold for nøjagtige resultater. - Læg pladen på en shaker og ryst kraftigt i mørke i 5 min. Dette trin sikrer grundig blanding af cellerne med reagenset. Efter omrystning inkuberes pladen i yderligere 25 minutter ved RT. Denne inkubationsperiode gør det muligt for reagenset at lyse cellerne og generere et selvlysende signal, der er proportionalt med mængden af ATP, der er til stede.
- Konfigurer pladelæseren i henhold til producentens anvisninger til luminescensregistrering. Luminescens måles fra hvert hul, der indeholder cellelysat og ATP-reagens. Sørg for, at pladelæseren er indstillet til at måle luminescens med passende indstillinger.
- Træk baggrundsluminescensaflæsninger fra både behandlingsgrupper og kontrolhuller. Få baggrundsaflæsninger fra brønde, der kun indeholder ATP-reagenset og PBS uden celler.
- Analyser de korrigerede luminescensværdier for hver prøve for at bestemme ATP-niveauer, hvilket afspejler celleproliferation eller levedygtighed.
- Sørg for, at hver forsøgsgruppe og kontrol bestod af fire gentagelser (trin 3.2.2) for statistisk nøjagtighed. Beregn og importer den gennemsnitlige luminescens for hver gruppe og kontrol til et passende statistisk program.
- Sammenlign resultaterne mellem behandlingsgrupper og relevante kontroller for at vurdere ATP-proliferation nøjagtigt. Registrer alle luminescensaflæsninger, beregninger og eksperimentelle betingelser til fremtidig reference.
BEMÆRK: For alle biokemiske analyser i kitform skal du følge sættets manual eller protokol leveret af producenten for specifikke detaljer, såsom anbefalede inkubationstider, koncentrationer og eventuelle yderligere trin eller overvejelser. Overhold altid laboratoriets sikkerhedsretningslinjer ved håndtering af kemikalier og biologiske materialer.
- I et sterilt miljø blandes 50 μL af de genvundne celler med 50 μL ATP-reagenset i hvert hul.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at vurdere morfologien og visuelt inspicere hydrogelernes celletæthed blev invers mikroskopi anvendt (figur 2). ADSC'erne bevarede en afrundet morfologi 24 timer efter såning og PBM-eksponering. Cellerne blev spredt gennem gelen som enkeltceller eller i druelignende klynger. Morfologien var uændret efter 10 dage i 3D-kultur. Der blev ikke konstateret nogen definitiv forskel i morfologi mellem forsøgsgrupperne og kontrollerne eller mellem de forskellige eksperimentelle grupper.
For at vurdere de cytotoksiske virkninger af PBM-eksponering og 3D-kultur ved hjælp af hydrogel blev LDH-lækage målt (figur 3). Der var ingen signifikante forskelle mellem forsøgsgrupperne og kontrollerne efter 24 timer eller 10 dage, hvilket indikerer, at PBM-eksponering og hydrogelkultur ikke havde nogen skadelig virkning på cellerne.
Cellulære spredningshastigheder blev målt ved at måle ATP-indholdet i ADSC'er (figur 4). PBM-eksponering resulterede i øgede spredningshastigheder i alle eksperimentelle grupper sammenlignet med kontrollerne. Ved 24 timers post-PBM-eksponering stimulerede 525 nm bølgelængden de højeste spredningshastigheder. Ved 10-dages mærket viste 825 nm-bølgelængden imidlertid overlegne spredningshastigheder sammenlignet med 525 nm-bølgelængden. Ved afslutningen af den 10-dages dyrkningsperiode viste 825 nm, 10 J/cm2-gruppen den højeste spredningshastighed.
Figur 1: Oversigt over protokollen. Opsummeret protokol, der fremhæver fremstillingen af hydrogelen i 96 brøndplader, PBM-eksponering og måling af morfologi og biokemiske assays ved 24 timer og 10 dage efter PBM-eksponering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: ADSC'er selvaggregeret efter såning. Cellerne bevarede en rund til oval morfologi og blev fordelt i hydrogelen som enten enkeltceller eller aggregater med et druelignende klyngeudseende ved (A) 24 timer og (B) 10 dage efter såning og PBM-eksponering. Der blev ikke observeret nogen endelig ændring efter 10 dages inkubation. Brug af betjeningsanordninger (1 og 4), 525 nm ved henholdsvis 5 J/cm2 (2) og 10 J/cm2 (5) eller 825 nm ved 5 J/cm2 (3) og 10 J/cm2 (6). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Cellulær LDH-lækage som måling af cytotoksicitet 24 timer og 10 dage efter PBM-eksponering ved hjælp af en 525 nm og 825 nm diode (5 J/cm2 og 10 J/cm2) i hydrogelen. Der blev ikke observeret nogen signifikant stigning i cytotoksicitet sammenlignet med den eksperimentelle kontrol. Den positive kontrol var repræsentativ for fuldstændig celledød. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Cellulær ATP som måling af proliferation 24 timer og 10 dage efter PBM-eksponering ved hjælp af en 525 nm og 825 nm diode (5 J/cm2 og 10 J/cm2) i hydrogelen. PBM-eksponering stimulerede øgede spredningshastigheder i alle eksperimentelle grupper på begge tidspunkter og begge fluenser. Signifikante forskelle (P < 0,001) er angivet med ***. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Komponent | Volumen (μL) pr. brønd |
| SLO-Dextran polymer (30 mmol / L) | 0.7 |
| Celle suspension | 2 |
| Buffer | 0.8 |
| Vand | 5.5 |
| Tværlink | 1 |
| Samlet volumen | 10 |
Tabel 1: Hydrogel (10 μL) reagensvolumener.
| Laser Parametre | Grøn (G) | Tæt på infrarød (NIR) |
| Lyskilde | Diode Laser | Diode Laser |
| Bølgelængde (nm) | 525 | 825 |
| Udgangseffekt (mW) | 553 | 515 |
| Effekttæthed (mW/cm2) | 57.48 | 53.53 |
Tabel 2: Laserparametre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ADSC'er er en ideel celletype til brug for regenerativ medicin, da de stimulerer forskellige processer til at hjælpe med sårheling 3,4. Der er dog flere udfordringer, der skal omgås, f.eks. dårlige overlevelsesrater og ineffektiv indkapsling af cellerne på et skadested9. Udødeliggjorte celler blev brugt som en kommercielt tilgængelig cellelinje, da de kan passeres i flere generationer sammenlignet med primære celler, de behøver ikke at blive høstet, er godt karakteriserede og er homogene populationer, der sikrer ensartede resultater31. Formålet med denne undersøgelse var at bestemme PBM's forstærkende potentiale på spredning og cytotoksicitet af ADSC'er ved hjælp af 3D-cellekultur. Producentens protokol for en 30 μL hydrogel er blevet tilpasset til en 10 μL for at spare omkostninger32. Dette reducerede volumen gjorde imidlertid forberedelsen og håndteringen af gelen vanskeligere.
ADSC'er har vist sig at samle sig selv i et 3D-miljø33. På samme måde dannede cellerne i denne undersøgelse celleaggregater med et druelignende udseende. Imidlertid blev enkeltlægningsceller også identificeret. Celleafgivelse er en kendt egenskab ved sfæroider, hvor celler løsnes fra hovedsfæroiden eller aggregatlegemet og frigives i kulturmiljøet. Celleafgivelse kan skyldes cellulær proliferation, hvor levedygtige celler kastes under mitose og muliggør migration34. Alternativt kan afgivelse resultere på grund af celledød og tab af sfærisk eller samlet form35, især i meget store sfæroider på grund af en voksende nekrotisk kerne. Cellerne vedtog en afrundet morfologi i 3D-kultur sammenlignet med en spindelform i 2D-kulturer. I overensstemmelse med resultaterne af lignende undersøgelser skyldes disse resultater mangel på fastgørelsessteder eller ekstracellulær matrix for cellerne at klæbe til 6,9. Desuden viste cellerne ingen signifikant migration i gelen, hvilket yderligere antyder behovet for fastgørelsessteder36. Det anbefales at tilføje et vedhæftningspeptid eller et andet ekstracellulært matrixprotein for at lette fastgørelse, vedhæftning og migration. En begrænsning af undersøgelsen var brugen af invers lysmikroskopi til at observere 3D-morfologien af ADSC'erne i stedet for Z-stabling. PBM-eksponering og 3D-kultur havde ingen signifikant effekt på ADSC'ernes cytotoksicitet hverken 24 timer eller 10 dage efter eksponering, hvilket indikerer, at hydrogelkultur og PBM er sikre og ikke har nogen negativ indvirkning på cellerne 6,26. I 3D-cellekultur har ADSC'er været forbundet med langsommere spredningshastigheder sammenlignet med 2D-cellekultur. Dette understøttes af de lave spredningsrater for de normale kontroller i den aktuelle undersøgelse6. PBM (525 nm og 825 nm) øgede signifikant spredningshastighederne for ADSC'er i 3D-kultur. Indledningsvis fremkaldte det grønne lys (525 nm) ved både 5 J / cm2 og 10 J/ cm 2 fluencies de højeste spredningshastigheder sammenlignet med det nær-infrarøde lys (825 nm). Ved 10-dages mærket har det nær-infrarøde lys (825 nm) imidlertid de højeste spredningshastigheder ved både 5 J / cm2 og 10 J / cm2 fluencies. Tilsvarende har PBM (525 nm og 825 nm) vist sig at øge spredningshastigheden i 2D-kulturer37. Det anbefales også at inkludere en bølgelængdekombinationsgruppe, da andre undersøgelser har rapporteret en synergistisk effekt af grønt og nær-infrarødt lys.
Afslutningsvis er den anvendte hydrogel en syntetisk hydrogel med enorm tilpasningskapacitet, der passer til behovene i forskellige applikationer. Den aktuelle undersøgelse har vist, at gelen ikke har nogen cytotoksisk virkning på celler i kultur over en 10-dages periode. Desuden viste PBM et positivt forstærkningspotentiale ved betydeligt at opregulere spredningshastighederne for ADSC'er, på trods af at de var i et 3D-kulturmiljø. Således kan denne hydrogel tjene som en mulig biomaterialebærer til transplantation i sår. Fremtidige undersøgelser bør sigte mod at teste gelens potentielle evne til at hjælpe med sårheling ved hjælp af dyreforsøg. Hvis resultaterne af dyreforsøg er gunstige, forventes det, at patientafledte ADSC'er kan høstes, indkapsles og forstærkes med PBM inden transplantation til sår for at hjælpe med sårheling i kliniske applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af National Research Foundation of South Africa Thuthuka Instrument, bevillingsnummer TTK2205035996; Institut for Naturvidenskab og Innovation (DSI) finansieret African Laser Centre (ALC), bevillingsnummer HLHA23X opgave ALC-R007; Universitetsforskningsrådet, bevillingsnummer 2022URC00513; Institut for Naturvidenskab og Teknologis South African Research Chairs Initiative (DST-NRF/SARChI), bevillingsnummer 98337. Finansieringsorganerne spillede ingen rolle i udformningen af undersøgelsen, indsamlingen, analysen, fortolkningen af dataene eller skrivningen af manuskriptet. Forfatterne takker University of Johannesburg (UJ) og Laser Research Centre (LRC) for deres brug af faciliteterne og ressourcerne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 525 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | EN 60825-1:2007 | |
| 825 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | SN 101080908ADR-1800 | |
| 96 Well Strip Plates | Sigma-Aldrich | BR782301 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | ATP reagent, Proliferation assay Kit |
| Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430659 | cryovial |
| CryoSOfree | Sigma-Aldrich | C9249 | Cell freezing media |
| CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | Cytotoxicity reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Media | Sigma-Aldrich | D5796 | Basal medium (39 mL/44 mL) |
| FieldMate Laser Power Meter | Coherent | 1098297 | |
| Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate | Sigma-Aldrich | CLS3370 | |
| Foetal bovine serum | Biochrom | S0615 | Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%) |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | Rinse solution |
| Heracell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51026280 | |
| Heraeus Labofuge 400 | Thermo Scientific | 75008371 | Plate spinner for 96 well plates |
| Heraeus Megafuge 16R centrifuge | ThermoFisher | 75004270 | |
| Immortalized ADSCs | ATCC | ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000 | Passage 37 |
| Invitrogen Countess 3 | Invitrogen | AMQAX2000 | Automated cell counter for Trypan Blue |
| Julabo TW20 waterbath | Sigma-Aldrich | Z615501 | Waterbath used to warm media to 37 °C |
| Olympus CellSens Entry | Olympus | Version 3.2 (23706) | Imaging software: digital image acquisition |
| Olympus CKX41 | Olympus | SN9B02019 | Inverted light microscope |
| Olympus SC30 camera | Olympus | SN57000530 | Camera attached to inverted light microscope |
| Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates | Sigma-Aldrich | CLS3912 | Opaque well used for ATP luminescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| SigmaPlot 12.0 | Systat Software Incorporated | ||
| TrueGel3D – True3 | Sigma-Aldrich | TRUE3-1KT | 10 µL |
| TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution | Sigma-Aldrich | TRUEENZ | 01:20 |
| Trypan Blue Stain | Thermo Fisher - Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Gibco | 12563029 | Cell detachment solution |
| Victor Nivo Plate Reader | Perkin Elmer | HH3522019094 | Spectrophotometric plate reader |
References
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Yuan, X., et al. Strategies for improving adipose-derived stem cells for tissue regeneration. Burns Trauma. 10, (2022).
- Nilforoushzadeh, M. A., et al. Mesenchymal stem cell spheroids embedded in an injectable thermosensitive hydrogel: An in situ drug formation platform for accelerated wound healing. ACS Biomater Sci Eng. 6 (9), 5096-5109 (2020).
- Yang, M., et al. Thermosensitive injectable chitosan/collagen/β-glycerophosphate composite hydrogels for enhancing wound healing by encapsulating mesenchymal stem cell spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21015-21023 (2020).
- Chimenti, I., et al. Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice. Circ Res. 106 (5), 971-980 (2010).
- Hassan, W., Dong, Y., Wang, W. Encapsulation and 3d culture of human adipose-derived stem cells in an in-situ crosslinked hybrid hydrogel composed of peg-based hyperbranched copolymer and hyaluronic acid. Stem Cell Res Ther. 4 (2), 32 (2013).
- Wu, K. H., Mo, X. M., Han, Z. C., Zhou, B. Stem cell engraftment and survival in the ischemic heart. The Ann Thorac Surg. 92 (5), 1917-1925 (2011).
- Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: General approaches and a review of recent developments. J R Soc Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
- Koivunotko, E., et al. Angiogenic potential of human adipose-derived mesenchymal stromal cells in nanofibrillated cellulose hydrogel. Biomedicines. 10 (10), 2584 (2022).
- Dong, Y., et al. Injectable and tunable gelatin hydrogels enhance stem cell retention and improve cutaneous wound healing. Adv Funct Mater. 27 (24), 1606619 (2017).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3d cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
- Sung, T. -C., et al. 3D culturing of human adipose-derived stem cells enhances their pluripotency and differentiation abilities. J Mater Sci Technol. 63, 9-17 (2021).
- Garg, R. K., et al. Capillary force seeding of hydrogels for adipose-derived stem cell delivery in wounds. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1079-1089 (2014).
- Kim, Y. M., et al. Adipose-derived stem cell-containing hyaluronic acid/alginate hydrogel improves vocal fold wound healing. Laryngoscope. 124 (3), E64-E72 (2014).
- Dong, Y., et al. Conformable hyaluronic acid hydrogel delivers adipose-derived stem cells and promotes regeneration of burn injury. Acta Biomater. 108, 56-66 (2020).
- Truegel3d hydrogel for 3d cell culture. Merck. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/ZA/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/3d-cell-culture/truegel3d (2024).
- Braccini, S., Tacchini, C., Chiellini, F., Puppi, D. Polymeric hydrogels for in vitro 3d ovarian cancer modeling. Int J Mol Sci. 23 (6), 3265 (2022).
- Mashinchian, O., et al. In vivo transcriptomic profiling using cell encapsulation identifies effector pathways of systemic aging. eLife. 11, e57393 (2022).
- Matsushige, C., Xu, X., Miyagi, M., Zuo, Y. Y., Yamazaki, Y. Rgd-modified dextran hydrogel promotes follicle growth in three-dimensional ovarian tissue culture in mice. Theriogenology. 183, 120-131 (2022).
- Marx, V. How some labs put more bio into biomaterials. Nat Methods. 16 (5), 365-368 (2019).
- Marques, M. M.
- Hamblin, M. R. Mechanisms and mitochondrial redox signaling in photobiomodulation. Photochem Photobiol. 94 (2), 199-212 (2018).
- Chen, J., et al. Low-level controllable blue LEDs irradiation enhances human dental pulp stem cells osteogenic differentiation via transient receptor potential vanilloid 1. J Photochem Photobiol B. 233, 112472 (2022).
- Chang, S. -Y., Carpena, N. T., Kang, B. J., Lee, M. Y. Effects of photobiomodulation on stem cells important for regenerative medicine. Med Lasers. 9 (2), 134-141 (2020).
- Bikmulina, P. Y., et al. Beyond 2d: Effects of photobiomodulation in 3d tissue-like systems. J Biomed Opt. 25 (4), 048001 (2020).
- Ahmadi, H., et al. Transplantation of photobiomodulation-preconditioned diabetic stem cells accelerates ischemic wound healing in diabetic rats. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 494 (2020).
- Mao, A. S., Mooney, D. J. Regenerative medicine: Current therapies and future directions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (47), 14452-14459 (2015).
- De Andrade, A. L. M., et al. Effect of photobiomodulation on the behaviour of mesenchymal stem cells in three-dimensional cultures. Lasers Med Sci. 38 (1), 221 (2023).
- Diniz, I. M., et al. Photobiomodulation of mesenchymal stem cells encapsulated in an injectable rhbmp4-loaded hydrogel directs hard tissue bioengineering. J Cell Physiol. 233 (6), 4907-4918 (2018).
- Carter, M., Shieh, J. C. Guide to Research Techniques in Neuroscience. , Elsevier, Academic Press. (2015).
- Lutolf, M. P., et al. Synthetic matrix metalloproteinase-sensitive hydrogels for the conduction of tissue regeneration: Engineering cell-invasion characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5413-5418 (2003).
- Robledo, F., et al. Spheroids derived from the stromal vascular fraction of adipose tissue self-organize in complex adipose organoids and secrete leptin. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 70 (2023).
- Landry, J., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Shedding of mitotic cells from the surface of multicell spheroids during growth. J Cell Physiol. 106 (1), 23-32 (1981).
- Bogacheva, M. S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into definitive endoderm cells in various flexible three-dimensional cell culture systems: Possibilities and limitations. Front Cell Dev Biol. 9, 726499 (2021).
- Chen, X., Thibeault, S. L. Biocompatibility of a synthetic extracellular matrix on immortalized vocal fold fibroblasts in 3-d culture. Acta Biomater. 6 (8), 2940-2948 (2010).
- Crous, A., Van Rensburg, M. J., Abrahamse, H. Single and consecutive application of near-infrared and green irradiation modulates adipose derived stem cell proliferation and affect differentiation factors. Biochimie. 196, 225-233 (2022).
