Summary
Hier presenteren we een protocol dat het gebruik van hydrogel demonstreert als een driedimensionaal (3D) celkweekraamwerk voor vet-afgeleide stamcelkweek (ADSC) en de introductie van fotobiomodulatie (PBM) om de proliferatie van ADSC's binnen de 3D-kweekomgeving te verbeteren.
Abstract
Van vet afgeleide stamcellen (ADSC's), met multipotente mesenchymale kenmerken die verwant zijn aan stamcellen, worden vaak gebruikt in de regeneratieve geneeskunde vanwege hun vermogen tot een breed scala aan celdifferentiatie en hun vermogen om migratie, proliferatie te verbeteren en ontstekingen te verminderen. ADSC's worden echter vaak geconfronteerd met uitdagingen bij overleving en implantatie in wonden, voornamelijk als gevolg van ongunstige ontstekingsomstandigheden. Om dit probleem aan te pakken, zijn hydrogels ontwikkeld om de levensvatbaarheid van ADSC in wonden te behouden en het wondgenezingsproces te versnellen. Hier wilden we de synergetische impact van fotobiomodulatie (PBM) op ADSC-proliferatie en cytotoxiciteit beoordelen binnen een 3D-celkweekkader. Onsterfelijke ADSC's werden gezaaid in hydrogels van 10 μl met een dichtheid van 2,5 x 103 cellen en onderworpen aan bestraling met diodes van 525 nm en 825 nm met fluenties van 5 J/cm2 en 10 J/cm2. Morfologische veranderingen, cytotoxiciteit en proliferatie werden 24 uur en 10 dagen na PBM-blootstelling geëvalueerd. De ADSC's vertoonden een afgeronde morfologie en waren verspreid door de gel als individuele cellen of sferoïde aggregaten. Belangrijk is dat zowel PBM als het 3D-kweekraamwerk geen cytotoxische effecten op de cellen vertoonden, terwijl PBM de proliferatiesnelheden van ADSC's aanzienlijk verhoogde. Concluderend toont deze studie het gebruik van hydrogel aan als een geschikte 3D-omgeving voor ADSC-kweek en introduceert PBM als een belangrijke augmentatiestrategie, met name gericht op de langzame proliferatiesnelheden die gepaard gaan met 3D-celkweek.
Introduction
ADSC's zijn mesenchymale multipotente voorlopercellen met het vermogen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in verschillende cellijnen. Deze cellen kunnen tijdens een lipoaspiratieprocedureworden geoogst uit de stromale vasculaire fractie (SVF) van vetweefsel1. ADSC's zijn naar voren gekomen als een ideaal stamceltype om te gebruiken in de regeneratieve geneeskunde, omdat deze cellen overvloedig zijn, minimaal invasief om te oogsten, gemakkelijk toegankelijk engoed gekarakteriseerd. Stamceltherapie biedt een mogelijke weg voor wondgenezing door celmigratie, proliferatie, neovascularisatie te stimuleren en ontstekingen in wonden te verminderen 3,4. Ongeveer 80% van het regeneratieve vermogen van ADSC's is toe te schrijven aan paracriene signalering via hun secretoom5. Eerder werd gesuggereerd dat een directe lokale injectie van stamcellen of groeifactoren in beschadigd weefsel voldoende in vivo herstelmechanismen zou kunnen veroorzaken 6,7,8. Deze aanpak stuitte echter op verschillende uitdagingen, zoals een slechte overleving en verminderde stamcelimplantatie in beschadigde weefsels als gevolg van de inflammatoire omgeving. Bovendien was een van de genoemde redenen het ontbreken van een extracellulaire matrix om de overleving en functionaliteit van de getransplanteerde cellen te ondersteunen10. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, wordt nu de nadruk gelegd op de ontwikkeling van biomateriaaldragers om de levensvatbaarheid en functie van stamcellen te ondersteunen.
Driedimensionale (3D) celkweek verbetert de interactie tussen cellen en cellen en matrixen in vitro om een omgeving te bieden die beter lijkt op de in vivo omgeving11. Hydrogels zijn uitgebreid bestudeerd als een klasse van biomateriaaldragers die een 3D-omgeving bieden voor stamcelkweek. Deze structuren zijn gemaakt van water en verknoopte polymeren12. Inkapseling van ADSC's in hydrogel heeft vrijwel geen cytotoxisch effect op de cellen tijdens de kweek, terwijl de levensvatbaarheid van de cellen behoudenblijft 6. Stamcellen die in 3D zijn gekweekt, vertonen een verbeterd behoud van hun stamheid en een verbeterd differentiatievermogen13. Evenzo vertoonden ADSC's met hydrogel gezaaide ADSC's een verhoogde levensvatbaarheid en versnelde wondsluiting in diermodellen14. Bovendien verhoogt hydrogel-inkapseling de implantatie en retentie van ADSC's in wonden aanzienlijk15,16. TrueGel3D is gemaakt van een polymeer, polyvinylalcohol of dextran, gestold door een crosslinker, cyclodextrine of polyethyleenglycol17. De gel is een synthetische hydrogel die geen dierlijke producten bevat die de experimenten kunnen verstoren of een immuunreactie kunnen veroorzaken tijdens de transplantatie van de gel in een patiënt, terwijl een extracellulaire matrix effectief wordt nagebootst18. De gel is volledig aanpasbaar door de samenstelling en afzonderlijke componenten te wijzigen. Het kan verschillende stamcellen huisvesten en de differentiatie van verschillende celtypen ondersteunen door de stijfheid van de gel aan te passen19. Aanhechtingsplaatsen kunnen worden gecreëerd door de toevoeging van peptiden20. De gel is afbreekbaar door de afscheiding van metalloproteasen, waardoor celmigratie mogelijkis21. Ten slotte is het duidelijk en maakt het beeldvormingstechnieken mogelijk.
PBM is een minimaal invasieve en gemakkelijk uit te voeren vorm van lasertherapie op laag niveau die wordt gebruikt om intracellulaire chromoforen te stimuleren. Verschillende golflengten wekken verschillende effecten op cellen op22. Licht in het rode tot nabij-infrarode bereik stimuleert een verhoogde productie van adenosinetrifosfaat (ATP) en reactieve zuurstofsoorten (ROS) door de flux door de elektronentransportketen te verbeteren23. Licht in het blauwe en groene bereik stimuleert lichtafhankelijke ionkanalen, waardoor de niet-specifieke instroom van kationen, zoals calcium en magnesium, in cellen mogelijk wordt, waarvan bekend is dat het de differentiatie verbetert24. Het netto-effect is de generatie van secundaire boodschappers die de transcriptie stimuleren van factoren die stroomafwaartse cellulaire processen in gang zetten, zoals migratie, proliferatie en differentiatie25. PBM kan worden gebruikt om cellen vooraf te conditioneren om zich te vermenigvuldigen of te differentiëren voordat de cellen worden getransplanteerd in een ongunstige omgeving, bijvoorbeeld beschadigdweefsel26. Blootstelling aan PBM (630 nm en 810 nm) van ADSC's vóór en na transplantatie verbeterde de levensvatbaarheid en functie van deze cellen in vivo aanzienlijk in een diabetisch rattenmodel27. Regeneratieve geneeskunde vereist een voldoende aantal cellen voor effectief herstel van weefsels28. In 3D-celkweek zijn ADSC's in verband gebracht met langzamere proliferatiesnelheden in vergelijking met tweedimensionale celkweek6. PBM kan echter worden gebruikt om het 3D-celkweekproces van ADSC's te verbeteren door de levensvatbaarheid, proliferatie, migratie en differentiatie te verbeteren29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, reagentia en software die in dit protocol worden gebruikt. Het protocol is grafisch samengevat in figuur 1.
1. Tweedimensionale (2D) celkweek
OPMERKING: Onsterfelijke ADSC's (1 x106 cellen) worden bewaard bij -195,8 °C in vloeibare stikstof in een cryopreservatieflacon met 1 ml celbevriezingsmedia.
- Voorbereiding van het 2D-celherstelmedium en de 2D-kweekkolf
- Breng 39 ml van het basale medium over in een centrifugebuis van 50 ml
- Verrijk het basale medium met 20% foetaal runderserum (FBS; 10 ml) en antibiotica (1 ml) (0,5 ml penicilline-streptomycine en 0,5 ml amfotericine B).
- Conditioneer een T75-kolf door 6 ml van het celterugwinningsmedium in de kolf over te brengen en deze gedurende 45 minuten te incuberen bij 37 °C, 5% CO2 en 85% vochtigheid (dit kan worden gedaan tijdens het uitvoeren van de celherstelstappen om tijd te besparen).
NOTITIE: Verwarm het complete medium voor gebruik tot 37 °C en bewaar het bij 4 °C voor een periode van maximaal 1 week.
- Herstel van 2D-cellen
- Haal een cryoflacon uit de opslagtank voor vloeibare stikstof en ontdooi de injectieflacon snel in een waterbad van 37 °C, totdat deze volledig ontdooid is.
- Draai de cryovial met behulp van een centrifuge bij 1006 x g gedurende 5 minuten (20 °C) en verwijder daarna het supernatant.
- Resuspendeer de gepelleteerde cellen met 1 ml voorverwarmd celterugwinningsmedium.
- Verdeel de zwevende cellen gelijkmatig in de voorgeconditioneerde kolf (eindvolume van 7 ml) en incubeer bij 37 °C, 5% CO2 en 85% vochtigheid.
- Gooi na 24 uur het celherstelmedium weg en vervang het.
- Vervang het kweekmedium elke 2-3 dagen totdat de kolf samenvloeit met cellen.
- Oogst van een 2D-kweekkolf in eencellige suspensie en celgetal
- Haal de 2D-kweekkolf uit de incubator en gooi de kweekmedia weg in een geschikte afvalcontainer.
- Breng 10 ml spoeloplossing over in de kolf om de cellen te spoelen en afvalstoffen en eiwitophopingen te verwijderen. Gooi daarna de spoeloplossing weg.
- Voeg 6 ml loslatingsoplossing toe aan de kweekkolf om de cellen los te maken. Incubeer de kolf bij 37 °C, 5% CO2 en 85% luchtvochtigheid gedurende 2 min.
OPMERKING: Bekijk de kolf onder een microscoop om te bevestigen dat alle cellen zijn losgemaakt. Als dit niet het geval is, tikt u zachtjes op de kolf en incubeert u nog een minuut. - Zodra alle cellen zijn losgemaakt, brengt u de celsuspensie over in een centrifugebuis van 15 ml en voegt u 1 ml van het celterugwinningsmedium (met 20% FBS) toe aan het buisje. Hierdoor wordt het effect van de loslatingsoplossing geneutraliseerd.
- Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 1711 x g (20 °C).
- Verwijder het supernatans en resuspendeer de cellen in 1 ml volledig medium.
- Verwijder 10 μL van de celsuspensie, plaats deze in een microcentrifugebuisje van 500 μL en meng het met 10 μL trypanblauw in een verhouding van 1:1.
- Breng 10 μl van het mengsel van de trypanoplossing in tweevoud in een celtelkamer.
- Plaats de cellentelkamer in de geautomatiseerde cellenteller. De cellenteller geeft het totale aantal cellen per ml aan, evenals het aantal levensvatbare en dode cellen. Bereken het gemiddelde aantal levensvatbare cellen en het aantal levensvatbare cellen dat in de 3D-hydrogel moet worden ingebed (stap 2.2.6).
2. 3D celkweek
- Voorbereiding van het 3D complete kweekmedium
- Breng 44 ml van het basale medium over in een centrifugebuis van 50 ml.
- Verrijk de media met 10% FBS (5 ml) en antibiotica (1 ml) (0,5 ml penicilline-streptomycine en 0,5 ml amfotericine B).
NOTITIE: Verwarm het complete medium voor gebruik tot 37 °C en bewaar het maximaal een week bij 4 °C.
- Bereiding van de hydrogel
- Bereid de snelle dextran door de injectieflacon met snelle dextraan te centrifugeren (1000 x g gedurende 30 s bij 20 °C) om het materiaal te concentreren. Voeg 175 μL water toe aan de injectieflacon met snelle dextraan om een eindconcentratie van 30 mmol/L reactieve groepen te bereiken.
- Draai de buis (gemiddelde snelheid gedurende 30 s) met de snel-dexter-oplossing totdat het materiaal volledig is opgelost. Incubeer het opgeloste materiaal gedurende 5 minuten op ijs. Centrifugeer de buis, draai hem kort en bewaar hem op ijs tijdens verder gebruik.
- Centrifugeer de crosslinker (1000 x g gedurende 30 s bij 20 °C) om het materiaal te concentreren. Voeg 188 μL water toe aan de injectieflacon met crosslinker om een uiteindelijke concentratie van 20 mmol/L thiolgroepen te bereiken.
- Draai de buis (gemiddelde snelheid gedurende 30 s) met de crosslinkeroplossing totdat al het materiaal is opgelost. Incubeer de opgeloste crosslinker bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 min. Centrifugeer de buis, kort vortex, en houd deze bij RT tijdens verder gebruik.
- Pas het hydrogelprotocol aan van 30 μL naar 10 μL voor kostenbesparing (zie tabel 1 voor specifieke details).
- Bereid de celsuspensie voor om een zaaidichtheid van 2,5 x 103 cellen per 10 μL hydrogel te bereiken.
- Combineer de componenten volgens tabel 1 om een mastermix te maken. Breng 9 μl van het mastermengsel over in een kuiltje in een stripplaat met 96 putjes.
- Stijg de gel door 1 μL van de afbreekbare crosslinker toe te voegen 3 minuten nadat de mastermix is overgebracht.
- Bedek de hydrogels met 170 μL voorverwarmde complete kweekmedia. Incubeer gedurende 1 uur. Vervang na 1 uur het kweekmedium.
OPMERKING: De in hydrogel ingebedde cellen zijn klaar voor verdere experimenten of analyse binnen het 3D-kweeksysteem. Volg indien nodig aanvullende protocollen voor downstreamtoepassingen.
3. Blootstelling aan fotobiomodulatie
- De laser instellen
- Stel het diodelasersysteem in voor groene (525 nm) of nabij-infrarode (825 nm) golflengten. Schakel de lasers in en laat ze gedurende de aanbevolen duur opwarmen.
- Stabiliseer het uitgangsvermogen van de lasers door ze een stabiele toestand te laten bereiken. Dit zorgt voor een consistente en nauwkeurige bestraling.
- Meet het uitgangsvermogen van de lasers met behulp van een laservermogensmeter. Noteer de vermogenswaarden voor elke golflengte.
- Gebruik vergelijking 1 (laserbestralingstijd) om de laserbestralingstijd te berekenen. Vervang de waarden uit tabel 2 door vergelijking 1 om de juiste bestralingstijd voor elke vloeiendheid te bepalen. In vergelijking 1 staat "r" voor de straal van de bestralingszone van de laser.
Vergelijking 1 - Raadpleeg tabel 2 voor de specifieke parameters die nodig zijn voor de berekening, waaronder vloeiendheden (5 J/cm² of 10 J/cm²) en het uitgangsvermogen van de laser.
- Bestraling van de 3D-celculturen
- Plaats na het vervangen van de volledige media (stap 2.2.9) de plaat met 96 putjes met in hydrogel ingebedde cellen onder het diodelasersysteem. Bestraal de hydrogels met de berekende laserbestralingstijd voor de geselecteerde vloeiendheid (5 J/cm² of 10 J/cm²) op de gekozen golflengte (groen of nabij-infrarood). Daarom krijgen de culturen slechts één dosis.
- Zorg ervoor dat elke experimentele groep vergezeld gaat van een controlegroep (n = 4), bestaande uit ADSC's ingebed in hydrogel zonder PBM-blootstelling.
NOTITIE: Draag altijd een veiligheidsbril die geschikt is voor de golflengte van het licht waarmee u werkt. De lasers worden buiten een veiligheidskast gebruikt; Het is dus van cruciaal belang om het gebied voor gebruik te desinfecteren. - Incubeer de kweekplaten bij 37 °C, 5% CO2 en 85% vochtigheid voor de duur van de experimenten. Incubeer de platen gedurende 24 uur voor de eerste analyse of 10 dagen voor de tweede analyseperiode, na de doorstraling.
4. Morfologie
- Omgekeerde lichtmicroscopie
- Zet de omgekeerde lichtmicroscoop aan en laat deze een paar minuten opwarmen. Zorg ervoor dat de microscoop goed is uitgelijnd en gekalibreerd.
- Bereid het monster voor op observatie op een microscoopglaasje of een gespecialiseerde celkweekschaal, afhankelijk van de experimentele opstelling. Kalibreer de microscoop voor optimale beeldvormingsomstandigheden.
- Pas de instellingen voor scherpstelling, helderheid en contrast naar wens aan. Selecteer de 20x objectieflens op de microscoop voor het observeren en registreren van celmorfologie.
- Plaats het monster op de microscooptafel en stel scherp op de cellen van belang met behulp van het oculair. Gebruik het oculair- of camerabeeld om de celmorfologie te observeren en vast te leggen. Besteed aandacht aan de vorm van de cel, de grootte en eventuele onderscheidende kenmerken.
- Bevestig de cameramodule aan de microscoop. Stel de camera in voor digitale beeldvorming. Zorg voor een goede verbinding en communicatie tussen de camera en de microscoop.
- Maak met behulp van de 20x objectieflens digitale foto's van de waargenomen cellen. Gebruik de cameraregelaars om de belichting, scherpstelling en andere relevante instellingen aan te passen.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de vastgelegde beelden van hoge kwaliteit zijn en een representatief beeld geven van de celmorfologie. - Start de beeldvormingssoftware op de computer. Leg het beeld vast en gebruik de analysetools in de software om de celmorfologie te analyseren.
- Meet celafmetingen, tel cellen of voer een relevante analyse uit op basis van de experimentele doelstellingen.
- Voeg een geschikte schaalbalk toe aan de afbeeldingen met behulp van de software. Gebruik de bekende vergroting van het microscoopobjectief om de schaal van de beelden nauwkeurig weer te geven.
5. Biochemische testen
- Celherstel
OPMERKING: De cellen moeten worden teruggewonnen uit de hydrogel in een eencellige suspensie voor verdere stroomafwaartse biochemische tests.- Bereid de enzymatische celhersteloplossing voor. Bereid in een steriele omgeving een werkoplossing door de enzymatische celterugwinningsoplossing te verdunnen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een verhouding van 1:20 (oplossing: PBS). Als het nodig is om cellen uit een bepaald aantal gels of putjes terug te winnen, bereken dan het totale benodigde volume op basis van 30 μL terugwinningsoplossing per gel.
- Voeg 30 μL van de werkoplossing toe aan elke gel of put met de cellen die moeten worden hersteld. Zorg voor een grondige en gelijkmatige verdeling van de terugwinningsoplossing door de plaat zachtjes te schudden of rond te draaien. Incubeer de plaat met de hersteloplossing volgens de aanbevolen incubatietijd. Deze informatie is meestal te vinden in het productgegevensblad of protocol dat door de leverancier wordt verstrekt.
- Verwijder na de incubatietijd de plaat voorzichtig uit de couveuse. Centrifugeer de platen bij 1409 x g gedurende 5 minuten (20 °C) om de cellen te pelleteren. Raadpleeg het productgegevensblad of protocol voor de aanbevolen centrifugatieomstandigheden. Zodra het centrifugeren is voltooid, gooit u het supernatant voorzichtig weg en moet u oppassen dat u de celpellet niet verstoort.
- Resuspendeer de gepelleteerde cellen voorzichtig in 220 μL steriele PBS. Zorg voor een grondige menging om een homogene eencellige suspensie te verkrijgen. De cellen zijn nu klaar voor biochemische tests stroomafwaarts. Volg de specifieke protocollen voor de beoogde tests, rekening houdend met de aard van de herstelde cellen en de vereisten van de experimentele opstelling.
- Cytotoxiciteitstest voor lactaatdehydrogenase (LDH)
- Verwijder voor elk putje voorzichtig 50 μL van het volledige kweekmedium, zodat de cellaag zo min mogelijk wordt verstoord.
- Voeg 50 μl cytotoxiciteitsreagens rechtstreeks toe aan elk putje met de resterende 50 μl kweekmedia. Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren om ervoor te zorgen dat het monster grondig met het reagens wordt gemengd.
- Bereid een positieve controle voor. Zet drievoudige putjes op met 5 μL 10x lysisoplossing per 50 μL positieve controlecellen die in de kit zitten.
- Incubeer de plaat op de aanbevolen temperatuur en duur. Door deze stap kan het cytotoxiciteitsreagens de cellen lyseren en LDH afgeven aan de kweekmedia.
- Voeg na de incubatietijd 50 μl van de stopoplossing rechtstreeks toe aan elk putje dat het cytotoxiciteitsreagens en het cellysaat bevat. Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren om ervoor te zorgen dat de reactie goed stopt.
NOTITIE: De stopoplossing stopt verdere afgifte van LDH en zorgt voor de stabiliteit van de kleurontwikkeling. - Stel de spectrofotometrische plaatlezer in volgens de instructies van de fabrikant. Noteer de absorptie van elk putje bij 490 nm. Deze golflengte is specifiek voor de colorimetrische detectie van het formazanproduct dat wordt gegenereerd door de LDH-reactie.
- Trek de achtergrondabsorptiemetingen af van zowel behandelingsgroepen als controleputjes. Verkrijg achtergrondmetingen van putjes die media en cytotoxiciteitsreagentia zonder cellen bevatten.
- Analyseer de gecorrigeerde absorptiewaarden voor elk monster om het cytotoxiciteitsniveau te bepalen. Hogere absorptiewaarden duiden op een verhoogde LDH-afgifte en bijgevolg op een hogere cytotoxiciteit.
- Zorg ervoor dat elke experimentele groep en controle uit vier herhalingen bestaat (stap 3.2.2) voor statistische nauwkeurigheid. Bereken en importeer de gemiddelde extinctie van elke groep en controleer in een geschikt statistisch programma.
- Vergelijk de resultaten tussen behandelingsgroepen en geschikte controles om de cytotoxische effecten nauwkeurig te beoordelen en alle absorptiemetingen, berekeningen en experimentele omstandigheden vast te leggen voor toekomstig gebruik.
- ATP-proliferatietest
- Meng in een steriele omgeving 50 μl van de teruggewonnen cellen met 50 μl van het ATP-reagens in elk putje.
NOTITIE: Pas het volume van cellen en reagentia aan op basis van het aantal putjes en het experimentele ontwerp. Zorg voor consistente verhoudingen voor nauwkeurige resultaten. - Plaats het bord op een shaker en schud krachtig in het donker gedurende 5 min. Deze stap zorgt voor een grondige vermenging van de cellen met het reagens. Na het schudden de plaat nog eens 25 minuten incuberen bij RT. Deze incubatietijd stelt het reagens in staat om de cellen te lyseren en een lichtgevend signaal te genereren dat evenredig is met de hoeveelheid aanwezige ATP.
- Stel de plaatlezer in volgens de instructies van de fabrikant voor luminescentiedetectie. Meet de luminescentie van elk putje dat het cellysaat en het ATP-reagens bevat. Zorg ervoor dat de plaatlezer is ingesteld om de luminescentie te meten met de juiste instellingen.
- Trek de achtergrondluminescentiemetingen af van zowel behandelingsgroepen als controleputten. Verkrijg achtergrondmetingen van putjes die alleen het ATP-reagens en PBS zonder cellen bevatten.
- Analyseer de gecorrigeerde luminescentiewaarden voor elk monster om ATP-niveaus te bepalen, die de celproliferatie of levensvatbaarheid weerspiegelen.
- Zorg ervoor dat elke experimentele groep en controle uit vier herhalingen bestaat (stap 3.2.2) voor statistische nauwkeurigheid. Bereken en importeer de gemiddelde luminescentie van elke groep en controleer in een geschikt statistisch programma.
- Vergelijk de resultaten tussen behandelingsgroepen en relevante controles om de proliferatie van ATP nauwkeurig te beoordelen. Noteer alle luminescentiemetingen, berekeningen en experimentele omstandigheden voor toekomstig gebruik.
OPMERKING: Volg voor alle biochemische analyses in kitvorm de handleiding of het protocol van de kit die door de fabrikant is verstrekt voor specifieke details, zoals aanbevolen incubatietijden, concentraties en eventuele aanvullende stappen of overwegingen. Houd u altijd aan de veiligheidsrichtlijnen van laboratoria bij het hanteren van chemicaliën en biologische materialen.
- Meng in een steriele omgeving 50 μl van de teruggewonnen cellen met 50 μl van het ATP-reagens in elk putje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de morfologie te beoordelen en de celdichtheid van de hydrogels visueel te inspecteren, werd inverse microscopie gebruikt (Figuur 2). De ADSC's behielden 24 uur na het zaaien en de PBM-blootstelling een afgeronde morfologie. De cellen waren verspreid over de gel als enkele cellen of in druifachtige trossen. De morfologie was onveranderd na 10 dagen in 3D-cultuur. Er werd geen definitief verschil in morfologie waargenomen tussen de experimentele groepen en de controlegroep of tussen de verschillende experimentele groepen.
Om de cytotoxische effecten van PBM-blootstelling en 3D-kweek met behulp van hydrogel te beoordelen, werd LDH-lekkage gemeten (Figuur 3). Er waren geen significante verschillen tussen de experimentele groepen en de controles na 24 uur of 10 dagen, wat aangeeft dat PBM-blootstelling en hydrogelkweek geen nadelig effect hadden op de cellen.
De cellulaire proliferatiesnelheid werd gemeten door het ATP-gehalte van ADSC's te meten (figuur 4). Blootstelling aan PBM resulteerde in verhoogde proliferatiepercentages in alle experimentele groepen in vergelijking met de controlegroep. 24 uur na PBM-blootstelling stimuleerde de golflengte van 525 nm de hoogste proliferatiesnelheden. Na 10 dagen vertoonde de golflengte van 825 nm echter superieure proliferatiesnelheden in vergelijking met de golflengte van 525 nm. Aan het einde van de 10-daagse kweekperiode vertoonde de groep van 825 nm, 10 J/cm2 de hoogste proliferatiesnelheid.
Figuur 1: Overzicht van het protocol. Samengevat protocol met de nadruk op de bereiding van de hydrogel in platen met 96 putjes, PBM-blootstelling en de meting van morfologie en biochemische assays 24 uur en 10 dagen na PBM-blootstelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: ADSC's worden na het zaaien zelf geaggregeerd. De cellen behielden een ronde tot ovale morfologie en werden in de hydrogel verdeeld als afzonderlijke cellen of aggregaten met een druifachtig clusteruiterlijk bij (A) 24 uur en (B) 10 dagen na het zaaien en PBM-blootstelling. Er werd geen definitieve verandering waargenomen na 10 dagen incubatie. Met behulp van de bedieningsorganen (1 en 4), respectievelijk 525 nm bij 5 J/cm, 2 (2) en 10 J/cm, 2 (5) of 825 nm bij 5 J/cm,2 (3) en 10 J/cm, 2 (6). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Cellulaire LDH-lekkage als meting van de cytotoxiciteit 24 uur en 10 dagen na PBM-blootstelling, met behulp van een diode van 525 nm en 825 nm (5 J/cm2 en 10 J/cm2) in de hydrogel. Er werd geen significante toename van de cytotoxiciteit waargenomen in vergelijking met de experimentele controlegroep. De positieve controle was representatief voor volledige celdood. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Cellulaire ATP als meting van proliferatie 24 uur en 10 dagen na PBM-blootstelling, met behulp van een diode van 525 nm en 825 nm (5 J/cm2 en 10 J/cm2) in de hydrogel. Blootstelling aan PBM stimuleerde verhoogde proliferatiesnelheden in alle experimentele groepen op beide tijdstippen en beide vloeiendheden. Significante verschillen (P < 0,001) worden aangeduid met ***. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Bestanddeel | Volume (μL) per putje |
| SLO-Dextran polymeer (30 mmol/L) | 0.7 |
| Cel suspensie | 2 |
| Buffer | 0.8 |
| Water | 5.5 |
| Kruisverlinker | 1 |
| Totaal volume | 10 |
Tabel 1: Volumes hydrogelreagens (10 μl).
| Laser Parameters | Groen (G) | Nabij-infrarood (NIR) |
| Licht | Diode Laser | Diode Laser |
| Golflengte (nm) | 525 | 825 |
| Uitgangsvermogen (mW) | 553 | 515 |
| Vermogensdichtheid (mW/cm2) | 57.48 | 53.53 |
Tabel 2: Laserparameters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ADSC's zijn een ideaal celtype om te gebruiken voor regeneratieve geneeskunde, omdat ze verschillende processen stimuleren om te helpen bij wondgenezing 3,4. Er zijn echter verschillende uitdagingen die moeten worden omzeild, bijvoorbeeld slechte overlevingskansen en ineffectieve implantatie van de cellen op eenverwondingsplaats9. Onsterfelijke cellen werden gebruikt als een in de handel verkrijgbare cellijn, omdat ze meer generaties kunnen worden gepasseerd in vergelijking met primaire cellen, ze hoeven niet te worden geoogst, zijn goed gekarakteriseerd en zijn homogene populaties die consistente resultaten garanderen31. Het doel van deze studie was om het augmentatieve potentieel van PBM op de proliferatie en cytotoxiciteit van ADSC's te bepalen, met behulp van 3D-celkweek. Het protocol van de fabrikant voor een hydrogel van 30 μL is aangepast naar een hydrogel van 10 μL om kosten te besparen32. Dit verminderde volume maakte de bereiding en het hanteren van de gel echter moeilijker.
Van ADSC's is aangetoond dat ze zichzelf aggregeren in een 3D-omgeving33. Evenzo vormden de cellen in deze studie celaggregaten met een druifachtig uiterlijk. Er werden echter ook enkellagige cellen geïdentificeerd. Celafstoting is een bekende eigenschap van sferoïden waarbij cellen loskomen van het hoofdsferoïde of aggregaatlichaam en vrijkomen in de kweekomgeving. Celafstoting kan het gevolg zijn van cellulaire proliferatie, waarbij levensvatbare cellen worden afgestoten tijdens mitose en migratie mogelijk maken34. Als alternatief kan vervelling het gevolg zijn van celdood en verlies van sferoïde of aggregaatvorm35, vooral bij zeer grote sferoïden als gevolg van een groeiende necrotische kern. De cellen namen een afgeronde morfologie aan in 3D-cultuur, vergeleken met een spoelvorm in 2D-culturen. In overeenstemming met de bevindingen van soortgelijke onderzoeken, zijn deze resultaten te wijten aan een gebrek aan aanhechtingsplaatsen of extracellulaire matrix voor de cellen om zich aan 6,9 te hechten. Bovendien vertoonden de cellen geen significante migratie in de gel, wat verder impliceert dat er hechtingsplaatsen nodigzijn 36. Het wordt aanbevolen om een adhesiepeptide of een ander extracellulair matrixeiwit toe te voegen om hechting, hechting en migratie te vergemakkelijken. Een beperking van de studie was het gebruik van inverse lichtmicroscopie om de 3D-morfologie van de ADSC's te observeren in plaats van Z-stacking. PBM-blootstelling en 3D-kweek hadden geen significant effect op de cytotoxiciteit van de ADSC's, zowel 24 uur als 10 dagen na blootstelling, wat aangeeft dat hydrogelcultuur en PBM veilig zijn en geen negatieve invloed hebben op de cellen 6,26. In 3D-celkweek zijn ADSC's in verband gebracht met langzamere proliferatiesnelheden in vergelijking met 2D-celkweek. Dit wordt ondersteund door de lage proliferatiepercentages van de normale controles in de huidige studie6. PBM (525 nm en 825 nm) verhoogde de proliferatiesnelheid van ADSC's in 3D-cultuur aanzienlijk. Aanvankelijk veroorzaakte het groene licht (525 nm) bij zowel 5 J/cm2 als 10 J/cm2 de hoogste proliferatiesnelheden in vergelijking met het nabij-infrarood licht (825 nm). Na 10 dagen heeft het nabij-infrarood licht (825 nm) echter de hoogste proliferatiesnelheden bij zowel 5 J/cm2 als 10 J/cm2 vloeiendheden. Evenzo is aangetoond dat PBM (525 nm en 825 nm) de proliferatiesnelheid in 2D-culturenverhoogt37. Het wordt aanbevolen om ook een golflengtecombinatiegroep op te nemen, aangezien andere studies een synergetisch effect van groen en nabij-infrarood licht hebben gemeld.
Kortom, de gebruikte hydrogel is een synthetische hydrogel met een enorm aanpassingsvermogen om aan de behoeften van verschillende toepassingen te voldoen. De huidige studie heeft aangetoond dat de gel geen cytotoxisch effect heeft op cellen in kweek gedurende een periode van 10 dagen. Bovendien toonde PBM een positief vergrotingspotentieel aan door de proliferatiesnelheid van ADSC's aanzienlijk te verhogen, ondanks het feit dat het zich in een 3D-kweekomgeving bevond. Deze hydrogel kan dus dienen als een mogelijke drager van biomateriaal voor transplantatie in wonden. Toekomstig onderzoek moet gericht zijn op het testen van het potentiële vermogen van de gel om te helpen bij wondgenezing met behulp van dierstudies. Als de resultaten van de dierproeven gunstig zijn, is het de bedoeling dat van de patiënt afgeleide ADSC's kunnen worden geoogst, ingekapseld en aangevuld met PBM voorafgaand aan transplantatie in wonden om te helpen bij wondgenezing in klinische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door de National Research Foundation of South Africa Thuthuka Instrument, subsidienummer TTK2205035996; het Department of Science and Innovation (DSI) financierde African Laser Centre (ALC), subsidienummer HLHA23X taak ALC-R007; de Universitaire Onderzoeksraad, subsidienummer 2022URC00513; het South African Research Chairs Initiative van het Department of Science and Technology (DST-NRF/SARChI), subsidienummer 98337. De financiers speelden geen rol bij het ontwerp van het onderzoek, het verzamelen, analyseren, interpreteren van de gegevens of het schrijven van het manuscript. De auteurs bedanken de Universiteit van Johannesburg (UJ) en het Laser Research Centre (LRC) voor hun gebruik van de faciliteiten en middelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 525 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | EN 60825-1:2007 | |
| 825 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | SN 101080908ADR-1800 | |
| 96 Well Strip Plates | Sigma-Aldrich | BR782301 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | ATP reagent, Proliferation assay Kit |
| Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430659 | cryovial |
| CryoSOfree | Sigma-Aldrich | C9249 | Cell freezing media |
| CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | Cytotoxicity reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Media | Sigma-Aldrich | D5796 | Basal medium (39 mL/44 mL) |
| FieldMate Laser Power Meter | Coherent | 1098297 | |
| Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate | Sigma-Aldrich | CLS3370 | |
| Foetal bovine serum | Biochrom | S0615 | Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%) |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | Rinse solution |
| Heracell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51026280 | |
| Heraeus Labofuge 400 | Thermo Scientific | 75008371 | Plate spinner for 96 well plates |
| Heraeus Megafuge 16R centrifuge | ThermoFisher | 75004270 | |
| Immortalized ADSCs | ATCC | ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000 | Passage 37 |
| Invitrogen Countess 3 | Invitrogen | AMQAX2000 | Automated cell counter for Trypan Blue |
| Julabo TW20 waterbath | Sigma-Aldrich | Z615501 | Waterbath used to warm media to 37 °C |
| Olympus CellSens Entry | Olympus | Version 3.2 (23706) | Imaging software: digital image acquisition |
| Olympus CKX41 | Olympus | SN9B02019 | Inverted light microscope |
| Olympus SC30 camera | Olympus | SN57000530 | Camera attached to inverted light microscope |
| Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates | Sigma-Aldrich | CLS3912 | Opaque well used for ATP luminescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| SigmaPlot 12.0 | Systat Software Incorporated | ||
| TrueGel3D – True3 | Sigma-Aldrich | TRUE3-1KT | 10 µL |
| TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution | Sigma-Aldrich | TRUEENZ | 01:20 |
| Trypan Blue Stain | Thermo Fisher - Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Gibco | 12563029 | Cell detachment solution |
| Victor Nivo Plate Reader | Perkin Elmer | HH3522019094 | Spectrophotometric plate reader |
References
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Yuan, X., et al. Strategies for improving adipose-derived stem cells for tissue regeneration. Burns Trauma. 10, (2022).
- Nilforoushzadeh, M. A., et al. Mesenchymal stem cell spheroids embedded in an injectable thermosensitive hydrogel: An in situ drug formation platform for accelerated wound healing. ACS Biomater Sci Eng. 6 (9), 5096-5109 (2020).
- Yang, M., et al. Thermosensitive injectable chitosan/collagen/β-glycerophosphate composite hydrogels for enhancing wound healing by encapsulating mesenchymal stem cell spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21015-21023 (2020).
- Chimenti, I., et al. Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice. Circ Res. 106 (5), 971-980 (2010).
- Hassan, W., Dong, Y., Wang, W. Encapsulation and 3d culture of human adipose-derived stem cells in an in-situ crosslinked hybrid hydrogel composed of peg-based hyperbranched copolymer and hyaluronic acid. Stem Cell Res Ther. 4 (2), 32 (2013).
- Wu, K. H., Mo, X. M., Han, Z. C., Zhou, B. Stem cell engraftment and survival in the ischemic heart. The Ann Thorac Surg. 92 (5), 1917-1925 (2011).
- Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: General approaches and a review of recent developments. J R Soc Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
- Koivunotko, E., et al. Angiogenic potential of human adipose-derived mesenchymal stromal cells in nanofibrillated cellulose hydrogel. Biomedicines. 10 (10), 2584 (2022).
- Dong, Y., et al. Injectable and tunable gelatin hydrogels enhance stem cell retention and improve cutaneous wound healing. Adv Funct Mater. 27 (24), 1606619 (2017).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3d cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
- Sung, T. -C., et al. 3D culturing of human adipose-derived stem cells enhances their pluripotency and differentiation abilities. J Mater Sci Technol. 63, 9-17 (2021).
- Garg, R. K., et al. Capillary force seeding of hydrogels for adipose-derived stem cell delivery in wounds. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1079-1089 (2014).
- Kim, Y. M., et al. Adipose-derived stem cell-containing hyaluronic acid/alginate hydrogel improves vocal fold wound healing. Laryngoscope. 124 (3), E64-E72 (2014).
- Dong, Y., et al. Conformable hyaluronic acid hydrogel delivers adipose-derived stem cells and promotes regeneration of burn injury. Acta Biomater. 108, 56-66 (2020).
- Truegel3d hydrogel for 3d cell culture. Merck. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/ZA/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/3d-cell-culture/truegel3d (2024).
- Braccini, S., Tacchini, C., Chiellini, F., Puppi, D. Polymeric hydrogels for in vitro 3d ovarian cancer modeling. Int J Mol Sci. 23 (6), 3265 (2022).
- Mashinchian, O., et al. In vivo transcriptomic profiling using cell encapsulation identifies effector pathways of systemic aging. eLife. 11, e57393 (2022).
- Matsushige, C., Xu, X., Miyagi, M., Zuo, Y. Y., Yamazaki, Y. Rgd-modified dextran hydrogel promotes follicle growth in three-dimensional ovarian tissue culture in mice. Theriogenology. 183, 120-131 (2022).
- Marx, V. How some labs put more bio into biomaterials. Nat Methods. 16 (5), 365-368 (2019).
- Marques, M. M.
- Hamblin, M. R. Mechanisms and mitochondrial redox signaling in photobiomodulation. Photochem Photobiol. 94 (2), 199-212 (2018).
- Chen, J., et al. Low-level controllable blue LEDs irradiation enhances human dental pulp stem cells osteogenic differentiation via transient receptor potential vanilloid 1. J Photochem Photobiol B. 233, 112472 (2022).
- Chang, S. -Y., Carpena, N. T., Kang, B. J., Lee, M. Y. Effects of photobiomodulation on stem cells important for regenerative medicine. Med Lasers. 9 (2), 134-141 (2020).
- Bikmulina, P. Y., et al. Beyond 2d: Effects of photobiomodulation in 3d tissue-like systems. J Biomed Opt. 25 (4), 048001 (2020).
- Ahmadi, H., et al. Transplantation of photobiomodulation-preconditioned diabetic stem cells accelerates ischemic wound healing in diabetic rats. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 494 (2020).
- Mao, A. S., Mooney, D. J. Regenerative medicine: Current therapies and future directions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (47), 14452-14459 (2015).
- De Andrade, A. L. M., et al. Effect of photobiomodulation on the behaviour of mesenchymal stem cells in three-dimensional cultures. Lasers Med Sci. 38 (1), 221 (2023).
- Diniz, I. M., et al. Photobiomodulation of mesenchymal stem cells encapsulated in an injectable rhbmp4-loaded hydrogel directs hard tissue bioengineering. J Cell Physiol. 233 (6), 4907-4918 (2018).
- Carter, M., Shieh, J. C. Guide to Research Techniques in Neuroscience. , Elsevier, Academic Press. (2015).
- Lutolf, M. P., et al. Synthetic matrix metalloproteinase-sensitive hydrogels for the conduction of tissue regeneration: Engineering cell-invasion characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5413-5418 (2003).
- Robledo, F., et al. Spheroids derived from the stromal vascular fraction of adipose tissue self-organize in complex adipose organoids and secrete leptin. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 70 (2023).
- Landry, J., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Shedding of mitotic cells from the surface of multicell spheroids during growth. J Cell Physiol. 106 (1), 23-32 (1981).
- Bogacheva, M. S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into definitive endoderm cells in various flexible three-dimensional cell culture systems: Possibilities and limitations. Front Cell Dev Biol. 9, 726499 (2021).
- Chen, X., Thibeault, S. L. Biocompatibility of a synthetic extracellular matrix on immortalized vocal fold fibroblasts in 3-d culture. Acta Biomater. 6 (8), 2940-2948 (2010).
- Crous, A., Van Rensburg, M. J., Abrahamse, H. Single and consecutive application of near-infrared and green irradiation modulates adipose derived stem cell proliferation and affect differentiation factors. Biochimie. 196, 225-233 (2022).
