Summary
여기에서는 지방 유래 줄기 세포(ADSC) 배양을 위한 3차원(3D) 세포 배양 프레임워크로 하이드로겔을 사용하는 방법을 시연하고 3D 배양 환경 내에서 ADSC의 증식을 향상시키기 위해 광생물 조절(PBM)을 도입하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
줄기세포와 유사한 다능성 중간엽 특성을 가진 지방 유래 줄기세포(ADSC)는 다양한 세포 분화 능력과 이동, 증식 및 염증 완화 능력으로 인해 재생 의학에 자주 사용됩니다. 그러나 ADSC는 주로 불리한 염증 조건으로 인해 생존 및 상처 내 생착에 어려움을 겪는 경우가 많습니다. 이 문제를 해결하기 위해 하이드로겔은 상처에서 ADSC 생존력을 유지하고 상처 치유 과정을 촉진하기 위해 개발되었습니다. 여기서는 3D 세포 배양 프레임워크 내에서 ADSC 증식 및 세포 독성에 대한 광생물 조절(PBM)의 시너지 효과를 평가하는 것을 목표로 했습니다. 불멸화된 ADSC를 2.5 x 103 세포 밀도의 10μL 하이드로겔에 파종하고 5J/cm2 및 10J/cm2의 유창성으로 525nm 및 825nm 다이오드를 사용하여 조사했습니다. 형태학적 변화, 세포독성 및 증식은 PBM 노출 후 24시간 및 10일에 평가되었습니다. ADSC는 둥근 형태를 나타내며 개별 세포 또는 스페로이드 응집체로 겔 전체에 분산되어 있습니다. 중요한 것은 PBM과 3D 배양 프레임워크 모두 세포에 대한 세포독성 효과가 없는 반면, PBM은 ADSC의 증식률을 크게 향상시켰다는 것입니다. 결론적으로, 이 연구는 ADSC 배양에 적합한 3D 환경으로 하이드로겔을 사용하는 것을 보여주고, 특히 3D 세포 배양과 관련된 느린 증식 속도를 해결하는 중요한 증식 전략으로 PBM을 소개합니다.
Introduction
ADSC는 자가 재생 및 여러 세포 계통으로 분화할 수 있는 능력을 가진 중간엽 다분화능 전구 세포입니다. 이들 세포는 지방 흡인 절차 중 지방 조직의 기질 혈관 분획(SVF)에서 채취할 수 있다1. ADSC는 줄기세포가 풍부하고, 채취가 최소한으로 침습적이며, 쉽게 접근할 수 있고, 특성이 우수하기 때문에 재생 의학에 사용하기에 이상적인 줄기세포 유형으로 부상하고있습니다 2. 줄기세포 치료는 세포 이동, 증식, 신생혈관 형성을 자극하고 상처 내 염증을 감소시킴으로써 상처 치유를 위한 가능한 방법을 제공한다 3,4. ADSC의 재생 능력의 약 80%는 분비체를 통한 파라크린 신호전달에 기인한다5. 이전에는, 줄기세포 또는 성장인자를 손상된 조직에 직접 국소적으로 주입하는 것이 충분한 생체 내 복구 메커니즘을 불법화할 수 있다고 제안되었다 6,7,8. 그러나 이 접근법은 염증 환경으로 인해 생존율이 낮고 손상된 조직 내에서 줄기세포 생착이 감소하는 등 몇 가지 문제에 직면했다 9. 더욱이, 인용된 이유 중 하나는 이식된 세포의 생존과 기능을 지원하는 세포외 기질의 부족이었다10. 이러한 문제를 극복하기 위해 줄기 세포의 생존력과 기능을 지원하는 생체 재료 운반체 개발에 중점을 두고 있습니다.
3차원(3D) 세포 배양은 in vitro에서 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호작용을 향상시켜 in vivo 환경과 더 유사한 환경을 제공한다11. 하이드로겔은 줄기 세포 배양을 위한 3D 환경을 제공하는 생체 재료 운반체의 한 종류로 광범위하게 연구되어 왔습니다. 이들 구조는 물과 가교결합된 중합체(12)로 이루어진다. 하이드로겔에 ADSC를 캡슐화하면 세포의 생존력을 유지하면서 배양 중 세포에 대한 세포독성 효과가 거의 없다6. 3D로 배양된 줄기세포는 줄기세포의 유지율이 향상되고 분화 능력이 향상됨을 입증한다13. 유사하게, 하이드로겔 시드 ADSC는 동물 모델에서 생존력 증가와 상처 봉합 가속화를 보여주었습니다14. 또한, 하이드로겔 캡슐화는 상처에서 ADSC의 생착 및 유지를 크게 증가시킨다15,16. TrueGel3D는 폴리비닐 알코올 또는 덱스트란과 같은 폴리머로 만들어지며, 사이클로덱스트린 또는 폴리에틸렌 글리콜17과 같은 가교제에 의해 응고됩니다. 겔은 세포외 기질(18)을 효과적으로 모방하면서 겔을 환자에게 이식하는 동안 실험을 방해하거나 면역 반응을 유발할 수 있는 동물성 제품을 함유하지 않는 합성 하이드로겔이다. 젤은 구성과 개별 구성 요소를 변경하여 완전히 사용자 정의할 수 있습니다. 그것은 상이한 줄기세포를 수용할 수 있고, 겔(19)의 강성을 조절함으로써 여러 세포 유형의 분화를 지원할 수 있다. 부착 부위는 펩티드20의 첨가를 통해 생성될 수 있다. 겔은 메탈로프로테아제의 분비에 의해 분해될 수 있으며, 세포 이동을 허용한다21. 마지막으로, 명확하고 이미징 기술을 허용합니다.
PBM은 세포 내 발색단을 자극하는 데 사용되는 최소 침습적이고 쉽게 수행할 수 있는 저수준 레이저 치료법입니다. 서로 다른 파장은 세포에 서로 다른 영향을 미친다22. 적색에서 근적외선 범위의 빛은 전자 수송 사슬(23)을 통한 플럭스를 강화하여 증가된 아데노신 삼인산(ATP) 및 활성 산소종(ROS) 생산을 자극합니다. 청색 및 녹색 범위의 빛은 광 개폐 이온 채널을 자극하여 칼슘 및 마그네슘과 같은 양이온이 세포로 비특이적으로 유입되도록 하며, 이는 분화를 향상시키는 것으로 알려져 있습니다24. 최종 효과는 이동, 증식, 분화와 같은 다운스트림 세포 과정을 유발하는 인자의 전사를 자극하는 2차 메신저의 생성이다25. PBM은 세포를 불리한 환경, 예를 들어, 손상된 조직(26)에 이식하기 전에 증식 또는 분화하기 위해 세포를 전처리하는데 사용될 수 있다. ADSC의 이식 전 및 이식 후 PBM(630nm 및 810nm) 노출은 당뇨병 쥐 모델27에서 이들 세포의 생체 내 생존력과 기능을 유의하게 향상시켰다. 재생의학은 조직의 효과적인 복구를 위해 적절한 수의 세포를 필요로 한다28. 3D 세포 배양에서 ADSC는 2차원 세포 배양에 비해 느린 증식 속도와 관련이 있습니다6. 그러나 PBM은 생존력, 증식, 이동 및 분화를 향상시켜 ADSC의 3D 세포 배양 공정을 강화하는 데 사용할 수 있습니다29,30.
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Protocol
알림: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 시약 및 소프트웨어와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 프로토콜은 그림 1에 그래픽으로 요약되어 있습니다.
1. 2차원(2D) 세포 배양
참고: 불멸의 ADSC(1 x106 세포)는 -195.8°C에서 1mL의 세포 동결 배지가 들어 있는 동결 보존 바이알에 액체 질소로 보관됩니다.
- 2D 세포 회수 배지 및 2D 배양 플라스크 준비
- 39mL의 기초 배지를 50mL 원심분리 튜브에 옮깁니다.
- 20% 소 태아 혈청(FBS, 10mL)과 항생제(1mL)(0.5mL 페니실린-스트렙토마이신 및 0.5mL 암포테리신 B)로 기초 배지를 농축합니다.
- 6mL의 세포 회수 배지를 플라스크에 옮겨 T75 플라스크를 사전 컨디셔닝하고 37°C, 5% CO2 및 85% 습도에서 45분 동안 배양합니다(시간 절약을 위해 세포 회수 단계를 수행하는 동안 수행할 수 있음).
알림: 사용하기 전에 전체 매체를 37°C로 데우고 최대 4주일 동안 1°C에서 보관하십시오.
- 2D 세포 회수
- 액체 질소 저장 탱크에서 극저온을 제거하고 바이알이 완전히 해동될 때까지 37°C의 수조에서 바이알을 빠르게 해동합니다.
- 1006 x g 에서 원심분리기를 사용하여 5분(20°C) 동안 극저온 분리기를 회전시킨 후 상층액을 제거합니다.
- 1mL의 예열된 세포 회수 배지를 사용하여 펠릿화된 세포를 재현탁시킵니다.
- 사전 조절된 플라스크(최종 부피 7mL)에 부유 세포를 고르게 분포시키고 37°C, 5% CO2 및 85% 습도에서 배양합니다.
- 24시간 후 세포 회수 배지를 폐기하고 교체하십시오.
- 플라스크가 세포와 합류할 때까지 2-3일마다 배양 배지를 교체합니다.
- 단일 세포 현탁액에서 2D 배양 플라스크 수확 및 세포 수
- 인큐베이터에서 2D 배양 플라스크를 꺼내고 배양 배지를 적절한 폐기물 용기에 버립니다.
- 10mL의 헹굼 용액을 플라스크에 옮겨 세포를 헹구고 노폐물과 축적된 단백질을 제거합니다. 그런 다음 헹굼 용액을 버리십시오.
- 배양 플라스크에 6mL의 분리 용액을 추가하여 세포를 분리합니다. 플라스크를 37°C, 5% CO2 및 85% 습도에서 2분 동안 배양합니다.
알림: 현미경으로 플라스크를 관찰하여 모든 셀이 분리되었는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 플라스크를 가볍게 두드리고 1분 더 배양합니다. - 모든 세포가 분리되면 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브에 옮기고 세포 회수 배지 1mL(20% FBS 포함)를 튜브에 추가합니다. 이것은 박리 용액의 효과를 중화시킵니다.
- 1711 x g(20°C)에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다.
- 상층액을 제거하고 세포를 1mL의 완전한 배지에 재현탁시킵니다.
- 셀 현탁액 10μL를 제거하고 500μL 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 10μL의 트리판 블루와 1:1 비율로 혼합합니다.
- 트리판 블루 세포 용액 혼합물 10μL를 세포 계수 챔버에 중복으로 넣습니다.
- 세포 계수 챔버를 자동 세포 카운터에 놓습니다. 세포 계수기는 mL당 총 세포 수와 생존 가능한 세포 및 죽은 세포의 수를 표시합니다. 평균 생존 가능한 세포 수와 3D 하이드로겔에 삽입하는 데 필요한 생존 세포 수를 계산합니다(단계 2.2.6).
2. 3D 세포 배양
- 3D 완전 배양 배지 준비
- 44mL의 기초 배지를 50mL 원심분리 튜브에 옮깁니다.
- 10% FBS(5mL)와 항생제(1mL)(0.5mL 페니실린-스트렙토마이신 및 0.5mL 암포테리신 B)로 배지를 농축합니다.
알림: 사용하기 전에 전체 미디어를 37°C로 데우고 최대 4°C에서 최대 1주일 동안 보관하십시오.
- 하이드로겔 준비
- 재료를 농축하기 위해 고속 덱스트란 바이알을 원심분리(20°C에서 30초 동안 1000 x g )하여 고속 덱스트란을 준비합니다. 고속 덱스트란 바이알에 물 175μL를 첨가하여 최종 농도 30mmol/L 반응기를 얻습니다.
- 재료가 완전히 용해될 때까지 고속 덱스트란 용액이 포함된 튜브(30초 동안 중간 속도)를 소용돌이칩니다. 용해된 물질을 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 튜브를 원심분리하고 잠시 소용돌이친 다음 나중에 사용하는 동안 얼음 위에 보관하십시오.
- 가교제(20°C에서 30초 동안 1000 x g )를 원심분리하여 재료를 농축합니다. 가교제 바이알에 물 188μL를 첨가하여 최종 농도 20mmol/L의 티올기를 얻습니다.
- 모든 재료가 용해될 때까지 가교제 용액이 포함된 튜브(30초 동안 중간 속도)를 소용돌이칩니다. 용해된 가교제를 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다. 튜브를 원심분리하고 잠시 와류를 발생시킨 다음 나중에 사용하는 동안 RT에 보관하십시오.
- 비용 절감을 위해 하이드로겔 프로토콜을 30μL에서 10μL로 조정합니다(자세한 내용은 표 1 참조).
- 10μL 하이드로겔당 2.5 x 103 세포의 파종 밀도를 달성하기 위해 세포 현탁액을 준비합니다.
- 표 1에 따라 구성 요소를 결합하여 마스터 믹스를 만듭니다. 마스터 혼합물 9μL를 96웰 스트립 플레이트의 웰로 옮깁니다.
- 마스터 믹스를 옮긴 후 3분 후에 분해성 가교제 1μL를 첨가하여 겔을 응고시킵니다.
- 하이드로겔을 170μL의 사전 예열된 완전 배양 배지로 덮습니다. 1 시간 동안 배양합니다. 1시간 후 배양 배지를 교체합니다.
참고: 하이드로겔 포매 세포는 3D 배양 시스템 내에서 추가 실험 또는 분석을 수행할 준비가 되어 있습니다. 다운스트림 애플리케이션에 필요한 추가 프로토콜을 따릅니다.
3. 광생물조절 노출
- 레이저 설정
- 녹색(525nm) 또는 근적외선(825nm) 파장에 대해 다이오드 레이저 시스템을 설정합니다. 레이저를 켜고 권장 시간 동안 예열하십시오.
- 레이저가 정상 상태에 도달하도록 하여 레이저의 전력 출력을 안정화합니다. 이를 통해 일관되고 정확한 조사가 보장됩니다.
- 레이저 파워 미터를 사용하여 레이저의 출력을 측정합니다. 각 파장에 대한 전력 값을 기록합니다.
- 방정식 1(레이저 조사 시간)을 사용하여 레이저 조사 시간을 계산합니다. 표 2 의 값을 수식 1에 대입하여 각 유창성에 대한 적절한 조사 시간을 결정합니다. 수학식 1에서 "r"은 레이저의 조사 영역의 반경을 나타낸다.
방정식 1 - 플루언시(5 J/cm² 또는 10 J/cm²) 및 레이저 출력 출력을 포함하여 계산에 필요한 특정 매개변수는 표 2 를 참조하십시오.
- 3D 세포 배양 조사
- 전체 매체를 교체한 후(단계 2.2.9) 하이드로겔 내장 셀이 포함된 96웰 플레이트를 다이오드 레이저 시스템 아래에 놓습니다. 선택한 파장(녹색 또는 근적외선)에서 선택한 유창성(5J/cm² 또는 10J/cm²)에 대해 계산된 레이저 조사 시간을 하이드로겔에 조사합니다. 따라서 배양액은 1회 투여만 받게 됩니다.
- 각 실험 그룹에 PBM 노출 없이 하이드로겔에 내장된 ADSC로 구성된 대조군(n = 4)이 수반되는지 확인합니다.
알림: 항상 작업 중인 빛의 파장에 적합한 보안경을 착용하십시오. 레이저는 안전 캐비닛 외부에서 사용됩니다. 따라서 사용하기 전에 해당 부위를 소독하는 것이 매우 중요합니다. - 실험 기간 동안 37°C, 5%CO2 및 85% 습도에서 배양 플레이트를 배양합니다. 첫 번째 분석의 경우 24시간 동안 플레이트를 배양하고 방사선 조사 후 두 번째 분석 기간의 경우 10일 동안 배양합니다.
4. 형태학
- 도립 광학 현미경
- 도립 광학 현미경을 켜고 몇 분 동안 예열합니다. 현미경이 올바르게 정렬되고 보정되었는지 확인하십시오.
- 실험 설정에 따라 현미경 슬라이드 또는 특수 세포 배양 접시에서 관찰할 샘플을 준비합니다. 최적의 이미징 조건을 위해 현미경을 보정합니다.
- 필요에 따라 초점, 밝기 및 대비 설정을 조정합니다. 세포 형태를 관찰하고 기록하기 위해 현미경에서 20x 대물 렌즈를 선택하십시오.
- 샘플을 현미경 스테이지에 놓고 접안렌즈를 사용하여 관심 세포에 초점을 맞춥니다. 접안렌즈 또는 카메라 사용 view, 세포 형태를 관찰하고 기록합니다. 세포 모양, 크기 및 독특한 특징에 주의하십시오.
- 카메라 모듈을 현미경에 부착합니다. 디지털 이미징을 위해 카메라를 설정합니다. 카메라와 현미경 간의 적절한 연결 및 통신을 확인하십시오.
- 20x 대물 렌즈를 사용하여 관찰된 세포의 디지털 사진을 캡처합니다. 카메라 컨트롤을 사용하여 노출, 초점 및 기타 관련 설정을 조정합니다.
알림: 캡처된 이미지가 고품질이고 세포 형태에 대한 대표적인 보기를 제공하는지 확인하십시오. - 컴퓨터에서 이미징 소프트웨어를 실행합니다. 이미지를 캡처하고 소프트웨어 내의 분석 도구를 사용하여 세포 형태를 분석합니다.
- 셀 치수를 측정하거나, 셀 수를 계산하거나, 실험 목표에 따라 관련 분석을 수행합니다.
- 소프트웨어를 사용하여 영상에 적절한 스케일 막대를 추가합니다. 현미경 대물렌즈의 알려진 배율을 사용하여 이미지의 배율을 정확하게 표현할 수 있습니다.
5. 생화학 분석
- 세포 회수
참고: 세포는 추가 다운스트림 생화학 분석을 위해 단일 세포 현탁액의 하이드로겔에서 회수해야 합니다.- 효소 세포 회수 용액을 준비합니다. 멸균 환경에서 효소 세포 회수 용액을 인산염 완충 식염수(PBS)로 1:20의 비율로 희석하여 작업 용액을 준비합니다(용액: PBS). 특정 수의 겔 또는 웰에서 세포를 회수해야 하는 경우 겔당 30μL의 회수 용액을 기준으로 필요한 총 부피를 계산합니다.
- 30μL의 작업 용액을 각 겔 또는 회수가 필요한 세포가 들어 있는 웰에 추가합니다. 플레이트를 부드럽게 흔들거나 소용돌이쳐 회수 용액을 철저하고 고르게 분배하십시오. 권장 배양 시간에 따라 회수 용액으로 플레이트를 배양합니다. 이 정보는 일반적으로 공급업체가 제공한 제품 데이터시트 또는 프로토콜에서 찾을 수 있습니다.
- 배양 기간이 지나면 인큐베이터에서 플레이트를 조심스럽게 꺼냅니다. 플레이트를 1409 x g 에서 5분(20°C) 동안 원심분리하여 세포를 펠트합니다. 권장 원심분리 조건에 대해서는 제품 데이터시트 또는 프로토콜을 참조하십시오. 원심분리가 완료되면 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 상층액을 조심스럽게 버립니다.
- 펠릿 세포를 220μL의 멸균 PBS에 부드럽게 재현탁시킵니다. 균일한 단일 셀 현탁액을 달성하기 위해 철저한 혼합을 보장합니다. 이제 세포는 다운스트림 생화학 분석을 위한 준비가 되었습니다. 회수된 세포의 특성과 실험 설정의 요구 사항을 고려하여 의도한 분석에 대한 특정 프로토콜을 따르십시오.
- 젖산 탈수소효소(LDH) 세포독성 분석
- 각 웰에 대해 50μL의 전체 배양 배지를 조심스럽게 제거하여 세포층의 교란을 최소화합니다.
- 나머지 50μL의 배양 배지가 들어 있는 각 웰에 50μL의 세포 독성 시약을 직접 추가합니다. 샘플과 시약이 완전히 혼합되도록 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.
- 양성 대조군을 준비합니다. 키트에 포함된 positive control cell 50μL당 5μL의 10x 용해 용액으로 삼중 웰을 설정합니다.
- 권장 온도와 지속 시간으로 플레이트를 배양합니다. 이 단계를 통해 세포 독성 시약이 세포를 용해하고 LDH를 배양 배지로 방출할 수 있습니다.
- 배양 기간 후 50μL의 정지 용액을 세포 독성 시약 및 세포 용해물이 포함된 각 웰에 직접 첨가합니다. 반응이 적절하게 멈출 수 있도록 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.
알림: 정지 용액은 추가 LDH 방출을 중지하고 색상 개발의 안정성을 보장합니다. - 제조업체의 지침에 따라 분광 광도계 플레이트 리더를 설정합니다. 490nm에서 각 웰의 흡광도를 기록합니다. 이 파장은 LDH 반응에 의해 생성된 포르마잔 생성물의 비색 검출에 특이적입니다.
- 두 처리 그룹과 대조군 모두에서 배경 흡광도 판독값을 뺍니다. 세포가 없는 배지 및 세포 독성 시약이 포함된 웰에서 배경 판독값을 얻습니다.
- 각 샘플에 대해 보정된 흡광도 값을 분석하여 세포 독성 수준을 결정합니다. 흡광도 값이 높을수록 LDH 방출이 증가하여 결과적으로 세포 독성이 높아짐을 나타냅니다.
- 통계적 정확성을 위해 각 실험군과 대조군이 4회 반복(3.2.2단계)으로 구성되었는지 확인합니다. 각 그룹 및 대조군의 평균 흡광도를 계산하여 적절한 통계 프로그램으로 가져옵니다.
- 치료군과 적절한 대조군 간의 결과를 비교하여 세포독성 효과를 정확하게 평가하고 향후 참조를 위해 모든 흡광도 판독값, 계산 및 실험 조건을 기록합니다.
- ATP 증식 분석
- 멸균 환경에서 회수된 세포 50μL와 ATP 시약 50μL를 각 웰에 혼합합니다.
NOTE: well의 수와 실험 설계에 따라 세포와 시약의 부피를 조정합니다. 정확한 결과를 위해 일관된 비율을 유지합니다. - 접시를 셰이커에 놓고 어둠 속에서 5분 동안 세게 흔듭니다. 이 단계는 세포와 시약의 철저한 혼합을 보장합니다. 흔든 후 상온에서 추가로 25분 동안 플레이트를 배양합니다. 이 배양 기간을 통해 시약은 세포를 용해하고 존재하는 ATP의 양에 비례하는 발광 신호를 생성할 수 있습니다.
- 발광 감지에 대한 제조업체의 지침에 따라 플레이트 리더를 설정합니다. 세포 용해물과 ATP 시약을 포함하는 각 웰에서 발광을 측정합니다. 플레이트 리더가 적절한 설정으로 발광을 측정하도록 설정되어 있는지 확인하십시오.
- 처리 그룹과 대조군 모두에서 배경 발광 판독값을 뺍니다. ATP 시약과 세포가 없는 PBS만 포함된 웰에서 배경 판독값을 얻습니다.
- 각 샘플에 대해 보정된 발광 값을 분석하여 세포 증식 또는 생존율을 반영하는 ATP 수준을 결정합니다.
- 통계적 정확성을 위해 각 실험군과 대조군이 4회 반복(3.2.2단계)으로 구성되었는지 확인합니다. 각 그룹 및 대조군의 평균 발광을 계산하고 적절한 통계 프로그램으로 가져옵니다.
- ATP 증식을 정확하게 평가하기 위해 치료군과 관련 대조군 간의 결과를 비교합니다. 나중에 참조할 수 있도록 모든 발광 판독값, 계산 및 실험 조건을 기록합니다.
알림: 키트 형태의 모든 생화학 분석의 경우 권장 배양 시간, 농도 및 추가 단계 또는 고려 사항과 같은 특정 세부 정보는 제조업체에서 제공한 키트 설명서 또는 프로토콜을 따르십시오. 화학 물질 및 생물학적 물질을 취급할 때는 항상 실험실 안전 지침을 준수하십시오.
- 멸균 환경에서 회수된 세포 50μL와 ATP 시약 50μL를 각 웰에 혼합합니다.
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Representative Results
형태를 평가하고 하이드로겔의 세포 밀도를 육안으로 검사하기 위해 역 현미경을 사용했습니다(그림 2). ADSC는 파종 및 PBM 노출 후 24시간 동안 둥근 형태를 유지했습니다. 세포는 단일 세포 또는 포도 같은 클러스터로 겔 전체에 흩어져 있었습니다. 형태는 3D 배양에서 10일 후에도 변하지 않았습니다. 실험군과 대조군 사이 또는 다른 실험군 사이에 형태학의 결정적인 차이는 발견되지 않았다.
하이드로겔을 사용한 PBM 노출 및 3D 배양의 세포독성 효과를 평가하기 위해 LDH 누출을 측정했습니다(그림 3). 24시간 또는 10일째에 실험군과 대조군 사이에는 유의한 차이가 없었으며, 이는 PBM 노출과 하이드로겔 배양이 세포에 해로운 영향을 미치지 않았음을 나타냅니다.
세포 증식 속도는 ADSC의 ATP 함량을 측정하여 측정되었습니다(그림 4). PBM 노출은 대조군에 비해 모든 실험군에서 증식률을 증가시켰습니다. PBM 노출 후 24시간에서 525nm 파장이 가장 높은 증식 속도를 자극했습니다. 그러나 10일 시점에서 825nm 파장은 525nm 파장에 비해 우수한 증식 속도를 보여주었습니다. 10일 배양 기간이 끝날 때, 825nm, 10J/cm2 그룹이 가장 높은 증식률을 보였다.
그림 1: 프로토콜 개요. 96웰 플레이트에서 하이드로겔 준비, PBM 노출, PBM 노출 후 24시간 및 10일 시점의 형태 및 생화학적 분석 측정을 강조하는 요약 프로토콜. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 시드 후 자체 집계된 ADSCs. 세포는 둥글고 타원형의 형태를 유지했으며 파종 및 PBM 노출 후 (A) 24시간 및 (B) 10일에 포도와 유사한 클러스터 모양을 가진 단일 세포 또는 응집체로 하이드로겔에 분포되었습니다. 배양 10일 후 결정적인 변화는 관찰되지 않았습니다. 대조군 (1 및 4)를 사용하여 각각 5J/cm2 (2) 및 10J/cm2 (5)에서 525nm 또는 5J/cm2 (3) 및 10J/cm2 (6)에서 825nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 하이드로겔에서 525nm 및 825nm 다이오드(5J/cm2 및 10J/cm2)를 사용하여 PBM 노출 후 24시간 및 10일 후의 세포 독성을 측정한 세포 LDH 누출. 실험 대조군에 비해 세포 독성의 유의한 증가는 관찰되지 않았습니다. 양성 대조군은 완전한 세포 사멸을 대표했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 하이드로겔에서 525nm 및 825nm 다이오드(5J/cm2 및 10J/cm2)를 사용하여 PBM 노출 후 24시간 및 10일 후의 증식 측정으로서의 세포 ATP. PBM 노출은 모든 실험 그룹에서 두 시점과 유창성 모두에서 증식률을 증가시켰습니다. 유의한 차이(P < 0.001)는 ***로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 구성 요소 | 웰당 부피(μL) |
| SLO-덱스트란 폴리머(30mmol/L) | 0.7 |
| 세포 현탁액 | 2 |
| 완충기 | 0.8 |
| 물 | 5.5 |
| 가교제(Crosslinker) | 1 |
| 총 부피 | 10 |
표 1: 하이드로겔(10μL) 시약 용량.
| 레이저 매개 변수 | 그린(G) | 근적외선(NIR) |
| 광원 | 다이오드 레이저 | 다이오드 레이저 |
| 파장 (nm) | 525 | 825 |
| 전원 출력(mW) | 553 | 515 |
| 전력 밀도(mW/cm2) | 57.48 | 53.53 |
표 2: 레이저 매개변수.
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Discussion
ADSC는 상처 치유를 돕기 위해 다양한 과정을 자극하기 때문에 재생 의학에 사용하기에 이상적인 세포 유형입니다 3,4. 그러나, 예를 들어, 낮은 생존율과 손상 부위에 세포의 비효율적인 생착과 같은 몇 가지 문제를 피해야 한다9. 불멸화된 세포는 일차 세포에 비해 더 많은 세대에 걸쳐 전달될 수 있고, 수확할 필요가 없으며, 특성화가 잘 되어 있고, 일관된 결과를 보장하는 균질한 집단이기 때문에 상업적으로 이용 가능한 세포주로 사용되었다31. 이 연구의 목적은 3D 세포 배양을 사용하여 ADSC의 증식 및 세포 독성에 대한 PBM의 증강 가능성을 결정하는 것이었습니다. 30μL 하이드로겔에 대한 제조업체의 프로토콜은 비용32를 절약하기 위해 10μL로 조정되었습니다. 그러나 이러한 감소된 부피는 겔의 준비 및 취급을 더 어렵게 만들었습니다.
ADSC는 3D 환경 내에서 자가 응집되는 것으로 나타났다33. 이 연구에서도 마찬가지로 세포는 포도와 같은 모양의 세포 응집체를 형성했습니다. 그러나 단일 산란 세포도 확인되었습니다. 세포 흘림은 세포가 주 스페로이드 또는 응집체에서 분리되어 배양 환경으로 방출되는 스페로이드의 알려진 특성입니다. 세포 배출은 세포 증식에 의해 발생할 수 있는데, 세포 증식에서는 생존 가능한 세포가 유사분열 동안 탈락되어 이동을 허용한다34. 대안적으로, 세포 사멸 및 스페로이드 또는 응집체 형상(35)의 손실로 인해 흘림이 발생할 수 있으며, 특히 괴사 코어의 성장으로 인한 매우 큰 스페로이드에서 발생할 수 있다. 세포는 2D 배양에서 방추 모양과 비교하여 3D 배양에서 둥근 형태를 채택했습니다. 유사한 연구의 결과와 마찬가지로, 이러한 결과는 세포가 6,9에 부착할 수 있는 부착 부위 또는 세포외 기질이 부족하기 때문입니다. 더욱이, 세포는 겔 내에서 유의미한 이동을 나타내지 않았으며, 이는 부착 부위(36)의 필요성을 더욱 암시한다. 부착, 접착 및 이동을 용이하게 하기 위해 접착 펩타이드 또는 다른 세포외 기질 단백질을 추가하는 것이 좋습니다. 이 연구의 한계는 Z-스태킹 대신 역광 현미경을 사용하여 ADSC의 3D 형태를 관찰하는 것이었습니다. PBM 노출 및 3D 배양은 노출 후 24시간 및 10일 모두에서 ADSC의 세포 독성에 유의한 영향을 미치지 않았으며, 이는 하이드로겔 배양 및 PBM이 안전하고 세포에 부정적인 영향을 미치지 않음을 나타냅니다 6,26. 3D 세포 배양에서 ADSC는 2D 세포 배양에 비해 느린 증식 속도와 관련이 있습니다. 이는 현재 연구에서 정상 대조군의 낮은 증식률에 의해 뒷받침된다6. PBM(525nm 및 825nm)은 3D 배양에서 ADSC의 증식 속도를 크게 증가시켰습니다. 초기에는 5 J/cm2 및 10 J/cm2 플루언시 모두에서 녹색광(525nm)이 근적외선(825nm)에 비해 가장 높은 증식률을 보였습니다. 그러나 10일 시점에서 근적외선(825nm)은 5J/cm2 및 10J/cm2 플루언시 모두에서 가장 높은 증식률을 보입니다. 유사하게, PBM(525nm 및 825nm)은 2D 배양물에서 증식률을 증가시키는 것으로 입증되었다37. 다른 연구에서 녹색과 근적외선의 시너지 효과를 보고했기 때문에 파장 조합 그룹도 포함하는 것이 좋습니다.
결론적으로, 사용된 하이드로겔은 다양한 응용 분야의 요구에 맞는 엄청난 맞춤화 능력을 갖춘 합성 하이드로겔입니다. 현재 연구는 겔이 10 일 기간 동안 배양 중인 세포에 대한 세포 독성 효과가 없음을 입증했습니다. 또한 PBM은 3D 배양 환경임에도 불구하고 ADSC의 증식 속도를 크게 상향 조절함으로써 긍정적인 증강 잠재력을 보여주었습니다. 따라서 이 하이드로겔은 상처에 이식하기 위한 생체 재료 운반체 역할을 할 수 있습니다. 향후 조사는 동물 연구를 사용하여 상처 치유를 돕는 젤의 잠재적 능력을 테스트하는 것을 목표로 해야 합니다. 동물 실험 결과가 양호한 경우, 환자 유래 ADSC를 수확, 캡슐화 및 PBM으로 보강하여 상처에 이식하기 전에 임상 적용에서 상처 치유를 지원할 수 있을 것으로 예상됩니다.
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Disclosures
저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 남아프리카 공화국 국립 연구 재단 (National Research Foundation of South Africa Thuthuka Instrument, 보조금 번호 TTK2205035996; 과학혁신부(DSI)는 아프리카 레이저 센터(ALC)에 자금을 지원했으며, ALC-R007 과제HLHA23X 부여 번호; 대학 연구 위원회, 보조금 번호 2022URC00513; 과학기술부(Department of Science and Technology)의 남아프리카 연구 의장 이니셔티브(DST-NRF/SARChI), 보조금 번호 98337. 연구비 지원 기관은 연구의 설계, 수집, 분석, 데이터 해석 또는 원고 작성에 아무런 역할도 하지 않았다. 저자들은 요하네스버그 대학교(UJ)와 레이저 연구 센터(LRC)의 시설 및 자원 사용에 대해 감사를 표합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 525 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | EN 60825-1:2007 | |
| 825 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | SN 101080908ADR-1800 | |
| 96 Well Strip Plates | Sigma-Aldrich | BR782301 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | ATP reagent, Proliferation assay Kit |
| Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430659 | cryovial |
| CryoSOfree | Sigma-Aldrich | C9249 | Cell freezing media |
| CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | Cytotoxicity reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Media | Sigma-Aldrich | D5796 | Basal medium (39 mL/44 mL) |
| FieldMate Laser Power Meter | Coherent | 1098297 | |
| Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate | Sigma-Aldrich | CLS3370 | |
| Foetal bovine serum | Biochrom | S0615 | Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%) |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | Rinse solution |
| Heracell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51026280 | |
| Heraeus Labofuge 400 | Thermo Scientific | 75008371 | Plate spinner for 96 well plates |
| Heraeus Megafuge 16R centrifuge | ThermoFisher | 75004270 | |
| Immortalized ADSCs | ATCC | ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000 | Passage 37 |
| Invitrogen Countess 3 | Invitrogen | AMQAX2000 | Automated cell counter for Trypan Blue |
| Julabo TW20 waterbath | Sigma-Aldrich | Z615501 | Waterbath used to warm media to 37 °C |
| Olympus CellSens Entry | Olympus | Version 3.2 (23706) | Imaging software: digital image acquisition |
| Olympus CKX41 | Olympus | SN9B02019 | Inverted light microscope |
| Olympus SC30 camera | Olympus | SN57000530 | Camera attached to inverted light microscope |
| Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates | Sigma-Aldrich | CLS3912 | Opaque well used for ATP luminescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| SigmaPlot 12.0 | Systat Software Incorporated | ||
| TrueGel3D – True3 | Sigma-Aldrich | TRUE3-1KT | 10 µL |
| TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution | Sigma-Aldrich | TRUEENZ | 01:20 |
| Trypan Blue Stain | Thermo Fisher - Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Gibco | 12563029 | Cell detachment solution |
| Victor Nivo Plate Reader | Perkin Elmer | HH3522019094 | Spectrophotometric plate reader |
References
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Yuan, X., et al. Strategies for improving adipose-derived stem cells for tissue regeneration. Burns Trauma. 10, (2022).
- Nilforoushzadeh, M. A., et al. Mesenchymal stem cell spheroids embedded in an injectable thermosensitive hydrogel: An in situ drug formation platform for accelerated wound healing. ACS Biomater Sci Eng. 6 (9), 5096-5109 (2020).
- Yang, M., et al. Thermosensitive injectable chitosan/collagen/β-glycerophosphate composite hydrogels for enhancing wound healing by encapsulating mesenchymal stem cell spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21015-21023 (2020).
- Chimenti, I., et al. Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice. Circ Res. 106 (5), 971-980 (2010).
- Hassan, W., Dong, Y., Wang, W. Encapsulation and 3d culture of human adipose-derived stem cells in an in-situ crosslinked hybrid hydrogel composed of peg-based hyperbranched copolymer and hyaluronic acid. Stem Cell Res Ther. 4 (2), 32 (2013).
- Wu, K. H., Mo, X. M., Han, Z. C., Zhou, B. Stem cell engraftment and survival in the ischemic heart. The Ann Thorac Surg. 92 (5), 1917-1925 (2011).
- Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: General approaches and a review of recent developments. J R Soc Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
- Koivunotko, E., et al. Angiogenic potential of human adipose-derived mesenchymal stromal cells in nanofibrillated cellulose hydrogel. Biomedicines. 10 (10), 2584 (2022).
- Dong, Y., et al. Injectable and tunable gelatin hydrogels enhance stem cell retention and improve cutaneous wound healing. Adv Funct Mater. 27 (24), 1606619 (2017).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3d cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
- Sung, T. -C., et al. 3D culturing of human adipose-derived stem cells enhances their pluripotency and differentiation abilities. J Mater Sci Technol. 63, 9-17 (2021).
- Garg, R. K., et al. Capillary force seeding of hydrogels for adipose-derived stem cell delivery in wounds. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1079-1089 (2014).
- Kim, Y. M., et al. Adipose-derived stem cell-containing hyaluronic acid/alginate hydrogel improves vocal fold wound healing. Laryngoscope. 124 (3), E64-E72 (2014).
- Dong, Y., et al. Conformable hyaluronic acid hydrogel delivers adipose-derived stem cells and promotes regeneration of burn injury. Acta Biomater. 108, 56-66 (2020).
- Truegel3d hydrogel for 3d cell culture. Merck. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/ZA/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/3d-cell-culture/truegel3d (2024).
- Braccini, S., Tacchini, C., Chiellini, F., Puppi, D. Polymeric hydrogels for in vitro 3d ovarian cancer modeling. Int J Mol Sci. 23 (6), 3265 (2022).
- Mashinchian, O., et al. In vivo transcriptomic profiling using cell encapsulation identifies effector pathways of systemic aging. eLife. 11, e57393 (2022).
- Matsushige, C., Xu, X., Miyagi, M., Zuo, Y. Y., Yamazaki, Y. Rgd-modified dextran hydrogel promotes follicle growth in three-dimensional ovarian tissue culture in mice. Theriogenology. 183, 120-131 (2022).
- Marx, V. How some labs put more bio into biomaterials. Nat Methods. 16 (5), 365-368 (2019).
- Marques, M. M.
- Hamblin, M. R. Mechanisms and mitochondrial redox signaling in photobiomodulation. Photochem Photobiol. 94 (2), 199-212 (2018).
- Chen, J., et al. Low-level controllable blue LEDs irradiation enhances human dental pulp stem cells osteogenic differentiation via transient receptor potential vanilloid 1. J Photochem Photobiol B. 233, 112472 (2022).
- Chang, S. -Y., Carpena, N. T., Kang, B. J., Lee, M. Y. Effects of photobiomodulation on stem cells important for regenerative medicine. Med Lasers. 9 (2), 134-141 (2020).
- Bikmulina, P. Y., et al. Beyond 2d: Effects of photobiomodulation in 3d tissue-like systems. J Biomed Opt. 25 (4), 048001 (2020).
- Ahmadi, H., et al. Transplantation of photobiomodulation-preconditioned diabetic stem cells accelerates ischemic wound healing in diabetic rats. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 494 (2020).
- Mao, A. S., Mooney, D. J. Regenerative medicine: Current therapies and future directions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (47), 14452-14459 (2015).
- De Andrade, A. L. M., et al. Effect of photobiomodulation on the behaviour of mesenchymal stem cells in three-dimensional cultures. Lasers Med Sci. 38 (1), 221 (2023).
- Diniz, I. M., et al. Photobiomodulation of mesenchymal stem cells encapsulated in an injectable rhbmp4-loaded hydrogel directs hard tissue bioengineering. J Cell Physiol. 233 (6), 4907-4918 (2018).
- Carter, M., Shieh, J. C. Guide to Research Techniques in Neuroscience. , Elsevier, Academic Press. (2015).
- Lutolf, M. P., et al. Synthetic matrix metalloproteinase-sensitive hydrogels for the conduction of tissue regeneration: Engineering cell-invasion characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5413-5418 (2003).
- Robledo, F., et al. Spheroids derived from the stromal vascular fraction of adipose tissue self-organize in complex adipose organoids and secrete leptin. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 70 (2023).
- Landry, J., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Shedding of mitotic cells from the surface of multicell spheroids during growth. J Cell Physiol. 106 (1), 23-32 (1981).
- Bogacheva, M. S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into definitive endoderm cells in various flexible three-dimensional cell culture systems: Possibilities and limitations. Front Cell Dev Biol. 9, 726499 (2021).
- Chen, X., Thibeault, S. L. Biocompatibility of a synthetic extracellular matrix on immortalized vocal fold fibroblasts in 3-d culture. Acta Biomater. 6 (8), 2940-2948 (2010).
- Crous, A., Van Rensburg, M. J., Abrahamse, H. Single and consecutive application of near-infrared and green irradiation modulates adipose derived stem cell proliferation and affect differentiation factors. Biochimie. 196, 225-233 (2022).
