Colture cellulari tridimensionali di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo in un idrogel con aumento della fotobiomodulazione

Summary

Qui, presentiamo un protocollo che dimostra l’uso dell’idrogel come struttura di coltura cellulare tridimensionale (3D) per la coltura di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC) e introduciamo la fotobiomodulazione (PBM) per migliorare la proliferazione di ADSC all’interno dell’ambiente di coltura 3D.

Abstract

Le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC), che possiedono caratteristiche mesenchimali multipotenti simili alle cellule staminali, sono spesso impiegate nella medicina rigenerativa grazie alla loro capacità di differenziazione cellulare e alla loro capacità di migliorare la migrazione, la proliferazione e mitigare l’infiammazione. Tuttavia, le ADSC spesso affrontano sfide nella sopravvivenza e nell’attecchimento all’interno delle ferite, principalmente a causa di condizioni infiammatorie sfavorevoli. Per affrontare questo problema, sono stati sviluppati idrogel per sostenere la vitalità dell’ADSC nelle ferite e accelerare il processo di guarigione delle ferite. Qui, abbiamo mirato a valutare l’impatto sinergico della fotobiomodulazione (PBM) sulla proliferazione e sulla citotossicità dell’ADSC all’interno di un quadro di coltura cellulare 3D. Gli ADSC immortalizzati sono stati seminati in idrogel da 10 μL ad una densità di 2,5 x 10³ cellule e sottoposti a irradiazione utilizzando diodi da 525 nm e 825 nm a fluenze di 5 J/cm² e 10 J/cm². I cambiamenti morfologici, la citotossicità e la proliferazione sono stati valutati a 24 ore e 10 giorni dopo l’esposizione al PBM. Gli ADSC hanno mostrato una morfologia arrotondata e sono stati dispersi in tutto il gel come singole cellule o aggregati sferoidi. È importante sottolineare che sia il PBM che la struttura di coltura 3D non hanno mostrato effetti citotossici sulle cellule, mentre il PBM ha migliorato significativamente i tassi di proliferazione delle ADSC. In conclusione, questo studio dimostra l’uso dell’idrogel come ambiente 3D adatto per la coltura ADSC e introduce il PBM come una significativa strategia di aumento, affrontando in particolare i lenti tassi di proliferazione associati alla coltura cellulare 3D.

Introduction

Le ADSC sono cellule progenitrici mesenchimali multipotenti con la capacità di auto-rinnovarsi e differenziarsi in diverse linee cellulari. Queste cellule possono essere prelevate dalla frazione vascolare stromale (SVF) del tessuto adiposo durante una procedura di lipoaspirazione¹. Le ADSC sono emerse come un tipo di cellule staminali ideale da utilizzare nella medicina rigenerativa perché queste cellule sono abbondanti, minimamente invasive da raccogliere, facilmente accessibili e ben caratterizzate². La terapia con cellule staminali offre una possibile strada per la guarigione delle ferite stimolando la migrazione cellulare, la proliferazione, la neovascolarizzazione e riducendo l’infiammazione all’interno delle ferite ^3,4. Circa l’80% della capacità rigenerativa delle ADSC è attribuibile alla segnalazione paracrina attraverso il loro secretoma⁵. In precedenza, è stato suggerito che un’iniezione locale diretta di cellule staminali o fattori di crescita nel tessuto danneggiato potrebbe illecito meccanismi di riparazione in vivo ^{sufficienti 6,7,8}. Tuttavia, questo approccio ha dovuto affrontare diverse sfide, come la scarsa sopravvivenza e la riduzione dell’attecchimento delle cellule staminali all’interno dei tessuti danneggiati a causa dell’ambiente infiammatorio ⁹. Inoltre, uno dei motivi citati era la mancanza di una matrice extracellulare per supportare la sopravvivenza e la funzionalità delle cellule trapiantate¹⁰. Per superare queste sfide, l’accento è ora posto sullo sviluppo di vettori di biomateriali per sostenere la vitalità e la funzione delle cellule staminali.

La coltura cellulare tridimensionale (3D) migliora l’interazione cellula-cellula e cellula-matrice in vitro per fornire un ambiente più simile all’ambiente in vivo ¹¹. Gli idrogel sono stati ampiamente studiati come una classe di vettori di biomateriali che forniscono un ambiente 3D per la coltura di cellule staminali. Queste strutture sono costituite da acqua e polimeri reticolati¹². L’incapsulamento delle ADSC in idrogel non ha praticamente alcun effetto citotossico sulle cellule durante la coltura, pur mantenendo la vitalità delle cellule⁶. Le cellule staminali coltivate in 3D dimostrano una maggiore ritenzione della loro staminalità e una migliore capacità di differenziazione¹³. Allo stesso modo, le ADSC con semi di idrogel hanno dimostrato una maggiore vitalità e una chiusura accelerata della ferita nei modelli animali¹⁴. Inoltre, l’incapsulamento dell’idrogel aumenta significativamente l’attecchimento e la ritenzione delle ADSC nelle ferite^15,16. TrueGel3D è costituito da un polimero, alcol polivinilico o destrano, solidificato da un reticolante, ciclodestrina o polietilenglicole¹⁷. Il gel è un idrogel sintetico che non contiene prodotti di origine animale che possano interferire con gli esperimenti o innescare una reazione immunitaria durante il trapianto del gel in un paziente, imitando efficacemente una matrice extracellulare¹⁸. Il gel è completamente personalizzabile modificando la composizione e i singoli componenti. Può ospitare diverse cellule staminali e supportare la differenziazione di diversi tipi di cellule regolando la rigidità del gel¹⁹. I siti di attacco possono essere creati attraverso l’aggiunta di peptidi²⁰. Il gel è degradabile dalla secrezione di metalloproteasi, consentendo la migrazione cellulare²¹. Infine, è chiaro e consente tecniche di imaging.

Il PBM è una forma minimamente invasiva e di facile esecuzione di terapia laser a basso livello utilizzata per stimolare i cromofori intracellulari. Diverse lunghezze d’onda suscitano effetti diversi sulle cellule²². La luce nella gamma dal rosso al vicino infrarosso stimola l’aumento della produzione di adenosina trifosfato (ATP) e di specie reattive dell’ossigeno (ROS) migliorando il flusso attraverso la catena di trasporto degli elettroni²³. La luce nelle gamme blu e verde stimola i canali ionici dipendenti dalla luce, consentendo l’afflusso non specifico di cationi, come calcio e magnesio, nelle cellule, che è noto per migliorare la differenziazione²⁴. L’effetto netto è la generazione di messaggeri secondari che stimolano la trascrizione di fattori che innescano processi cellulari a valle come la migrazione, la proliferazione e la differenziazione²⁵. Il PBM può essere utilizzato per pre-condizionare le cellule a proliferare o differenziarsi prima di trapiantarle in un ambiente avverso, ad esempio tessuto danneggiato²⁶. L’esposizione pre e post-trapianto di PBM (630 nm e 810 nm) di ADSC ha migliorato significativamente la vitalità e la funzione di queste cellule in vivo in un modello di ratto diabetico²⁷. La medicina rigenerativa richiede un numero adeguato di cellule per un’efficace riparazione dei tessuti²⁸. Nelle colture cellulari 3D, le ADSC sono state associate a tassi di proliferazione più lenti rispetto alle colture cellulari bidimensionali⁶. Tuttavia, il PBM può essere utilizzato per aumentare il processo di coltura cellulare 3D delle ADSC migliorando la vitalità, la proliferazione, la migrazione e la differenziazione^29,30.

Protocol

NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e il software utilizzati in questo protocollo. Il protocollo è stato riassunto graficamente nella Figura 1. 1. Colture cellulari bidimensionali (2D) NOTA: Gli ADSC immortalizzati (1 x106 cellule) vengono conservati a -195,8 °C in azoto liquido in una fiala di crioconservazione contenente 1 mL di terr…

Representative Results

Per valutare la morfologia e ispezionare visivamente la densità cellulare degli idrogel, è stata utilizzata la microscopia inversa (Figura 2). Gli ADSC hanno mantenuto una morfologia arrotondata 24 ore dopo la semina e l’esposizione al PBM. Le cellule erano sparse in tutto il gel come cellule singole o in grappoli simili a grappoli d’uva. La morfologia è rimasta invariata dopo 10 giorni nella coltura 3D. Non è stata notata alcuna differenza definitiva nella morfologia tra i gruppi sperim…

Discussion

Le ADSC sono un tipo di cellula ideale da utilizzare per la medicina rigenerativa in quanto stimolano vari processi per aiutare la guarigione delle ferite ^3,4. Tuttavia, ci sono diverse sfide che devono essere aggirate, ad esempio gli scarsi tassi di sopravvivenza e l’attecchimento inefficace delle cellule in un sito di lesione⁹. Le cellule immortalizzate sono state utilizzate come linea cellulare disponibile in commercio, in quanto posson…

Materials

525 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	EN 60825-1:2007
825 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	SN 101080908ADR-1800
96 Well Strip Plates	Sigma-Aldrich	BR782301
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2942	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681	ATP reagent, Proliferation assay Kit
Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	430659	cryovial
CryoSOfree	Sigma-Aldrich	C9249	Cell freezing media
CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay	Promega	G1780	Cytotoxicity reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Media	Sigma-Aldrich	D5796	Basal medium (39 mL/44 mL)
FieldMate Laser Power Meter	Coherent	1098297
Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate	Sigma-Aldrich	CLS3370
Foetal bovine serum	Biochrom	S0615	Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H9394	Rinse solution
Heracell 150i CO2 incubator	Thermo Scientific	51026280
Heraeus Labofuge 400	Thermo Scientific	75008371	Plate spinner for 96 well plates
Heraeus Megafuge 16R centrifuge	ThermoFisher	75004270
Immortalized ADSCs	ATCC	ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000	Passage 37
Invitrogen Countess 3	Invitrogen	AMQAX2000	Automated cell counter for Trypan Blue
Julabo TW20 waterbath	Sigma-Aldrich	Z615501	Waterbath used to warm media to 37 °C
Olympus CellSens Entry	Olympus	Version 3.2 (23706)	Imaging software: digital image acquisition
Olympus CKX41	Olympus	SN9B02019	Inverted light microscope
Olympus SC30 camera	Olympus	SN57000530	Camera attached to inverted light microscope
Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates	Sigma-Aldrich	CLS3912	Opaque well used for ATP luminescence
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
SigmaPlot 12.0	Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3	Sigma-Aldrich	TRUE3-1KT	10 µL
TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution	Sigma-Aldrich	TRUEENZ	01:20
Trypan Blue Stain	Thermo Fisher – Invitrogen	T10282	0.4% solution
TrypLE Select Enzyme (1x)	Gibco	12563029	Cell detachment solution
Victor Nivo Plate Reader	Perkin Elmer	HH3522019094	Spectrophotometric plate reader