תרבית תאים תלת מימדית של תאי גזע שמקורם בשומן בהידרוג'ל עם הגדלת פוטוביומודולציה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול המדגים את השימוש בהידרוג’ל כמסגרת תלת ממדית (3D) לתרבית תאי גזע שמקורם בשומן (ADSC) ומציגים פוטוביומודולציה (PBM) כדי להגביר את התפשטות ADSCs במסגרת התרבית התלת-ממדית.
Abstract
תאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs), בעלי תכונות מזנכימליות רב-עוצמה הדומות לתאי גזע, משמשים לעתים קרובות ברפואה רגנרטיבית בשל יכולתם למגוון רחב של התמיינות תאים ויכולתם להגביר את הנדידה, ההתרבות ולמתן דלקת. עם זאת, ADSCs לעתים קרובות להתמודד עם אתגרים בהישרדות וקליטה בתוך פצעים, בעיקר בשל תנאים דלקתיים שליליים. כדי לטפל בבעיה זו, הידרוג’לים פותחו כדי לשמור על כדאיות ADSC בפצעים ולזרז את תהליך ריפוי הפצע. כאן, שאפנו להעריך את ההשפעה הסינרגטית של פוטוביומודולציה (PBM) על התפשטות ADSC וציטוטוקסיות במסגרת תרבית תאים תלת-ממדית. ADSCs אימורטליים נזרעו לתוך הידרוג’לים של 10 μL בצפיפות של 2.5 x 103 תאים והיו נתונים לקרינה באמצעות דיודות 525 ננומטר ו 825 ננומטר בשטף של 5 J / cm2 ו 10 J / cm2. שינויים מורפולוגיים, ציטוטוקסיות והתפשטות הוערכו 24 שעות ו-10 ימים לאחר החשיפה ל-PBM. ה-ADSCs הציגו מורפולוגיה מעוגלת ופוזרו לאורך הג’ל כתאים בודדים או כאגרגטים ספרואידים. חשוב לציין, הן PBM והן מסגרת תרבית תלת-ממדית לא הציגו השפעות ציטוטוקסיות על התאים, בעוד PBM שיפר באופן משמעותי את שיעורי ההתרבות של ADSCs. לסיכום, מחקר זה מדגים את השימוש בהידרוג’ל כסביבה תלת-ממדית מתאימה לתרבית ADSC ומציג PBM כאסטרטגיית הגדלה משמעותית, במיוחד תוך התייחסות לקצב ההתרבות האיטי הקשור לתרבית תאים תלת-ממדית.
Introduction
ADSCs הם תאי אב מזנכימליים רב-פוטנטיים בעלי יכולת לחדש את עצמם ולהתמיין למספר שושלות תאים. תאים אלה ניתן לקצור מן החלק כלי הדם סטרומה (SVF) של רקמת השומן במהלך הליך lipoaspiration1. ADSCs התגלו כסוג תאי גזע אידיאלי לשימוש ברפואה רגנרטיבית מכיוון שתאים אלה נמצאים בשפע, זעיר פולשניים לקציר, נגישים בקלות ומאופיינים היטב2. טיפול בתאי גזע מציע אפיק אפשרי לריפוי פצעים על ידי גירוי נדידת תאים, התפשטות, ניאו-וסקולריזציה והפחתת דלקת בתוך פצעים 3,4. כ-80% מיכולת ההתחדשות של ADSCs מיוחסת לאיתות פרקריני באמצעות ההפרשה5 שלהם. בעבר, הוצע כי הזרקה מקומית ישירה של תאי גזע או גורמי גדילה לרקמות פגועות יכולה להיות בלתי חוקית מספיק במנגנוני תיקון in vivo 6,7,8. עם זאת, גישה זו התמודדה עם מספר אתגרים, כגון הישרדות ירודה וקליטת תאי גזע מופחתת בתוך רקמות פגועות כתוצאה מהסביבה הדלקתית 9. יתר על כן, אחת הסיבות שצוינו הייתה היעדר מטריצה חוץ-תאית לתמיכה בהישרדות ובתפקוד של התאים המושתלים10. כדי להתגבר על אתגרים אלה, מושם כעת דגש על פיתוח נשאים ביו-חומריים לתמיכה בכדאיות תאי גזע ובתפקודם.
תרבית תאים תלת-ממדית (תלת-ממדית) משפרת את האינטראקציה בין תאים לתאים ותא למטריצה במבחנה כדי לספק סביבה הדומה יותר לסביבה in vivo 11. הידרוג’לים נחקרו בהרחבה כקבוצה של נשאים ביו-חומריים המספקים סביבה תלת-ממדית לתרבית תאי גזע. מבנים אלה עשויים מים ופולימרים מוצלבים12. לאנקפסולציה של ADSCs בהידרוג’ל אין כמעט השפעה ציטוטוקסית על התאים במהלך התרבית תוך שמירה על יכולת הקיום של התאים6. תאי גזע שגודלו בתרבית תלת-ממדית מפגינים שימור משופר של גזעם ויכולת התמיינות משופרת13. באופן דומה, ADSCs מזרעי הידרוג’ל הדגימו כדאיות מוגברת וסגירת פצעים מואצת במודלים של בעלי חיים14. יתר על כן, אנקפסולציית הידרוג’ל מגדילה באופן משמעותי את התפיסה והשמירה של ADSCs בפצעים15,16. TrueGel3D עשוי מפולימר, אלכוהול פוליוויניל או דקסטרן, שהתמצק על ידי קרוסלינקר, ציקלודקסטרין או פוליאתילן גליקול17. הג’ל הוא הידרוג’ל סינתטי שאינו מכיל מוצרים מן החי שעלולים להפריע לניסויים או לעורר תגובה חיסונית במהלך השתלת הג’ל למטופל תוך חיקוי יעיל של מטריצה חוץ-תאית18. הג’ל ניתן להתאמה אישית מלאה על ידי שינוי הרכב ורכיבים בודדים. הוא יכול להכיל תאי גזע שונים ולתמוך בהתמיינות של מספר סוגי תאים על ידי התאמת קשיחות הג’ל19. ניתן ליצור אתרי התקשרות באמצעות הוספת פפטידים20. הג’ל מתכלה על ידי הפרשת מטאלופרוטאזים, מה שמאפשר נדידת תאים21. לבסוף, זה ברור ומאפשר טכניקות הדמיה.
PBM היא צורה זעיר פולשנית וקלה לביצוע של טיפול לייזר ברמה נמוכה המשמש לגירוי כרומופורים תוך תאיים. אורכי גל שונים יוצרים השפעות שונות על תאים22. אור בתחום האדום עד קרוב לאינפרא אדום מעורר ייצור מוגבר של אדנוזין טריפוספט (ATP) ומיני חמצן תגובתי (ROS) על ידי הגברת השטף דרך שרשרת הובלת האלקטרונים23. האור בטווח הכחול והירוק מעורר תעלות יונים מגודרות אור, ומאפשר זרימה לא ספציפית של קטיונים, כגון סידן ומגנזיום, לתוך התאים, אשר ידוע כמגביר התמיינות24. ההשפעה נטו היא יצירת שליחים משניים המעוררים שעתוק של גורמים המפעילים תהליכים תאיים במורד הזרם כגון הגירה, התפשטות והתמיינות25. PBM יכול לשמש כדי להתנות מראש תאים כדי להתרבות או להתמיין לפני השתלת התאים לסביבה שלילית, למשל, רקמה פגומה26. חשיפה ל-PBM לפני ואחרי ההשתלה (630 ננומטר ו-810 ננומטר) של ADSCs שיפרה באופן משמעותי את הכדאיות והתפקוד של תאים אלה in vivo בחולדה סוכרתית מודל27. רפואה רגנרטיבית דורשת מספר מספיק של תאים לתיקון יעיל של רקמות28. בתרבית תאים תלת-ממדית, ADSCs נקשרו לקצב התפשטות איטי יותר בהשוואה לתרבית תאים דו-ממדית6. עם זאת, PBM יכול לשמש כדי להגדיל את תהליך תרבית התאים התלת-ממדית של ADSCs על ידי שיפור הכדאיות, ההתפשטות, ההגירה וההתמיינות29,30.
Protocol
Representative Results
Discussion
ADSCs הם סוג תא אידיאלי לשימוש ברפואה רגנרטיבית מכיוון שהם מעוררים תהליכים שונים המסייעים בריפוי פצעים 3,4. עם זאת, ישנם מספר אתגרים שיש לעקוף, למשל, שיעורי הישרדות ירודים וקליטה לא יעילה של התאים באתר פציעה9. תאים אימורטליים שימשו כקו תאים זמין מסח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי קרן המחקר הלאומית של דרום אפריקה Thuthuka Instrument, מענק מספר TTK2205035996; מרכז הלייזר האפריקאי (ALC) במימון המחלקה למדע וחדשנות (DSI), מספר מענק HLHA23X המשימה ALC-R007; מועצת המחקר האוניברסיטאית, מענק מספר 2022URC00513; יוזמת קתדרות המחקר של המחלקה למדע וטכנולוגיה בדרום אפריקה (DST-NRF/SARChI), מענק מספר 98337. הגופים המממנים לא מילאו כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף, בניתוח, בפענוח הנתונים או בכתיבת כתב היד. המחברים מודים לאוניברסיטת יוהנסבורג (UJ) ולמרכז לחקר לייזר (LRC) על השימוש שלהם במתקנים ובמשאבים.
Materials
| 525 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | EN 60825-1:2007 | |
| 825 nm diode laser | National Laser Centre of South Africa | SN 101080908ADR-1800 | |
| 96 Well Strip Plates | Sigma-Aldrich | BR782301 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | ATP reagent, Proliferation assay Kit |
| Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430659 | cryovial |
| CryoSOfree | Sigma-Aldrich | C9249 | Cell freezing media |
| CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | Cytotoxicity reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Media | Sigma-Aldrich | D5796 | Basal medium (39 mL/44 mL) |
| FieldMate Laser Power Meter | Coherent | 1098297 | |
| Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate | Sigma-Aldrich | CLS3370 | |
| Foetal bovine serum | Biochrom | S0615 | Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%) |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | Rinse solution |
| Heracell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51026280 | |
| Heraeus Labofuge 400 | Thermo Scientific | 75008371 | Plate spinner for 96 well plates |
| Heraeus Megafuge 16R centrifuge | ThermoFisher | 75004270 | |
| Immortalized ADSCs | ATCC | ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000 | Passage 37 |
| Invitrogen Countess 3 | Invitrogen | AMQAX2000 | Automated cell counter for Trypan Blue |
| Julabo TW20 waterbath | Sigma-Aldrich | Z615501 | Waterbath used to warm media to 37 °C |
| Olympus CellSens Entry | Olympus | Version 3.2 (23706) | Imaging software: digital image acquisition |
| Olympus CKX41 | Olympus | SN9B02019 | Inverted light microscope |
| Olympus SC30 camera | Olympus | SN57000530 | Camera attached to inverted light microscope |
| Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates | Sigma-Aldrich | CLS3912 | Opaque well used for ATP luminescence |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotic (0.5%; 0.5 mL) |
| SigmaPlot 12.0 | Systat Software Incorporated | ||
| TrueGel3D – True3 | Sigma-Aldrich | TRUE3-1KT | 10 µL |
| TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution | Sigma-Aldrich | TRUEENZ | 01:20 |
| Trypan Blue Stain | Thermo Fisher – Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Gibco | 12563029 | Cell detachment solution |
| Victor Nivo Plate Reader | Perkin Elmer | HH3522019094 | Spectrophotometric plate reader |
References
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Yuan, X., et al. Strategies for improving adipose-derived stem cells for tissue regeneration. Burns Trauma. 10, (2022).
- Nilforoushzadeh, M. A., et al. Mesenchymal stem cell spheroids embedded in an injectable thermosensitive hydrogel: An in situ drug formation platform for accelerated wound healing. ACS Biomater Sci Eng. 6 (9), 5096-5109 (2020).
- Yang, M., et al. Thermosensitive injectable chitosan/collagen/β-glycerophosphate composite hydrogels for enhancing wound healing by encapsulating mesenchymal stem cell spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21015-21023 (2020).
- Chimenti, I., et al. Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice. Circ Res. 106 (5), 971-980 (2010).
- Hassan, W., Dong, Y., Wang, W. Encapsulation and 3d culture of human adipose-derived stem cells in an in-situ crosslinked hybrid hydrogel composed of peg-based hyperbranched copolymer and hyaluronic acid. Stem Cell Res Ther. 4 (2), 32 (2013).
- Wu, K. H., Mo, X. M., Han, Z. C., Zhou, B. Stem cell engraftment and survival in the ischemic heart. The Ann Thorac Surg. 92 (5), 1917-1925 (2011).
- Lee, K., Silva, E. A., Mooney, D. J. Growth factor delivery-based tissue engineering: General approaches and a review of recent developments. J R Soc Interface. 8 (55), 153-170 (2011).
- Koivunotko, E., et al. Angiogenic potential of human adipose-derived mesenchymal stromal cells in nanofibrillated cellulose hydrogel. Biomedicines. 10 (10), 2584 (2022).
- Dong, Y., et al. Injectable and tunable gelatin hydrogels enhance stem cell retention and improve cutaneous wound healing. Adv Funct Mater. 27 (24), 1606619 (2017).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3d cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
- Sung, T. -. C., et al. 3D culturing of human adipose-derived stem cells enhances their pluripotency and differentiation abilities. J Mater Sci Technol. 63, 9-17 (2021).
- Garg, R. K., et al. Capillary force seeding of hydrogels for adipose-derived stem cell delivery in wounds. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1079-1089 (2014).
- Kim, Y. M., et al. Adipose-derived stem cell-containing hyaluronic acid/alginate hydrogel improves vocal fold wound healing. Laryngoscope. 124 (3), E64-E72 (2014).
- Dong, Y., et al. Conformable hyaluronic acid hydrogel delivers adipose-derived stem cells and promotes regeneration of burn injury. Acta Biomater. 108, 56-66 (2020).
- Truegel3d hydrogel for 3d cell culture. Merck Available from: https://www.sigmaaldrich.com/ZA/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/3d-cell-culture/truegel3d (2024)
- Braccini, S., Tacchini, C., Chiellini, F., Puppi, D. Polymeric hydrogels for in vitro 3d ovarian cancer modeling. Int J Mol Sci. 23 (6), 3265 (2022).
- Mashinchian, O., et al. In vivo transcriptomic profiling using cell encapsulation identifies effector pathways of systemic aging. eLife. 11, e57393 (2022).
- Matsushige, C., Xu, X., Miyagi, M., Zuo, Y. Y., Yamazaki, Y. Rgd-modified dextran hydrogel promotes follicle growth in three-dimensional ovarian tissue culture in mice. Theriogenology. 183, 120-131 (2022).
- Marx, V. How some labs put more bio into biomaterials. Nat Methods. 16 (5), 365-368 (2019).
- Marques, M. M. Photobiomodulation therapy weaknesses. Laser Dent Sci. 6 (3), 131-132 (2022).
- Hamblin, M. R. Mechanisms and mitochondrial redox signaling in photobiomodulation. Photochem Photobiol. 94 (2), 199-212 (2018).
- Chen, J., et al. Low-level controllable blue LEDs irradiation enhances human dental pulp stem cells osteogenic differentiation via transient receptor potential vanilloid 1. J Photochem Photobiol B. 233, 112472 (2022).
- Chang, S. -. Y., Carpena, N. T., Kang, B. J., Lee, M. Y. Effects of photobiomodulation on stem cells important for regenerative medicine. Med Lasers. 9 (2), 134-141 (2020).
- Bikmulina, P. Y., et al. Beyond 2d: Effects of photobiomodulation in 3d tissue-like systems. J Biomed Opt. 25 (4), 048001 (2020).
- Ahmadi, H., et al. Transplantation of photobiomodulation-preconditioned diabetic stem cells accelerates ischemic wound healing in diabetic rats. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 494 (2020).
- Mao, A. S., Mooney, D. J. Regenerative medicine: Current therapies and future directions. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (47), 14452-14459 (2015).
- De Andrade, A. L. M., et al. Effect of photobiomodulation on the behaviour of mesenchymal stem cells in three-dimensional cultures. Lasers Med Sci. 38 (1), 221 (2023).
- Diniz, I. M., et al. Photobiomodulation of mesenchymal stem cells encapsulated in an injectable rhbmp4-loaded hydrogel directs hard tissue bioengineering. J Cell Physiol. 233 (6), 4907-4918 (2018).
- Carter, M., Shieh, J. C. . Guide to Research Techniques in Neuroscience. , (2015).
- Lutolf, M. P., et al. Synthetic matrix metalloproteinase-sensitive hydrogels for the conduction of tissue regeneration: Engineering cell-invasion characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5413-5418 (2003).
- Robledo, F., et al. Spheroids derived from the stromal vascular fraction of adipose tissue self-organize in complex adipose organoids and secrete leptin. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 70 (2023).
- Landry, J., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Shedding of mitotic cells from the surface of multicell spheroids during growth. J Cell Physiol. 106 (1), 23-32 (1981).
- Bogacheva, M. S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into definitive endoderm cells in various flexible three-dimensional cell culture systems: Possibilities and limitations. Front Cell Dev Biol. 9, 726499 (2021).
- Chen, X., Thibeault, S. L. Biocompatibility of a synthetic extracellular matrix on immortalized vocal fold fibroblasts in 3-d culture. Acta Biomater. 6 (8), 2940-2948 (2010).
- Crous, A., Van Rensburg, M. J., Abrahamse, H. Single and consecutive application of near-infrared and green irradiation modulates adipose derived stem cell proliferation and affect differentiation factors. Biochimie. 196, 225-233 (2022).
