Cultura Celular Tridimensional de Células-Tronco Derivadas do Tecido Adiposo em Hidrogel com Aumento da Fotobiomodulação

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo demonstrando o uso de hidrogel como uma estrutura de cultura de células tridimensional (3D) para cultura de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSC) e introduzindo fotobiomodulação (PBM) para aumentar a proliferação de ADSCs dentro do ambiente de cultura 3D.

Abstract

Células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs), possuindo características mesenquimais multipotentes semelhantes às células-tronco, são frequentemente empregadas na medicina regenerativa devido à sua capacidade de diferenciação celular diversificada e sua capacidade de aumentar a migração, proliferação e mitigar a inflamação. No entanto, as ADSCs frequentemente enfrentam desafios na sobrevida e enxertia dentro de feridas, principalmente devido a condições inflamatórias desfavoráveis. Para resolver essa questão, hidrogéis foram desenvolvidos para sustentar a viabilidade de ADSC em feridas e agilizar o processo de cicatrização de feridas. Aqui, nosso objetivo foi avaliar o impacto sinérgico da fotobiomodulação (PBM) na proliferação e citotoxicidade de ADSC dentro de uma estrutura de cultura celular 3D. ADSCs imortalizadas foram semeadas em hidrogéis de 10 μL a uma densidade de 2,5 x 10³ células e submetidas à irradiação usando diodos de 525 nm e 825 nm nas fluências de 5 J/cm² e 10 J/cm². Alterações morfológicas, citotoxicidade e proliferação foram avaliadas 24 h e 10 dias após a exposição ao PBM. As ADSCs exibiram uma morfologia arredondada e foram dispersas por todo o gel como células individuais ou agregados esferoides. É importante ressaltar que tanto o PBM quanto a estrutura de cultura 3D não apresentaram efeitos citotóxicos sobre as células, enquanto o PBM aumentou significativamente as taxas de proliferação de ADSCs. Em conclusão, este estudo demonstra o uso de hidrogel como um ambiente 3D adequado para cultura de ADSC e introduz o PBM como uma estratégia de aumento significativo, particularmente abordando as taxas de proliferação lentas associadas à cultura de células 3D.

Introduction

As ADSCs são células progenitoras mesenquimais multipotentes com capacidade de se auto-renovar e diferenciar-se em várias linhagens celulares. Essas células podem ser retiradas da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo durante um procedimento de^{lipoaspiração1}. As ADSCs têm emergido como um tipo ideal de células-tronco para uso em medicina regenerativa, pois são abundantes, minimamente invasivas para a colheita, de fácil acesso e bem^{caracterizadas2}. A terapia com células-tronco oferece um caminho possível para a cicatrização de feridas, estimulando a migração celular, a proliferação, a neovascularização e reduzindo a inflamação dentro das feridas ^3,4. Cerca de 80% da capacidade regenerativa das ADSCs é atribuível à sinalização parácrina através de seu secretoma⁵. Anteriormente, sugeriu-se que uma injeção local direta de células-tronco ou fatores de crescimento no tecido lesado poderia iludir mecanismos de reparo in vivo suficientes ^6,7,8. No entanto, essa abordagem enfrentou vários desafios, como baixa sobrevida e redução do enxerto de células-tronco em tecidos lesados como resultado do ambiente ^{inflamatório9}. Além disso, um dos motivos citados foi a falta de matriz extracelular que sustentasse a sobrevida e a funcionalidade das células transplantadas¹⁰. Para superar esses desafios, a ênfase está sendo colocada no desenvolvimento de carreadores de biomateriais para apoiar a viabilidade e a função das células-tronco.

A cultura de células tridimensionais (3D) aumenta a interação célula-célula e célula-matriz in vitro para proporcionar um ambiente que melhor se assemelha ao ambiente in vivo ¹¹. Hidrogéis têm sido extensivamente estudados como uma classe de carreadores de biomateriais que fornecem um ambiente 3D para cultura de células-tronco. Essas estruturas são constituídas por água e polímeros reticulados¹². O encapsulamento de ADSCs em hidrogel praticamente não tem efeito citotóxico sobre as células durante o cultivo, mantendo a viabilidade das células⁶. Células-tronco cultivadas em 3D demonstram maior retenção de seu tronco e melhor capacidade de diferenciação¹³. Da mesma forma, as ADSCs semeadas com hidrogel demonstraram maior viabilidade e aceleraram o fechamento da ferida em modelos animais¹⁴. Além disso, o encapsulamento em hidrogel aumenta significativamente a enxertia e a retenção de ADSCs em feridas^15,16. O TrueGel3D é feito de um polímero, seja álcool polivinílico ou dextrano, solidificado por um reticulante, ciclodextrina ou polietilenoglicol¹⁷. O gel é um hidrogel sintético que não contém nenhum produto de origem animal que possa interferir nos experimentos ou desencadear uma reação imunológica durante o transplante do gel em um paciente, mimetizando efetivamente uma matriz extracelular¹⁸. O gel é totalmente personalizável, alterando a composição e componentes individuais. Pode abrigar diferentes células-tronco e auxiliar na diferenciação de vários tipos celulares, ajustando a rigidez do gel¹⁹. Sites de fixação podem ser criados através da adição de peptídeos²⁰. O gel é degradável pela secreção de metaloproteases, permitindo a migração celular²¹. Por fim, é claro e permite técnicas de imagem.

A PBM é uma forma minimamente invasiva e de fácil execução de laserterapia de baixa potência usada para estimular cromóforos intracelulares. Diferentes comprimentos de onda provocam diferentes efeitos nas células²². A luz na faixa do vermelho ao infravermelho próximo estimula o aumento da produção de adenosina trifosfato (ATP) e espécies reativas de oxigênio (ROS), aumentando o fluxo através da cadeia de transporte de elétrons²³. A luz nas faixas azul e verde estimula canais iônicos dependentes de luz, permitindo o influxo inespecífico de cátions, como cálcio e magnésio, para dentro das células, o que sabidamente aumenta a diferenciação²⁴. O efeito líquido é a geração de mensageiros secundários que estimulam a transcrição de fatores desencadeantes de processos celulares a jusante, como migração, proliferação e^{diferenciação25}. O PBM pode ser usado para pré-condicionar as células a proliferar ou diferenciar-se antes de transplantá-las para um ambiente adverso, por exemplo, tecido danificado²⁶. A exposição de PBM (630 nm e 810 nm) de ADSCs pré e pós-transplante aumentou significativamente a viabilidade e a função dessas células in vivo em um modelo de rato diabético²⁷. A medicina regenerativa requer um número adequado de células para o reparo efetivo dos tecidos²⁸. Em cultura de células 3D, ADSCs têm sido associadas a taxas de proliferação mais lentas em comparação com cultura celular bidimensional⁶. No entanto, o PBM pode ser usado para aumentar o processo de cultura de células 3D de ADSCs, aumentando a viabilidade, proliferação, migração e diferenciação^29,30.

Protocol

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e software usados neste protocolo. O protocolo foi resumido graficamente na Figura 1. 1. Cultura celular bidimensional (2D) NOTA: Os ADSCs imortalizados (1 x106 células) são armazenados a -195,8 °C em azoto líquido num frasco para injetáveis de criopreservação contendo 1 ml de meio de co…

Representative Results

Para avaliar a morfologia e inspecionar visualmente a densidade celular dos hidrogéis, foi utilizada microscopia inversa (Figura 2). As ADSCs mantiveram uma morfologia arredondada 24 h após a semeadura e exposição ao PBM. As células foram espalhadas por todo o gel como células únicas ou em cachos semelhantes a uvas. A morfologia manteve-se inalterada após 10 dias em cultura 3D. Nenhuma diferença definitiva na morfologia foi observada entre os grupos experimentais e controles ou entr…

Discussion

As ADSCs são um tipo celular ideal para uso em medicina regenerativa, pois estimulam vários processos para auxiliar na cicatrização de feridas ^3,4. No entanto, há vários desafios que precisam ser contornados, por exemplo, baixas taxas de sobrevida e enxertia ineficaz das células em um local de^lesão9. As células imortalizadas foram utilizadas como linhagem celular comercialmente disponível, pois podem ser passadas por mais geraç?…

Materials

525 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	EN 60825-1:2007
825 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	SN 101080908ADR-1800
96 Well Strip Plates	Sigma-Aldrich	BR782301
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2942	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681	ATP reagent, Proliferation assay Kit
Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	430659	cryovial
CryoSOfree	Sigma-Aldrich	C9249	Cell freezing media
CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay	Promega	G1780	Cytotoxicity reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Media	Sigma-Aldrich	D5796	Basal medium (39 mL/44 mL)
FieldMate Laser Power Meter	Coherent	1098297
Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate	Sigma-Aldrich	CLS3370
Foetal bovine serum	Biochrom	S0615	Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H9394	Rinse solution
Heracell 150i CO2 incubator	Thermo Scientific	51026280
Heraeus Labofuge 400	Thermo Scientific	75008371	Plate spinner for 96 well plates
Heraeus Megafuge 16R centrifuge	ThermoFisher	75004270
Immortalized ADSCs	ATCC	ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000	Passage 37
Invitrogen Countess 3	Invitrogen	AMQAX2000	Automated cell counter for Trypan Blue
Julabo TW20 waterbath	Sigma-Aldrich	Z615501	Waterbath used to warm media to 37 °C
Olympus CellSens Entry	Olympus	Version 3.2 (23706)	Imaging software: digital image acquisition
Olympus CKX41	Olympus	SN9B02019	Inverted light microscope
Olympus SC30 camera	Olympus	SN57000530	Camera attached to inverted light microscope
Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates	Sigma-Aldrich	CLS3912	Opaque well used for ATP luminescence
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
SigmaPlot 12.0	Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3	Sigma-Aldrich	TRUE3-1KT	10 µL
TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution	Sigma-Aldrich	TRUEENZ	01:20
Trypan Blue Stain	Thermo Fisher – Invitrogen	T10282	0.4% solution
TrypLE Select Enzyme (1x)	Gibco	12563029	Cell detachment solution
Victor Nivo Plate Reader	Perkin Elmer	HH3522019094	Spectrophotometric plate reader