Cultivo Celular Tridimensional de Células Madre Derivadas del Temisio Adiposo en Hidrogel con Aumento de Fotobiomodulación

Summary

Aquí, presentamos un protocolo que demuestra el uso del hidrogel como un marco de cultivo celular tridimensional (3D) para el cultivo de células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) e introduce la fotobiomodulación (PBM) para mejorar la proliferación de ADSC dentro del entorno de cultivo 3D.

Abstract

Las células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC), que poseen características mesenquimales multipotentes similares a las células madre, se emplean con frecuencia en medicina regenerativa debido a su capacidad para una amplia gama de diferenciación celular y su capacidad para mejorar la migración, la proliferación y mitigar la inflamación. Sin embargo, las ADSC a menudo enfrentan desafíos en la supervivencia y el injerto dentro de las heridas, principalmente debido a condiciones inflamatorias desfavorables. Para abordar este problema, se han desarrollado hidrogeles para mantener la viabilidad de ADSC en heridas y acelerar el proceso de cicatrización de heridas. Aquí, nuestro objetivo fue evaluar el impacto sinérgico de la fotobiomodulación (PBM) en la proliferación y citotoxicidad de ADSC dentro de un marco de cultivo celular en 3D. Las ADSC inmortalizadas se sembraron en hidrogeles de 10 μL a una densidad de 2,5 x 10³ células y se sometieron a irradiación utilizando diodos de 525 nm y 825 nm a fluencias de 5 J/^cm2 y 10 J/^cm2. Se evaluaron los cambios morfológicos, la citotoxicidad y la proliferación a las 24 h y 10 días después de la exposición a PBM. Las ADSC exhibieron una morfología redondeada y se dispersaron por todo el gel como células individuales o agregados esferoides. Es importante destacar que tanto el PBM como el marco de cultivo 3D no mostraron efectos citotóxicos en las células, mientras que el PBM mejoró significativamente las tasas de proliferación de ADSC. En conclusión, este estudio demuestra el uso del hidrogel como un entorno 3D adecuado para el cultivo de ADSC e introduce el PBM como una estrategia de aumento significativa, abordando particularmente las tasas de proliferación lenta asociadas con el cultivo celular 3D.

Introduction

Las ADSC son células progenitoras mesenquimales multipotentes con la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en varios linajes celulares. Estas células pueden extraerse de la fracción vascular estromal (FSV) del tejido adiposo durante un procedimiento de lipoaspiración¹. Las ADSC se han convertido en un tipo de célula madre ideal para su uso en medicina regenerativa porque estas células son abundantes, mínimamente invasivas para la recolección, de fácil acceso y^{bien caracterizadas}. La terapia con células madre ofrece una posible vía para la cicatrización de heridas al estimular la migración celular, la proliferación, la neovascularización y la reducción de la inflamación dentro de las heridas ^3,4. Aproximadamente el 80% de la capacidad regenerativa de las ADSC es atribuible a la señalización paracrina a través de su secretoma⁵. Anteriormente, se sugirió que una inyección local directa de células madre o factores de crecimiento en el tejido dañado podría provocar suficientes mecanismos de reparación in vivo ^6,7,8. Sin embargo, este enfoque enfrentó varios desafíos, como la baja supervivencia y la reducción del injerto de células madre dentro de los tejidos dañados como resultado del ambiente inflamatorio ⁹. Además, una de las razones citadas fue la falta de una matriz extracelular que apoyara la supervivencia y funcionalidad de las células trasplantadas¹⁰. Para superar estos desafíos, ahora se está haciendo hincapié en el desarrollo de portadores de biomateriales para apoyar la viabilidad y función de las células madre.

El cultivo celular tridimensional (3D) mejora la interacción célula a célula y célula a matriz in vitro para proporcionar un entorno que se asemeje mejor al entorno in vivo ¹¹. Los hidrogeles se han estudiado ampliamente como una clase de portadores de biomateriales que proporcionan un entorno 3D para el cultivo de células madre. Estas estructuras están hechas de agua y polímeros reticulados¹². La encapsulación de ADSC en hidrogel prácticamente no tiene ningún efecto citotóxico sobre las células durante el cultivo, manteniendo la viabilidad de las células⁶. Las células madre cultivadas en 3D demuestran una mayor retención de su madre y una mayor capacidad de diferenciación¹³. Del mismo modo, las ADSC sembradas con hidrogel demostraron una mayor viabilidad y un cierre acelerado de la herida en modelos animales¹⁴. Además, la encapsulación de hidrogel aumenta significativamente el injerto y la retención de ADSC en heridas^15,16. TrueGel3D está hecho de un polímero, ya sea alcohol polivinílico o dextrano, solidificado por un reticulante, ya sea ciclodextrina o polietilenglicol¹⁷. El gel es un hidrogel sintético que no contiene ningún producto animal que pueda interferir con los experimentos o desencadenar una reacción inmune durante el trasplante del gel en un paciente, al tiempo que imita eficazmente una matriz extracelular¹⁸. El gel es totalmente personalizable modificando la composición y los componentes individuales. Puede albergar diferentes células madre y apoyar la diferenciación de varios tipos de células ajustando la rigidez del gel¹⁹. Los sitios de unión se pueden crear mediante la adición de péptidos²⁰. El gel es degradable por la secreción de metaloproteasas, lo que permite la migración celular²¹. Por último, es transparente y permite realizar técnicas de imagen.

La PBM es una forma mínimamente invasiva y fácil de realizar de terapia con láser de bajo nivel que se utiliza para estimular los cromóforos intracelulares. Diferentes longitudes de onda provocan diferentes efectos en las células²². La luz en el rango del rojo al infrarrojo cercano estimula el aumento de la producción de trifosfato de adenosina (ATP) y especies reactivas de oxígeno (ROS) al mejorar el flujo a través de la cadena de transporte de electrones²³. La luz en los rangos azul y verde estimula los canales iónicos activados por la luz, lo que permite la afluencia inespecífica de cationes, como el calcio y el magnesio, en las células, lo que se sabe que mejora la diferenciación²⁴. El efecto neto es la generación de mensajeros secundarios que estimulan la transcripción de factores que desencadenan procesos celulares posteriores como la migración, la proliferación y la diferenciación²⁵. El PBM se puede utilizar para preacondicionar las células para que proliferen o se diferencien antes de trasplantarlas a un entorno adverso, por ejemplo, tejido dañado²⁶. La exposición a PBM antes y después del trasplante (630 nm y 810 nm) de ADSC mejoró significativamente la viabilidad y la función de estas células in vivo en un modelo de rata diabética²⁷. La medicina regenerativa requiere un número adecuado de células para la reparación efectiva de los tejidos²⁸. En el cultivo celular 3D, las ADSC se han asociado con tasas de proliferación más lentas en comparación con el cultivo celular bidimensional⁶. Sin embargo, el PBM se puede utilizar para aumentar el proceso de cultivo celular 3D de las ADSC al mejorar la viabilidad, la proliferación, la migración y la diferenciación^29,30.

Protocol

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos y software utilizados en este protocolo. El protocolo se ha resumido gráficamente en la Figura 1. 1. Cultivo celular bidimensional (2D) NOTA: Los ADSC inmortalizados (1 x106 células) se almacenan a -195,8 °C en nitrógeno líquido en un vial de criopreservación que contiene 1 ml de m…

Representative Results

Para evaluar la morfología e inspeccionar visualmente la densidad celular de los hidrogeles, se utilizó microscopía inversa (Figura 2). Los ADSC conservaron una morfología redondeada 24 h después de la siembra y la exposición a PBM. Las células se dispersaron por todo el gel como células individuales o en racimos similares a uvas. La morfología se mantuvo sin cambios después de 10 días en cultivo 3D. No se observaron diferencias definitivas en la morfología entre los grupos exper…

Discussion

Las ADSC son un tipo de célula ideal para la medicina regenerativa, ya que estimulan varios procesos para ayudar en la cicatrización de heridas ^3,4. Sin embargo, hay varios desafíos que deben sortearse, por ejemplo, las bajas tasas de supervivencia y el injerto ineficaz de las células en el sitio de la lesión⁹. Las células inmortalizadas se utilizaron como una línea celular disponible comercialmente, ya que pueden pasar durante más…

Materials

525 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	EN 60825-1:2007
825 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	SN 101080908ADR-1800
96 Well Strip Plates	Sigma-Aldrich	BR782301
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2942	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681	ATP reagent, Proliferation assay Kit
Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	430659	cryovial
CryoSOfree	Sigma-Aldrich	C9249	Cell freezing media
CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay	Promega	G1780	Cytotoxicity reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Media	Sigma-Aldrich	D5796	Basal medium (39 mL/44 mL)
FieldMate Laser Power Meter	Coherent	1098297
Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate	Sigma-Aldrich	CLS3370
Foetal bovine serum	Biochrom	S0615	Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H9394	Rinse solution
Heracell 150i CO2 incubator	Thermo Scientific	51026280
Heraeus Labofuge 400	Thermo Scientific	75008371	Plate spinner for 96 well plates
Heraeus Megafuge 16R centrifuge	ThermoFisher	75004270
Immortalized ADSCs	ATCC	ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000	Passage 37
Invitrogen Countess 3	Invitrogen	AMQAX2000	Automated cell counter for Trypan Blue
Julabo TW20 waterbath	Sigma-Aldrich	Z615501	Waterbath used to warm media to 37 °C
Olympus CellSens Entry	Olympus	Version 3.2 (23706)	Imaging software: digital image acquisition
Olympus CKX41	Olympus	SN9B02019	Inverted light microscope
Olympus SC30 camera	Olympus	SN57000530	Camera attached to inverted light microscope
Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates	Sigma-Aldrich	CLS3912	Opaque well used for ATP luminescence
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
SigmaPlot 12.0	Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3	Sigma-Aldrich	TRUE3-1KT	10 µL
TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution	Sigma-Aldrich	TRUEENZ	01:20
Trypan Blue Stain	Thermo Fisher – Invitrogen	T10282	0.4% solution
TrypLE Select Enzyme (1x)	Gibco	12563029	Cell detachment solution
Victor Nivo Plate Reader	Perkin Elmer	HH3522019094	Spectrophotometric plate reader