Dreidimensionale Zellkultur von aus Fett gewonnenen Stammzellen in einem Hydrogel mit Photobiomodulationsaugmentation

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Verwendung von Hydrogel als dreidimensionales (3D) Zellkulturgerüst für die ADSC-Kultur (Adipose-Derived Stem Cells) demonstriert und Photobiomodulation (PBM) einführt, um die Proliferation von ADSCs innerhalb der 3D-Kulturumgebung zu verbessern.

Abstract

Aus Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ADSCs), die multipotente mesenchymale Eigenschaften ähnlich wie Stammzellen besitzen, werden häufig in der regenerativen Medizin eingesetzt, da sie eine Vielzahl von Zelldifferenzierungen ermöglichen und die Migration und Proliferation verbessern und Entzündungen lindern können. ADSCs stehen jedoch oft vor Herausforderungen beim Überleben und der Transplantation in Wunden, vor allem aufgrund ungünstiger entzündlicher Bedingungen. Um dieses Problem anzugehen, wurden Hydrogele entwickelt, um die Lebensfähigkeit von ADSC in Wunden zu erhalten und den Wundheilungsprozess zu beschleunigen. Hier wollten wir den synergistischen Einfluss der Photobiomodulation (PBM) auf die ADSC-Proliferation und Zytotoxizität innerhalb eines 3D-Zellkulturrahmens bewerten. Immortalisierte ADSCs wurden in 10-μl-Hydrogele mit einer Dichte von 2,5 x 10³ Zellen ausgesät und mit 525-nm- und 825-nm-Dioden bei Fluenzen von 5 J/^cm2 und 10 J/^cm2 bestrahlt. Morphologische Veränderungen, Zytotoxizität und Proliferation wurden 24 Stunden und 10 Tage nach der PBM-Exposition bewertet. Die ADSCs wiesen eine abgerundete Morphologie auf und waren als einzelne Zellen oder Sphäroidaggregate über das Gel verteilt. Wichtig ist, dass sowohl PBM als auch 3D-Kulturrahmen keine zytotoxischen Wirkungen auf die Zellen zeigten, während PBM die Proliferationsraten von ADSCs signifikant erhöhte. Zusammenfassend zeigt diese Studie die Verwendung von Hydrogel als geeignete 3D-Umgebung für die ADSC-Kultur und führt PBM als signifikante Augmentationsstrategie ein, die insbesondere die langsamen Proliferationsraten im Zusammenhang mit 3D-Zellkulturen berücksichtigt.

Introduction

ADSCs sind mesenchymale multipotente Vorläuferzellen mit der Fähigkeit, sich selbst zu erneuern und in mehrere Zelllinien zu differenzieren. Diese Zellen können während eines Lipoaspirationsverfahrens aus der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) des Fettgewebes entnommen werden¹. ADSCs haben sich als idealer Stammzelltyp für den Einsatz in der regenerativen Medizin herausgestellt, da diese Zellen reichlich vorhanden, minimalinvasiv zu ernten, leicht zugänglich und gut charakterisiert sind². Die Stammzelltherapie bietet einen möglichen Weg zur Wundheilung, indem sie die Zellmigration, Proliferation, Neovaskularisation stimuliert und Entzündungen in Wunden reduziert ^3,4. Etwa 80 % der Regenerationskapazität von ADSCs sind auf die parakrine Signalübertragung über ihr Sekretom^{zurückzuführen 5}. Zuvor wurde vorgeschlagen, dass eine direkte lokale Injektion von Stammzellen oder Wachstumsfaktoren in geschädigtes Gewebe ausreichende In-vivo-Reparaturmechanismen verhindern könnte ^6,7,8. Dieser Ansatz war jedoch mit mehreren Herausforderungen verbunden, wie z. B. einem schlechten Überleben und einer reduzierten Stammzelltransplantation in geschädigtem Gewebe als Folge der entzündlichen Umgebung ⁹. Darüber hinaus war einer der genannten Gründe das Fehlen einer extrazellulären Matrix, um das Überleben und die Funktionalität der transplantierten Zellen zu unterstützen¹⁰. Um diese Herausforderungen zu meistern, liegt der Schwerpunkt nun auf der Entwicklung von Biomaterialträgern zur Unterstützung der Lebensfähigkeit und Funktion von Stammzellen.

Dreidimensionale (3D) Zellkulturen verbessern die Zell-zu-Zell- und Zell-zu-Matrix-Interaktion in vitro, um eine Umgebung zu schaffen, die der In-vivo-Umgebung besser ähnelt¹¹. Hydrogele wurden ausgiebig als eine Klasse von Biomaterialträgern untersucht, die eine 3D-Umgebung für die Stammzellkultur bieten. Diese Strukturen bestehen aus Wasser und vernetzten Polymeren¹². Die Verkapselung von ADSCs in Hydrogel hat während der Kultur praktisch keine zytotoxische Wirkung auf die Zellen, während die Lebensfähigkeit der Zellen erhalten^{bleibt 6}. In 3D kultivierte Stammzellen zeigen eine verbesserte Beibehaltung ihrer Stammzellen und eine verbesserte Differenzierungsfähigkeit¹³. In ähnlicher Weise zeigten Hydrogel-ausgesäte ADSCs in Tiermodellen eine erhöhte Lebensfähigkeit und einen beschleunigten Wundverschluss¹⁴. Darüber hinaus erhöht die Hydrogelverkapselung die Transplantation und Retention von ADSCs in Wunden signifikant^15,16. TrueGel3D besteht aus einem Polymer, entweder Polyvinylalkohol oder Dextran, das durch einen Vernetzer, entweder Cyclodextrin oder Polyethylenglykol¹⁷, verfestigt wird. Das Gel ist ein synthetisches Hydrogel, das keine tierischen Produkte enthält, die die Experimente stören oder eine Immunreaktion während der Transplantation des Gels in einen Patienten auslösen könnten, während es effektiv eine extrazelluläre Matrix nachahmt¹⁸. Das Gel ist vollständig anpassbar, indem die Zusammensetzung und die einzelnen Komponenten geändert werden. Es kann verschiedene Stammzellen beherbergen und die Differenzierung mehrerer Zelltypen unterstützen, indem es die Steifigkeit des Gels¹⁹ anpasst. Bindungsstellen können durch Zugabe von Peptiden²⁰ erzeugt werden. Das Gel ist durch die Sekretion von Metalloproteasen abbaubar, was eine Zellmigration ermöglicht²¹. Schließlich ist es klar und ermöglicht bildgebende Verfahren.

PBM ist eine minimalinvasive und einfach durchzuführende Form der Low-Level-Lasertherapie zur Stimulation intrazellulärer Chromophore. Unterschiedliche Wellenlängen erzeugen unterschiedliche Wirkungen auf Zellen²². Licht im roten bis nahen Infrarotbereich stimuliert eine erhöhte Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) und reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), indem es den Fluss durch die Elektronentransportkette erhöht²³. Licht im blauen und grünen Bereich stimuliert lichtgesteuerte Ionenkanäle und ermöglicht den unspezifischen Einstrom von Kationen wie Kalzium und Magnesium in die Zellen, was bekanntermaßen die Differenzierung verbessert²⁴. Der Nettoeffekt ist die Erzeugung von sekundären Botenstoffen, die die Transkription von Faktoren stimulieren, die nachgelagerte zelluläre Prozesse wie Migration, Proliferation und Differenzierung auslösen²⁵. PBM kann verwendet werden, um Zellen für die Proliferation oder Differenzierung vorzukonditionieren, bevor die Zellen in eine ungünstige Umgebung, z. B. beschädigtes Gewebe, transplantiert werden²⁶. Die PBM-Exposition vor und nach der Transplantation (630 nm und 810 nm) von ADSCs verbesserte die Lebensfähigkeit und Funktion dieser Zellen in vivo in einem diabetischen Rattenmodell signifikant²⁷. Die regenerative Medizin benötigt eine ausreichende Anzahl von Zellen für eine effektive Reparatur von Geweben²⁸. In der 3D-Zellkultur wurden ADSCs mit langsameren Proliferationsraten im Vergleich zu zweidimensionalen Zellkulturen in Verbindung gebracht⁶. PBM kann jedoch verwendet werden, um den 3D-Zellkulturprozess von ADSCs zu verbessern, indem es die Lebensfähigkeit, Proliferation, Migration und Differenzierung verbessert^29,30.

Protocol

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden. Das Protokoll ist in Abbildung 1 grafisch zusammengefasst. 1. Zweidimensionale (2D) Zellkultur HINWEIS: Immortalisierte ADSCs (1 x106 Zellen) werden bei -195,8 °C in flüssigem Stickstoff in einem Kryokonservierungsfläschchen mit 1 ml Zellgefriermedium ge…

Representative Results

Um die Morphologie zu beurteilen und die Zelldichte der Hydrogele visuell zu untersuchen, wurde die inverse Mikroskopie verwendet (Abbildung 2). Die ADSCs behielten 24 Stunden nach der Aussaat und PBM-Exposition eine abgerundete Morphologie bei. Die Zellen waren als Einzelzellen oder in traubenartigen Clustern über das Gel verstreut. Die Morphologie war nach 10 Tagen in 3D-Kultur unverändert. Es wurde kein eindeutiger Unterschied in der Morphologie zwischen den Versuchsgruppen und Kontroll…

Discussion

ADSCs sind ein idealer Zelltyp für die regenerative Medizin, da sie verschiedene Prozesse stimulieren, um die Wundheilung zu unterstützen ^3,4. Es gibt jedoch mehrere Herausforderungen, die umgangen werden müssen, z. B. schlechte Überlebensraten und eine ineffektive Transplantation der Zellen an einer Verletzungsstelle⁹. Immortalisierte Zellen wurden als kommerziell erhältliche Zelllinie verwendet, da sie im Vergleich zu Primärzellen …

Materials

525 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	EN 60825-1:2007
825 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	SN 101080908ADR-1800
96 Well Strip Plates	Sigma-Aldrich	BR782301
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2942	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681	ATP reagent, Proliferation assay Kit
Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	430659	cryovial
CryoSOfree	Sigma-Aldrich	C9249	Cell freezing media
CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay	Promega	G1780	Cytotoxicity reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Media	Sigma-Aldrich	D5796	Basal medium (39 mL/44 mL)
FieldMate Laser Power Meter	Coherent	1098297
Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate	Sigma-Aldrich	CLS3370
Foetal bovine serum	Biochrom	S0615	Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H9394	Rinse solution
Heracell 150i CO2 incubator	Thermo Scientific	51026280
Heraeus Labofuge 400	Thermo Scientific	75008371	Plate spinner for 96 well plates
Heraeus Megafuge 16R centrifuge	ThermoFisher	75004270
Immortalized ADSCs	ATCC	ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000	Passage 37
Invitrogen Countess 3	Invitrogen	AMQAX2000	Automated cell counter for Trypan Blue
Julabo TW20 waterbath	Sigma-Aldrich	Z615501	Waterbath used to warm media to 37 °C
Olympus CellSens Entry	Olympus	Version 3.2 (23706)	Imaging software: digital image acquisition
Olympus CKX41	Olympus	SN9B02019	Inverted light microscope
Olympus SC30 camera	Olympus	SN57000530	Camera attached to inverted light microscope
Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates	Sigma-Aldrich	CLS3912	Opaque well used for ATP luminescence
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
SigmaPlot 12.0	Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3	Sigma-Aldrich	TRUE3-1KT	10 µL
TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution	Sigma-Aldrich	TRUEENZ	01:20
Trypan Blue Stain	Thermo Fisher – Invitrogen	T10282	0.4% solution
TrypLE Select Enzyme (1x)	Gibco	12563029	Cell detachment solution
Victor Nivo Plate Reader	Perkin Elmer	HH3522019094	Spectrophotometric plate reader