Construção de redes metabólicas fora de equilíbrio em vesículas nanométricas e micrométricas

Summary

Apresentamos um protocolo para reconstituição de proteínas de membrana e encapsulamento de enzimas e outros componentes solúveis em água em vesículas lipídicas de tamanho submicrométrico e micrométrico.

Abstract

Apresentamos um método para incorporar em vesículas redes complexas de proteínas, envolvendo proteínas integrais de membrana, enzimas e sensores baseados em fluorescência, usando componentes purificados. Este método é relevante para o projeto e construção de biorreatores e o estudo de redes complexas de reações metabólicas fora de equilíbrio. Começamos reconstituindo (múltiplas) proteínas de membrana em grandes vesículas unilamelares (LUVs) de acordo com um protocolo desenvolvido anteriormente. Em seguida, encapsulamos uma mistura de enzimas purificadas, metabólitos e sensores baseados em fluorescência (proteínas fluorescentes ou corantes) por meio de congelamento-descongelamento-extrusão e removemos componentes não incorporados por centrifugação e/ou cromatografia de exclusão de tamanho. O desempenho das redes metabólicas é medido em tempo real monitorando a relação ATP / ADP, concentração de metabólitos, pH interno ou outros parâmetros por leitura de fluorescência. Nossas vesículas contendo proteínas de membrana de 100-400 nm de diâmetro podem ser convertidas em vesículas unilamelares gigantes (GUVs), usando procedimentos existentes, mas otimizados. A abordagem permite a inclusão de componentes solúveis (enzimas, metabólitos, sensores) em vesículas de tamanho micrométrico, aumentando assim o volume dos biorreatores em ordens de magnitude. A rede metabólica contendo GUVs é aprisionada em dispositivos microfluídicos para análise por microscopia óptica.

Introduction

O campo da biologia sintética de baixo para cima concentra-se na construção de células (mínimas) ^1,2 e biorreatores metabólicos para fins biotecnológicos ^3,4 ou biomédicos ^5,6,7,8. A construção de células sintéticas fornece uma plataforma única que permite aos pesquisadores estudar proteínas (de membrana) em condições bem definidas, imitando as de ambientes nativos, permitindo a descoberta de propriedades emergentes e funções bioquímicas ocultas de proteínas e redes de reação⁹. Como um passo intermediário em direção a uma célula sintética que funciona de forma autônoma, são desenvolvidos módulos que capturam características essenciais das células vivas, como conservação de energia metabólica, síntese de proteínas e lipídios e homeostase. Esses módulos não apenas aprimoram nossa compreensão da vida, mas também têm aplicações potenciais nos campos da medicina⁸ e da biotecnologia¹⁰.

As proteínas transmembranares estão no centro de praticamente qualquer rede metabólica, pois transportam moléculas para dentro ou para fora da célula, sinalizam e respondem à qualidade do ambiente e desempenham vários papéis biossintéticos. Assim, a engenharia de módulos metabólicos em células sintéticas requer, na maioria dos casos, a reconstituição de proteínas integrais e/ou periféricas da membrana em uma bicamada de membrana composta por lipídios específicos e de alta integridade (baixa permeabilidade). O manuseio dessas proteínas de membrana é desafiador e requer conhecimentos específicos e habilidades experimentais.

Vários métodos foram desenvolvidos para reconstituir proteínas de membrana dentro de vesículas fosfolipídicas, na maioria das vezes com o objetivo de estudar a função^11,12, regulação¹³, propriedades cinéticas^14,15, dependência lipídica^15,16 e/ou estabilidade¹⁷ de uma proteína específica. Esses métodos envolvem a rápida diluição da proteína solubilizada em detergente em meio aquoso na presença de lipídios¹⁸, a remoção de detergentes pela incubação de proteínas solubilizadas em detergente com vesículas lipídicas desestabilizadas por detergente e a absorção do(s) detergente(s) em esferas de poliestireno¹⁹, ou a remoção de detergentes por diálise ou cromatografia de exclusão de tamanho²⁰. Solventes orgânicos têm sido usados para formar vesículas lipídicas, por exemplo, através da formação de interfases óleo-água²¹, mas a maioria das proteínas integrais da membrana são inativadas quando expostas a esses solventes.

Em nosso laboratório, reconstituímos principalmente proteínas de membrana pelo método de absorção de detergente para formar grandes vesículas unilamelares (LUVs) ¹⁹ . Esse método permite a co-reconstituição de múltiplas proteínas de membrana e a encapsulação no lúmen da vesícula de enzimas, metabólitos e sondas^22,23. As LUVs contendo proteínas de membrana podem ser convertidas em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) com/sem encapsulamento de componentes solúveis em água, usando eletroformação²⁴ ou inchaço assistido por gel²⁵ e condições específicas para preservar a integridade das proteínas de membrana²⁶.

Este trabalho apresenta um protocolo para a reconstituição em LUVs de uma rede metabólica fora de equilíbrio que regenera ATP através da quebra de L-arginina em L-ornitina²⁷. A formação de ATP está associada à produção de glicerol-3-fosfato (G3P), um importante bloco de construção para a síntese de fosfolipídios^22,28. A via metabólica consiste em duas proteínas integrais da membrana, uma arginina/ornitina (ArcD) e um antiportador G3P/Pi (GlpT). Além disso, três enzimas solúveis (ArcA, ArcB, ArcC) são necessárias para a reciclagem de ATP, e GlpK é usado para converter glicerol em glicerol 3-fosfato, usando o ATP da quebra de L-arginina, consulte a Figura 1 para uma visão geral esquemática da via. Este protocolo representa um bom ponto de partida para a futura construção de redes de reação ainda mais complexas – para a síntese de lipídios ou proteínas ou a divisão de células. A composição lipídica das vesículas suporta a atividade de uma ampla variedade de proteínas integrais da membrana e foi otimizada para o transporte de diversas moléculas para dentro ou para fora das vesículas 27,29,30.

Figura 1: Visão geral da via de produção de ATP e síntese e excreção de glicerol 3-fosfato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em suma, proteínas de membrana purificadas (solubilizadas em dodecil-β-D-maltosídeo, DDM) são adicionadas a vesículas lipídicas pré-formadas que foram desestabilizadas com Triton X-100, o que permite a inserção das proteínas na membrana. As moléculas de detergente são subsequentemente (lentamente) removidas pela adição de esferas de poliestireno ativadas, resultando na formação de proteolipossomas bem selados. Os componentes solúveis podem então ser adicionados às vesículas e encapsulados por meio de ciclos de congelamento e descongelamento, que prendem as moléculas no processo de fusão da membrana. As vesículas obtidas são altamente heterogêneas e muitas são multilamelares. Eles são então extrudados através de um filtro de policarbonato com um tamanho de poro de 400, 200 ou 100 nm, o que produz vesículas de tamanho mais uniforme; Quanto menor o tamanho dos poros, mais homogêneas e unilamelares são as vesículas, mas ao preço de um volume interno menor. As proteínas não incorporadas e as pequenas moléculas são removidas da solução externa por cromatografia de exclusão por tamanho. Os proteoLUVs podem ser convertidos em vesículas de tamanho micrométrico por inchaço assistido por gel, e esses proteoGUVs são então coletados e presos em um chip microfluídico para caracterização e manipulação microscópica. A Figura 2 mostra uma visão geral esquemática do protocolo completo.

Figura 2: Visão geral do protocolo para reconstituição de proteínas de membrana e encapsulamento de enzimas e componentes solúveis em água em vesículas lipídicas de tamanho submicrométrico (LUVs) e micrométrico (GUVs). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os protocolos de reconstituição e encapsulamento funcionam bem e a funcionalidade das proteínas é mantida, mas os proteoLUVs e proteoGUVs são heterogêneos em tamanho. As abordagens microfluídicas^31,32 permitem a formação de vesículas do tamanho de micrômetros que são mais homogêneas em tamanho, mas a reconstituição funcional das proteínas da membrana geralmente não é possível porque o solvente residual na bicamada inativa as proteínas. Os proteoLUVs variam em tamanho de 100 a 400 nm e, em baixas concentrações de enzimas, o encapsulamento pode levar a vesículas com vias metabólicas incompletas (efeitos estocásticos; ver Figura 3). Os LUVs são ideais para a construção de módulos metabólicos específicos, como mostrado aqui para a produção de ATP e blocos de construção como G3P. Tais proteoLUVs podem potencialmente ser encapsulados em GUVs e servir como compartimentos semelhantes a organelas para as vesículas hospedeiras.

Figura 3: Número de moléculas por vesícula com diâmetro de 100, 200 ou 400 nm. (A) Quando as proteínas encapsuladas (enzimas, sondas) estão na faixa de 1-10 μM. (B) A reconstituição é feita em 1 a 1.000, 1 a 10.000 e 1 a 100.000 proteínas de membrana por lipídio (mol / mol). Assumimos que as moléculas são encapsuladas nas concentrações indicadas e incorporadas na membrana nessas proporções proteína-lipídio. Para algumas enzimas, vimos que elas se ligam às membranas, o que pode aumentar sua concentração aparente nas vesículas. Abreviatura: LPR = Proporção Lipídio-Proteína Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

1. Preparação geral Produtos químicosDissolver os lípidos (em pó) a 25 mg/ml em CHCl3 para a produção de lipossomas pré-formados.NOTA: É preferível preparar estoques de lipídios frescos, mas as soluções de estoque também podem ser armazenadas a -20 °C por algumas semanas. Trabalhar com lipídios na forma de pó é mais preciso do que usar lipídios já solubilizados em CHCl3. O CHCl3 deve ser manuseado com pipetas e/ou seringas de vidr…

Representative Results

A reconstituição de proteínas de membrana solubilizadas em lipossomas requer a desestabilização de vesículas pré-formadas. A adição de pequenas quantidades de Triton X-100 resulta inicialmente em um aumento da absorbância a 540 nm (A540) devido a um aumento no espalhamento da luz pelo inchaço das vesículas (Figura 4). O valor máximo de A540 é o ponto em que os lipossomas são saturados com detergente (Rsat), após o qual qualquer adiç?…

Discussion

Apresentamos um protocolo para a síntese de proteínas (de membrana) contendo vesículas lipídicas de tamanho submicrométrico (proteoLUVs) e a conversão de proteoLUVs em vesículas unilamelares gigantes (proteoGUVs). O protocolo deve ser aplicável para a reconstituição de outras proteínas de membrana 13,19,30,40 e o encapsulamento de redes metabólicas diferentes das vias de degradação da L-arginina e síntese de glicerol 3-fosfato aqui apresentadas.<su…

Materials

Agarose	Sigma Aldrich	A9414-25g
Amicon cut-off filter	Sigma Aldrich	Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra
BioBeads	BioRad	152-3920
CHCl3	Macron Fine Chemicals	MFCD00000826
D(+)-Glucose	Formedium	–
D(+)-Sucrose	Formedium	–
DDM	Glycon	D97002 -C
Diethyl Ether	Biosolve	52805
DMSO	Sigma-Aldrich	276855-100ml
DOPC	Avanti	850375P-1g
DOPE	Avanti	850725P-1g
DOPG	Avanti	840475P-1g
DTT	Formedium	DTT005
EtOH	J.T.Baker Avantor	MFCD00003568
Extruder	Avestin Inc	LF-1
Fluorimeter	Jasco	Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol	BOOM	51171608
Gravity flow column	Bio-Rad	732-1010
Hamilton syringe 100 µL	Hamilton	7656-01
Hamilton syringe 1000 µL	Hamilton	81320
Handheld LCP dispenser	Art Robbins Instruments	620-411-00
Handheld Sonicator	Hielscher Ultrasound Technology	UP50H
HCl	BOOM	x76021889.1000
Imidazole	Roth	X998.4-250g
K2HPO4	Supelco	1.05099.1000
KCl	BOOM	76028270.1
KH2PO4	Supelco	1.04873.1000
Kimwipe	Kimtech Science	7552
Large Falcon tube centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810 R
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A5006-100G
Light microscope	Leica	DM LS2
L-Ornithine	Roth	T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope	Zeiss	LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-1KG
Microfluidic chip	Homemade	PDMS based	DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP	Sigma-Aldrich	A2754-1G
NaCl	Supelco	1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer	Isogen Life Science	ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH	Supelco	1.06498.1000
Needles for GUVs	Henke-Ject	14-14575	27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics	Henke-Ject	14-15538	18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose	Cytiva	17526802
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143-5MG
Nutator	VWR	83007-210
Osmolality meter	Gonotec Salmenkipp	Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner	Plasma Etch	PE-Avenger
Polycarbonate filter	Cytiva Whatman	Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104	0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube	Beckman Coulter	355647
Pyranine	Acros Organics	H1529-1G
Quartz cuvette (black)	Hellma Analytics	108B-10-40
Sephadex G-75 resin	GE Healthcare	17-0050-01
Sonicator	Sonics Sonics & Materials INC	Sonics vibra cell
Syringe filter	Sarstedt	Filtropur S plus 0.2	0.2 µm
Syringe pump	Harvard Apparatus	A-42467
Tabletop centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418
Teflon spacer	Homemade	Teflon based	45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris	PanReac AppliChem	A1086.1000
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-100 ml
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima Max-E
UV lamp	Spectroline	ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer	Jasco	V730 spectrophotometer
Valinomycin	Sigma-Aldrich	V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope	Zeiss	AxioObserver
β-Casein	Sigma Aldrich	C5890-500g