بناء شبكات التمثيل الغذائي خارج التوازن في حويصلات بحجم النانو والميكرومتر
Summary
نقدم بروتوكولا لإعادة تكوين بروتينات الغشاء وتغليف الإنزيمات والمكونات الأخرى القابلة للذوبان في الماء في حويصلات دهنية بحجم دون ميكرومتر وميكرومتر.
Abstract
نقدم طريقة لدمج شبكات البروتين المعقدة في الحويصلات ، والتي تتضمن بروتينات غشائية متكاملة ، وإنزيمات ، وأجهزة استشعار قائمة على التألق ، باستخدام مكونات منقاة. هذه الطريقة مناسبة لتصميم وبناء المفاعلات الحيوية ودراسة شبكات التفاعل الأيضي المعقدة خارج التوازن. نبدأ بإعادة تكوين بروتينات غشائية (متعددة) إلى حويصلات كبيرة أحادية الصفيحة (LUVs) وفقا لبروتوكول تم تطويره مسبقا. ثم نقوم بتغليف خليط من الإنزيمات المنقاة والمستقلبات وأجهزة الاستشعار القائمة على التألق (البروتينات أو الأصباغ الفلورية) عن طريق التجميد والذوبان والبثق وإزالة المكونات غير المدمجة عن طريق الطرد المركزي و / أو كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. يتم قياس أداء الشبكات الأيضية في الوقت الفعلي من خلال مراقبة نسبة ATP / ADP أو تركيز المستقلب أو الأس الهيدروجيني الداخلي أو المعلمات الأخرى عن طريق قراءات مضان. يمكن تحويل حويصلاتنا الغشائية المحتوية على البروتين بقطر 100-400 نانومتر إلى حويصلات عملاقة أحادية الصفيحة (GUVs) ، باستخدام الإجراءات الحالية ولكن المحسنة. يتيح هذا النهج إدراج المكونات القابلة للذوبان (الإنزيمات والمستقلبات وأجهزة الاستشعار) في حويصلات بحجم ميكرومتر ، وبالتالي زيادة حجم المفاعلات الحيوية بأوامر من حيث الحجم. يتم احتجاز الشبكة الأيضية التي تحتوي على GUVs في أجهزة الموائع الدقيقة لتحليلها بواسطة المجهر الضوئي.
Introduction
يركز مجال البيولوجيا التركيبية من أسفل إلى أعلى على بناء الخلايا (الحد الأدنى) 1,2 والمفاعلات الحيوية الأيضية للتكنولوجيا الحيوية 3,4 أو الأغراض الطبية الحيوية 5,6,7,8. يوفر بناء الخلايا الاصطناعية منصة فريدة تسمح للباحثين بدراسة البروتينات (الغشائية) في ظروف محددة جيدا تحاكي تلك الموجودة في البيئات الأصلية ، مما يتيح اكتشاف الخصائص الناشئة والوظائف الكيميائية الحيوية المخفية للبروتينات وشبكات التفاعل9. كخطوة وسيطة نحو خلية اصطناعية تعمل بشكل مستقل ، يتم تطوير وحدات تلتقط السمات الأساسية للخلايا الحية مثل الحفاظ على الطاقة الأيضية ، وتخليق البروتين والدهون ، والتوازن. هذه الوحدات لا تعزز فهمنا للحياة فحسب ، بل لها أيضا تطبيقات محتملة في مجالات الطب8 والتكنولوجيا الحيوية10.
تقع البروتينات عبر الغشاء في قلب أي شبكة أيضية تقريبا لأنها تنقل الجزيئات داخل الخلية أو خارجها ، وتشير ، وتستجيب لجودة البيئة ، وتلعب العديد من أدوار التخليق الحيوي. وبالتالي ، فإن هندسة الوحدات الأيضية في الخلايا الاصطناعية تتطلب في معظم الحالات إعادة تكوين بروتينات الغشاء المتكاملة و / أو المحيطية في طبقة ثنائية غشائية تتكون من دهون محددة وسلامة عالية (نفاذية منخفضة). يمثل التعامل مع هذه البروتينات الغشائية تحديا ويتطلب معرفة محددة ومهارات تجريبية.
تم تطوير عدة طرق لإعادة تكوين البروتينات الغشائية داخل حويصلات الفوسفوليبيد ، غالبا بهدف دراسة الوظيفة11،12 ، والتنظيم13 ، والخصائص الحركية14،15 ، والاعتماد على الدهون15،16 ، و / أو الاستقرار17 لبروتين معين. تتضمن هذه الطرق التخفيف السريع للبروتين القابل للذوبان في المنظفات في وسط مائي في وجود الدهون18 ، وإزالة المنظفات عن طريق احتضان البروتين القابل للذوبان في المنظفات مع حويصلات دهنية غير مستقرة المنظفات وامتصاص المنظف (المنظفات) على حبات البوليسترين19 ، أو إزالة المنظفات عن طريق غسيل الكلى أو كروماتوغرافيا استبعاد الحجم20. تم استخدام المذيبات العضوية لتشكيل حويصلات دهنية ، على سبيل المثال ، عن طريق تكوين الأطوار البينية بين الزيتوالماء 21 ، ولكن غالبية البروتينات الغشائية المتكاملة يتم تعطيلها عند تعرضها لهذه المذيبات.
في مختبرنا ، نقوم في الغالب بإعادة تكوين البروتينات الغشائية بطريقة امتصاص المنظفات لتشكيل حويصلات كبيرة أحادية الصفيحة (LUVs) 19. تسمح هذه الطريقة بإعادة التكوين المشترك لبروتينات غشائية متعددة وتغليف في تجويف الحويصلة للإنزيمات والمستقلبات والمجسات22,23. يمكن تحويل LUVs المحتوية على البروتين الغشائي إلى حويصلات عملاقة أحادية الصفيحة (GUVs) مع / بدون تغليف المكونات القابلة للذوبان في الماء ، إما باستخدام التكوين الكهربائي24 أو التورم بمساعدة الهلام25 وظروف محددة للحفاظ على سلامة بروتينات الغشاء26.
تقدم هذه الورقة بروتوكولا لإعادة تكوين شبكة التمثيل الغذائي خارج التوازن في LUVs التي تجدد ATP من خلال انهيار L-arginine إلى L-ornithine27. يقترن تكوين ATP بإنتاج الجلسرين -3 فوسفات (G3P) ، وهو لبنة بناء مهمة لتخليق الفوسفوليبيد22,28. يتكون المسار الأيضي من بروتينين غشائيين متكاملين ، أرجينين / أورنيثين (ArcD) ومضاد G3P / Pi (GlpT). بالإضافة إلى ذلك ، هناك حاجة إلى ثلاثة إنزيمات قابلة للذوبان (ArcA ، ArcB ، ArcC) لإعادة تدوير ATP ، ويستخدم GlpK لتحويل الجلسرين إلى جلسرين 3-فوسفات ، باستخدام ATP من انهيار L-arginine ، انظر الشكل 1 للحصول على نظرة عامة تخطيطية للمسار. يمثل هذا البروتوكول نقطة انطلاق جيدة للبناء المستقبلي لشبكات تفاعل أكثر تعقيدا – لتخليق الدهون أو البروتينات أو تقسيم الخلايا. يدعم التركيب الدهني للحويصلات نشاط مجموعة واسعة من البروتينات الغشائية المتكاملة وقد تم تحسينه لنقل جزيئات متنوعة داخل أو خارج الحويصلات27،29،30.
الشكل 1: نظرة عامة على مسار إنتاج الأدينوسين الثلاثي الفوسفات وتخليق وإفراز الجليسرول 3-فوسفات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
باختصار ، تضاف بروتينات الغشاء المنقى (القابلة للذوبان في دوديسيل β-د-مالتوسيد ، DDM) إلى حويصلات الدهون المشكلة مسبقا والتي تم زعزعة استقرارها باستخدام Triton X-100 ، مما يسمح بإدخال البروتينات في الغشاء. تتم إزالة جزيئات المنظفات لاحقا (ببطء) عن طريق إضافة حبات البوليسترين المنشط ، مما يؤدي إلى تكوين بروتيليبوزومات محكمة الغلق. يمكن بعد ذلك إضافة المكونات القابلة للذوبان إلى الحويصلات وتغليفها عبر دورات التجميد والذوبان ، والتي تحبس الجزيئات في عملية اندماج الغشاء. الحويصلات التي تم الحصول عليها غير متجانسة للغاية والعديد منها متعدد الصفائح. ثم يتم بثقها من خلال مرشح من البولي كربونات بحجم مسام 400 أو 200 أو 100 نانومتر ، مما ينتج عنه حويصلات ذات حجم أكثر اتساقا ؛ كلما كان حجم المسام أصغر ، كانت الحويصلات أكثر تجانسا وأحادية الصفيحة ولكن بسعر حجم داخلي أصغر. تتم إزالة البروتينات غير المدمجة والجزيئات الصغيرة من المحلول الخارجي عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. يمكن تحويل البروتيوLUVs إلى حويصلات بحجم ميكرومتر عن طريق التورم بمساعدة الهلام ، ثم يتم جمع هذه البروتيو GUVs واحتجازها في رقاقة الموائع الدقيقة للتوصيف المجهري والمعالجة. يوضح الشكل 2 نظرة عامة تخطيطية للبروتوكول الكامل.
الشكل 2: نظرة عامة على بروتوكول إعادة تكوين البروتينات الغشائية وتغليف الإنزيمات والمكونات القابلة للذوبان في الماء في الحويصلات الدهنية ذات الميكرومتر الفرعي (LUVs) وحجم الميكرومتر (GUVs). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
تعمل بروتوكولات إعادة التكوين والتغليف بشكل جيد ويتم الاحتفاظ بوظائف البروتينات ، لكن البروتيوLUVs و proteoGUVs غير متجانسة في الحجم. تسمح مناهج الموائع الدقيقة31,32 بتكوين حويصلات بحجم ميكرومتر تكون أكثر تجانسا في الحجم ، لكن إعادة التكوين الوظيفي لبروتينات الغشاء غير ممكنة بشكل عام لأن المذيب المتبقي في الطبقة الثنائية يعطل البروتينات. يتراوح حجم البروتيوLUVs من 100 إلى 400 نانومتر ، وعند تركيزات منخفضة من الإنزيمات ، قد يؤدي التغليف إلى حويصلات ذات مسارات أيضية غير مكتملة (التأثيرات العشوائية ؛ انظر الشكل 3). تعد LUVs مثالية لبناء وحدات أيضية محددة ، كما هو موضح هنا لإنتاج ATP وكتل البناء مثل G3P. يمكن تغليف هذه البروتيوLUVs في GUVs وتعمل كمقصورات تشبه العضيات للحويصلات المضيفة.
الشكل 3: عدد الجزيئات لكل حويصلة قطرها 100 أو 200 أو 400 نانومتر. أ: عندما تكون البروتينات المغلفة (الإنزيمات، المجسات) في نطاق 1-10 ميكرومتر. (ب) تتم إعادة التكوين عند 1 إلى 1000 ، ومن 1 إلى 10000 ، ومن 1 إلى 10000 ، ومن 1 إلى 100000 بروتين غشائي لكل ليبيد (مول / مول). نفترض أن الجزيئات مغلفة بالتركيزات المشار إليها ومدمجة في الغشاء بنسب البروتين إلى الدهون هذه. بالنسبة لبعض الإنزيمات، رأينا أنها ترتبط بالأغشية، وهو ما قد يزيد من تركيزها الظاهري في الحويصلات. اختصار: LPR = نسبة البروتين الدهني الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم بروتوكولا لتخليق البروتين (الغشائي) الذي يحتوي على حويصلات دهنية بحجم أقل من ميكرومتر (proteoLUVs) ، وتحويل البروتينات LUVs إلى حويصلات عملاقة أحادية الصفيحة (proteoGUVs). يجب أن يكون البروتوكول قابلا للتطبيق لإعادة تكوين البروتينات الغشائية الأخرى13،19،<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون Aditya Iyer على استنساخ جين pBAD-PercevalHR و Gea Schuurman-Wolters للمساعدة في إنتاج البروتين وتنقيته. تم تمويل البحث من قبل برنامج NWO Gravitation “بناء خلية اصطناعية” (BaSyC).
Materials
| Agarose | Sigma Aldrich | A9414-25g | |
| Amicon cut-off filter | Sigma Aldrich | Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra | |
| BioBeads | BioRad | 152-3920 | |
| CHCl3 | Macron Fine Chemicals | MFCD00000826 | |
| D(+)-Glucose | Formedium | – | |
| D(+)-Sucrose | Formedium | – | |
| DDM | Glycon | D97002 -C | |
| Diethyl Ether | Biosolve | 52805 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855-100ml | |
| DOPC | Avanti | 850375P-1g | |
| DOPE | Avanti | 850725P-1g | |
| DOPG | Avanti | 840475P-1g | |
| DTT | Formedium | DTT005 | |
| EtOH | J.T.Baker Avantor | MFCD00003568 | |
| Extruder | Avestin Inc | LF-1 | |
| Fluorimeter | Jasco | Spectrofluorometer FP-8300 | |
| Glycerol | BOOM | 51171608 | |
| Gravity flow column | Bio-Rad | 732-1010 | |
| Hamilton syringe 100 µL | Hamilton | 7656-01 | |
| Hamilton syringe 1000 µL | Hamilton | 81320 | |
| Handheld LCP dispenser | Art Robbins Instruments | 620-411-00 | |
| Handheld Sonicator | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | |
| HCl | BOOM | x76021889.1000 | |
| Imidazole | Roth | X998.4-250g | |
| K2HPO4 | Supelco | 1.05099.1000 | |
| KCl | BOOM | 76028270.1 | |
| KH2PO4 | Supelco | 1.04873.1000 | |
| Kimwipe | Kimtech Science | 7552 | |
| Large Falcon tube centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006-100G | |
| Light microscope | Leica | DM LS2 | |
| L-Ornithine | Roth | T204.1 | |
| LSM Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 710 ConfoCor 3 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-1KG | |
| Microfluidic chip | Homemade | PDMS based | DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J |
| Na-ADP | Sigma-Aldrich | A2754-1G | |
| NaCl | Supelco | 1.06404.1000 | |
| Nanodrop Spectrometer | Isogen Life Science | ND-1000 spectrophotometer NanoDrop | |
| NaOH | Supelco | 1.06498.1000 | |
| Needles for GUVs | Henke-Ject | 14-14575 | 27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm |
| Needles for microfluidics | Henke-Ject | 14-15538 | 18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm |
| Ni2+ Sepharose | Cytiva | 17526802 | |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143-5MG | |
| Nutator | VWR | 83007-210 | |
| Osmolality meter | Gonotec Salmenkipp | Osmomat 3000 basic freezing point osmometer | |
| Plasmacleaner | Plasma Etch | PE-Avenger | |
| Polycarbonate filter | Cytiva Whatman | Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104 | 0.4 µm |
| Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 355647 | |
| Pyranine | Acros Organics | H1529-1G | |
| Quartz cuvette (black) | Hellma Analytics | 108B-10-40 | |
| Sephadex G-75 resin | GE Healthcare | 17-0050-01 | |
| Sonicator | Sonics Sonics & Materials INC | Sonics vibra cell | |
| Syringe filter | Sarstedt | Filtropur S plus 0.2 | 0.2 µm |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | A-42467 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | centrifuge 5418 | |
| Teflon spacer | Homemade | Teflon based | 45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm |
| Tris | PanReac AppliChem | A1086.1000 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100 ml | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima Max-E | |
| UV lamp | Spectroline | ENB-280C/FE | |
| UV/VIS Spectrometer | Jasco | V730 spectrophotometer | |
| Valinomycin | Sigma-Aldrich | V0627-10MG | |
| Widefield fluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver | |
| β-Casein | Sigma Aldrich | C5890-500g |
References
- Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems. Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).
- Ivanov, I., et al. Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future challenges. Annu Rev Chem Biomol. Eng. 12 (1), 287-308 (2021).
- Clomburg, J. M., Crumbley, A. M., Gonzalez, R. Industrial biomanufacturing: The future of chemical production. Science. 355 (6320), (2017).
- Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -. H. P. J. An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design. Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).
- Wang, A., et al. Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168 (2020).
- Kanter, G., et al. Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines. Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53 (1), 92-107 (2013).
- Jain, K. K. Synthetic biology and personalized medicine. Med Princ Pract. 22 (3), 209-219 (2013).
- Schwille, P., Frohn, B. P. Hidden protein functions and what they may teach us. Trends Cell Biol. 32 (2), 102-109 (2022).
- Sachsenmeier, P. Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology. Engineering. 2 (2), 225-229 (2016).
- Schmidt, D., Jiang, Q. -. X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444 (7120), 775-779 (2006).
- Godoy-Hernandez, A., et al. Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions. ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).
- Sikkema, H. R., et al. Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA. Sci Adv. 6 (47), 7697 (2020).
- Foucaud, C., Poolman, B. Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport. J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).
- Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization. Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).
- Simidjiev, I., et al. Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro. Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).
- Harris, N. J., Booth, P. J. Folding and stability of membrane transport proteins in vitro. Biochim Biophys Acta BBA – Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).
- Jackson, M. L., Litman, B. J. Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure. Biochim Biophys Acta BBA – Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).
- Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).
- Rigaud, J. -. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochim Biophys Acta BBA – Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).
- . Synthetic Organelles for Energy Conservation and Delivery of Building Blocks for Lipid Biosynthesis Available from: https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1 (2023)
- Lee, K. Y., et al. Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system. Nat Biotechnol. 36 (6), 530-535 (2018).
- Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. Methods in Enzymology. , 161-176 (2009).
- Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J. Vis. Exp. (95), e52281 (2015).
- Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 88 (2), 1134-1142 (2005).
- Pols, T., et al. A synthetic metabolic network for physicochemical homeostasis. Nat Commun. 10 (1), 4239 (2019).
- Bailoni, E., Poolman, B. ATP recycling fuels sustainable glycerol 3-phosphate formation in synthetic cells fed by dynamic dialysis. ACS Synth Biol. 11 (7), 2348-2360 (2022).
- Van Der Heide, T. On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine. EMBO J. 20 (24), 7022-7032 (2001).
- Van’T Klooster, J. S., et al. Membrane lipid requirements of the lysine transporter Lyp1 from Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol. 432 (14), 4023-4031 (2020).
- Lou, G., Anderluzzi, G., Woods, S., Roberts, C. W., Perrie, Y. A novel microfluidic-based approach to formulate size-tuneable large unilamellar cationic liposomes: Formulation, cellular uptake and biodistribution investigations. Eur J Pharm Biopharm. 143, 51-60 (2019).
- Weiss, M., et al. Sequential bottom-up assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics. Nat Mater. 17 (1), 89-96 (2018).
- Pols, T., Singh, S., Deelman-Driessen, C., Gaastra, B. F., Poolman, B. Enzymology of the pathway for ATP production by arginine breakdown. FEBS J. 288 (1), 293-309 (2021).
- Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
- Elias, M., et al. Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette. Micro Nano Eng. 8, 100064 (2020).
- Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 044105 (2013).
- Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths. Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).
- Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4 (1), 2550 (2013).
- Setyawati, I., et al. In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters. eLife. 9, e64389 (2020).
- Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles. Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).
- Estes, D. J., Mayer, M. Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).
.