Costruzione di reti metaboliche fuori equilibrio in vescicole di dimensioni nanometriche e micrometriche

Summary

Presentiamo un protocollo per la ricostituzione delle proteine di membrana e l’incapsulamento di enzimi e altri componenti idrosolubili in vescicole lipidiche di dimensioni sub-micrometriche e micrometriche.

Abstract

Presentiamo un metodo per incorporare nelle vescicole reti proteiche complesse, che coinvolgono proteine di membrana integrali, enzimi e sensori basati sulla fluorescenza, utilizzando componenti purificati. Questo metodo è rilevante per la progettazione e la costruzione di bioreattori e lo studio di complesse reti di reazioni metaboliche fuori equilibrio. Iniziamo ricostituendo (multiple) proteine di membrana in grandi vescicole unilamellari (LUV) secondo un protocollo precedentemente sviluppato. Quindi incapsulamo una miscela di enzimi purificati, metaboliti e sensori basati sulla fluorescenza (proteine fluorescenti o coloranti) tramite liofilizzazione-scongelamento-estrusione e rimuoviamo i componenti non incorporati mediante centrifugazione e/o cromatografia ad esclusione dimensionale. Le prestazioni delle reti metaboliche vengono misurate in tempo reale monitorando il rapporto ATP/ADP, la concentrazione di metaboliti, il pH interno o altri parametri mediante lettura a fluorescenza. Le nostre vescicole contenenti proteine di membrana con diametro di 100-400 nm possono essere convertite in vescicole unilamellari giganti (GUV), utilizzando le procedure esistenti ma ottimizzate. L’approccio consente l’inclusione di componenti solubili (enzimi, metaboliti, sensori) in vescicole di dimensioni micrometriche, aumentando così il volume dei bioreattori di ordini di grandezza. La rete metabolica contenente i GUV è intrappolata in dispositivi microfluidici per l’analisi mediante microscopia ottica.

Introduction

Il campo della biologia sintetica bottom-up si concentra sulla costruzione di cellule (minime) ^1,2 e bioreattori metabolici per scopi biotecnologici ^3,4 o biomedici 5,6,7,8. La costruzione di cellule sintetiche fornisce una piattaforma unica che consente ai ricercatori di studiare le proteine (di membrana) in condizioni ben definite che imitano quelle degli ambienti nativi, consentendo la scoperta di proprietà emergenti e funzioni biochimiche nascoste delle proteine e delle reti di reazione⁹. Come passo intermedio verso una cellula sintetica funzionante in modo autonomo, vengono sviluppati moduli che catturano le caratteristiche essenziali delle cellule viventi come la conservazione dell’energia metabolica, la sintesi di proteine e lipidi e l’omeostasi. Tali moduli non solo migliorano la nostra comprensione della vita, ma hanno anche potenziali applicazioni nei campi della medicina⁸ e della biotecnologia¹⁰.

Le proteine transmembrana sono al centro di praticamente qualsiasi rete metabolica in quanto trasportano molecole dentro o fuori dalla cellula, segnalano e rispondono alla qualità dell’ambiente e svolgono numerosi ruoli biosintetici. Pertanto, l’ingegnerizzazione di moduli metabolici in cellule sintetiche richiede nella maggior parte dei casi la ricostituzione di proteine di membrana integrali e/o periferiche in un doppio strato di membrana composto da lipidi specifici e ad alta integrità (bassa permeabilità). La gestione di queste proteine di membrana è impegnativa e richiede conoscenze specifiche e capacità sperimentali.

Sono stati sviluppati diversi metodi per ricostituire le proteine di membrana all’interno delle vescicole fosfolipidiche, il più delle volte con lo scopo di studiare la funzione^11,12, la regolazione¹³, le proprietà cinetiche^14,15, la dipendenza dai lipidi^15,16 e/o la stabilità¹⁷ di una specifica proteina. Questi metodi comportano la rapida diluizione delle proteine solubilizzate con detergente in mezzi acquosi in presenza di lipidi¹⁸, la rimozione dei detergenti mediante incubazione di proteine solubilizzate con detergente con vescicole lipidiche destabilizzate con detergente e l’assorbimento del detergente o dei detergenti su perle di polistirene¹⁹, o la rimozione dei detergenti mediante dialisi o cromatografia ad esclusione dimensionale²⁰. I solventi organici sono stati utilizzati per formare vescicole lipidiche, ad esempio, attraverso la formazione di interfasi olio-acqua²¹, ma la maggior parte delle proteine integrali di membrana sono inattivate quando esposte a tali solventi.

Nel nostro laboratorio, ricostituiamo per lo più le proteine di membrana con il metodo dell’assorbimento dei detergenti per formare grandi vescicole unilamellari (LUV)¹⁹. Questo metodo consente la co-ricostituzione di più proteine di membrana e l’incapsulamento nel lume della vescicola di enzimi, metaboliti e sonde^22,23. I LUV contenenti proteine di membrana possono essere convertiti in vescicole unilamellari giganti (GUV) con/senza incapsulamento di componenti idrosolubili, utilizzando l’elettroformazione²⁴ o il rigonfiamento assistito da gel²⁵ e condizioni specifiche per preservare l’integrità delle proteine di membrana²⁶.

Questo articolo presenta un protocollo per la ricostituzione nei LUV di una rete metabolica fuori equilibrio che rigenera l’ATP attraverso la scomposizione della L-arginina in L-ornitina²⁷. La formazione di ATP è accoppiata alla produzione di glicerolo-3-fosfato (G3P), un importante elemento costitutivo per la sintesi dei fosfolipidi^22,28. La via metabolica è costituita da due proteine integrali di membrana, un’arginina/ornitina (ArcD) e un antiporter G3P/Pi (GlpT). Inoltre, sono necessari tre enzimi solubili (ArcA, ArcB, ArcC) per il riciclaggio dell’ATP e il GlpK viene utilizzato per convertire il glicerolo in glicerolo-3-fosfato, utilizzando l’ATP dalla scomposizione della L-arginina, vedere la Figura 1 per una panoramica schematica del percorso. Questo protocollo rappresenta un buon punto di partenza per la futura costruzione di reti di reazione ancora più complesse, per la sintesi di lipidi o proteine o per la divisione delle cellule. La composizione lipidica delle vescicole supporta l’attività di un’ampia varietà di proteine integrali di membrana ed è stata ottimizzata per il trasporto di diverse molecole dentro o fuori le vescicole 27,29,30.

Figura 1: Panoramica della via per la produzione di ATP e la sintesi e l’escrezione del glicerolo-3-fosfato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In breve, le proteine di membrana purificate (solubilizzate in dodecil-β-D-maltoside, DDM) vengono aggiunte alle vescicole lipidiche preformate che sono state destabilizzate con Triton X-100, che consente l’inserimento delle proteine nella membrana. Le molecole detergenti vengono successivamente (lentamente) rimosse mediante l’aggiunta di perle di polistirene attivate, con conseguente formazione di proteoliposomi ben sigillati. I componenti solubili possono quindi essere aggiunti alle vescicole e incapsulati tramite cicli di congelamento-scongelamento, che intrappolano le molecole nel processo di fusione della membrana. Le vescicole ottenute sono altamente eterogenee e molte sono multilamellari. Vengono quindi estrusi attraverso un filtro in policarbonato con una dimensione dei pori di 400, 200 o 100 nm, che produce vescicole di dimensioni più uniformi; Più piccola è la dimensione dei pori, più omogenee e unilamellari sono le vescicole ma al prezzo di un volume interno inferiore. Le proteine non incorporate e le piccole molecole vengono rimosse dalla soluzione esterna mediante cromatografia ad esclusione dimensionale. I proteoLUV possono essere convertiti in vescicole di dimensioni micrometriche mediante rigonfiamento assistito da gel, e questi proteoGUV vengono quindi raccolti e intrappolati in un chip microfluidico per la caratterizzazione e la manipolazione microscopica. La Figura 2 mostra una panoramica schematica dell’intero protocollo.

Figura 2: Panoramica del protocollo per la ricostituzione delle proteine di membrana e l’incapsulamento degli enzimi e dei componenti idrosolubili in vescicole lipidiche di dimensioni sub-micrometriche (LUV) e micrometriche (GUV). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I protocolli di ricostituzione e incapsulamento funzionano bene e la funzionalità delle proteine viene mantenuta, ma i proteoLUV e i proteoGUV sono di dimensioni eterogenee. Gli approcci microfluidici^31,32 consentono la formazione di vescicole di dimensioni micrometriche di dimensioni più omogenee, ma la ricostituzione funzionale delle proteine di membrana non è generalmente possibile perché il solvente residuo nel doppio strato inattiva le proteine. Le dimensioni dei proteoLUV variano da 100 a 400 nm e, a basse concentrazioni di enzimi, l’incapsulamento può portare a vescicole con vie metaboliche incomplete (effetti stocastici; vedi Figura 3). I LUV sono ideali per la costruzione di specifici moduli metabolici, come mostrato qui per la produzione di ATP e di elementi costitutivi come il G3P. Tali proteoLUV possono potenzialmente essere incapsulati in GUV e fungere da compartimenti simili a organelli per le vescicole dell’ospite.

Figura 3: Numero di molecole per vescicola con un diametro di 100, 200 o 400 nm. (A) Quando le proteine incapsulate (enzimi, sonde) sono nell’intervallo 1-10 μM. (B) La ricostituzione viene eseguita a 1-1.000, da 1 a 10.000 e da 1 a 100.000 proteine di membrana per lipide (mol/mol). Partiamo dal presupposto che le molecole siano incapsulate alle concentrazioni indicate e incorporate nella membrana a questi rapporti proteina-lipide. Per alcuni enzimi, abbiamo visto che si legano alle membrane, che possono aumentare la loro concentrazione apparente nelle vescicole. Abbreviazione: LPR = Rapporto lipidico-proteico Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. Preparazione generale Prodotti chimiciSciogliere i lipidi (in polvere) a 25 mg/mL in CHCl3 per produrre liposomi preformati.NOTA: È preferibile preparare brodi lipidici freschi, ma le soluzioni madre possono essere conservate anche a -20 °C per alcune settimane. Lavorare con i lipidi in polvere è più accurato rispetto all’utilizzo di lipidi già solubilizzati in CHCl3. CHCl3 deve essere maneggiato utilizzando pipette e/o siringhe di vetro e co…

Representative Results

La ricostituzione delle proteine solubilizzate di membrana nei liposomi richiede la destabilizzazione delle vescicole preformate. L’aggiunta di basse quantità di Triton X-100 si traduce inizialmente in un aumento dell’assorbanza a 540 nm (A540) a causa di un aumento della dispersione della luce dovuta al rigonfiamento delle vescicole (Figura 4). Il valore massimo di A540 è il punto in cui i liposomi sono saturi di detergente (Rsat), dopodiché qual…

Discussion

Presentiamo un protocollo per la sintesi di proteine (di membrana) contenenti vescicole lipidiche di dimensioni sub-micrometriche (proteoLUVs), e la conversione di proteoLUV in vescicole giganti-unilamellari (proteoGUVs). Il protocollo dovrebbe essere applicabile per la ricostituzione di altre proteine di membrana 13,19,30,40 e l’incapsulamento di reti metaboliche diverse dalle vie di degradazione della L-arginina e di sintesi del glicerolo 3-fosfato qui presentate.^</s…

Materials

Agarose	Sigma Aldrich	A9414-25g
Amicon cut-off filter	Sigma Aldrich	Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra
BioBeads	BioRad	152-3920
CHCl3	Macron Fine Chemicals	MFCD00000826
D(+)-Glucose	Formedium	–
D(+)-Sucrose	Formedium	–
DDM	Glycon	D97002 -C
Diethyl Ether	Biosolve	52805
DMSO	Sigma-Aldrich	276855-100ml
DOPC	Avanti	850375P-1g
DOPE	Avanti	850725P-1g
DOPG	Avanti	840475P-1g
DTT	Formedium	DTT005
EtOH	J.T.Baker Avantor	MFCD00003568
Extruder	Avestin Inc	LF-1
Fluorimeter	Jasco	Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol	BOOM	51171608
Gravity flow column	Bio-Rad	732-1010
Hamilton syringe 100 µL	Hamilton	7656-01
Hamilton syringe 1000 µL	Hamilton	81320
Handheld LCP dispenser	Art Robbins Instruments	620-411-00
Handheld Sonicator	Hielscher Ultrasound Technology	UP50H
HCl	BOOM	x76021889.1000
Imidazole	Roth	X998.4-250g
K2HPO4	Supelco	1.05099.1000
KCl	BOOM	76028270.1
KH2PO4	Supelco	1.04873.1000
Kimwipe	Kimtech Science	7552
Large Falcon tube centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810 R
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A5006-100G
Light microscope	Leica	DM LS2
L-Ornithine	Roth	T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope	Zeiss	LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-1KG
Microfluidic chip	Homemade	PDMS based	DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP	Sigma-Aldrich	A2754-1G
NaCl	Supelco	1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer	Isogen Life Science	ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH	Supelco	1.06498.1000
Needles for GUVs	Henke-Ject	14-14575	27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics	Henke-Ject	14-15538	18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose	Cytiva	17526802
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143-5MG
Nutator	VWR	83007-210
Osmolality meter	Gonotec Salmenkipp	Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner	Plasma Etch	PE-Avenger
Polycarbonate filter	Cytiva Whatman	Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104	0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube	Beckman Coulter	355647
Pyranine	Acros Organics	H1529-1G
Quartz cuvette (black)	Hellma Analytics	108B-10-40
Sephadex G-75 resin	GE Healthcare	17-0050-01
Sonicator	Sonics Sonics & Materials INC	Sonics vibra cell
Syringe filter	Sarstedt	Filtropur S plus 0.2	0.2 µm
Syringe pump	Harvard Apparatus	A-42467
Tabletop centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418
Teflon spacer	Homemade	Teflon based	45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris	PanReac AppliChem	A1086.1000
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-100 ml
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima Max-E
UV lamp	Spectroline	ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer	Jasco	V730 spectrophotometer
Valinomycin	Sigma-Aldrich	V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope	Zeiss	AxioObserver
β-Casein	Sigma Aldrich	C5890-500g