Konstruksjon av metabolske nettverk utenfor likevekt i vesikler i nano- og mikrometerstørrelse

Summary

Vi presenterer en protokoll for rekonstituering av membranproteiner og innkapsling av enzymer og andre vannløselige komponenter i lipidvesikler av submikrometer- og mikrometerstørrelse.

Abstract

Vi presenterer en metode for å inkorporere komplekse proteinnettverk i vesikler, som involverer integrerte membranproteiner, enzymer og fluorescensbaserte sensorer, ved bruk av rensede komponenter. Denne metoden er relevant for design og konstruksjon av bioreaktorer og studiet av komplekse metabolske reaksjonsnettverk utenfor likevekt. Vi starter med å rekonstituere (flere) membranproteiner til store unilamellære vesikler (LUV) i henhold til en tidligere utviklet protokoll. Vi innkapsler deretter en blanding av rensede enzymer, metabolitter og fluorescensbaserte sensorer (fluorescerende proteiner eller fargestoffer) via fryse-tine-ekstrudering og fjerne ikke-inkorporerte komponenter ved sentrifugering og/eller størrelseseksklusjonskromatografi. Ytelsen til de metabolske nettverkene måles i sanntid ved å overvåke ATP/ADP-forholdet, metabolittkonsentrasjonen, intern pH eller andre parametere ved fluorescensavlesning. Våre membranproteinholdige vesikler med en diameter på 100-400 nm kan omdannes til gigantiske unilamellære vesikler (GUV), ved å bruke eksisterende, men optimaliserte prosedyrer. Tilnærmingen muliggjør inkludering av løselige komponenter (enzymer, metabolitter, sensorer) i mikrometerstore vesikler, og oppskalerer dermed volumet av bioreaktorene med størrelsesordener. Det metabolske nettverket som inneholder GUV-er er fanget i mikrofluidiske enheter for analyse ved optisk mikroskopi.

Introduction

Feltet nedenfra og opp syntetisk biologi fokuserer på å konstruere (minimale) celler ^1,2 og metabolske bioreaktorer for bioteknologiske ^3,4 eller biomedisinske formål ^5,6,7,8. Konstruksjonen av syntetiske celler gir en unik plattform som lar forskere studere (membran) proteiner under veldefinerte forhold som etterligner de i innfødte miljøer, noe som muliggjør oppdagelsen av fremvoksende egenskaper og skjulte biokjemiske funksjoner til proteiner og reaksjonsnettverk⁹. Som et mellomtrinn mot en autonomt fungerende syntetisk celle, utvikles moduler som fanger opp essensielle trekk ved levende celler som metabolsk energibevaring, protein- og lipidsyntese og homeostase. Slike moduler forbedrer ikke bare vår forståelse av livet, men har også potensielle anvendelser innen medisin⁸ og bioteknologi¹⁰.

Transmembrane proteiner er kjernen i praktisk talt ethvert metabolsk nettverk når de transporterer molekyler inn eller ut av cellen, signaliserer og reagerer på kvaliteten på miljøet, og spiller en rekke biosyntetiske roller. Dermed krever konstruksjonen av metabolske moduler i syntetiske celler i de fleste tilfeller rekonstituering av integrerte og/eller perifere membranproteiner til et membrandobbeltlag sammensatt av spesifikke lipider og høy integritet (lav permeabilitet). Håndteringen av disse membranproteinene er utfordrende og krever spesifikk kunnskap og eksperimentelle ferdigheter.

Flere metoder er utviklet for å rekonstituere membranproteiner i fosfolipidvesikler, oftest med det formål å studere funksjonen^11,12, regulering¹³, kinetiske egenskaper^14,15, lipidavhengighet^15,16 og/eller stabilitet¹⁷ til et spesifikt protein. Disse metodene involverer rask fortynning av vaskemiddeloppløst protein til vandige medier i nærvær av lipider¹⁸, fjerning av vaskemidler ved å inkubere vaskemiddeloppløselig protein med vaskemiddeldestabiliserte lipidvesikler og absorpsjon av vaskemiddel(e) på polystyrenperler¹⁹, eller fjerning av vaskemidler ved dialyse eller størrelseseksklusjonskromatografi²⁰. Organiske løsningsmidler har blitt brukt til å danne lipidvesikler, for eksempel via dannelse av olje-vann-interfaser²¹, men flertallet av integrerte membranproteiner inaktiveres når de utsettes for slike løsningsmidler.

I laboratoriet vårt rekonstituerer vi for det meste membranproteiner ved vaskemiddelabsorpsjonsmetoden for å danne store unilamellære vesikler (LUV)¹⁹. Denne metoden tillater samrekonstituering av flere membranproteiner og innkapsling i vesikkellumen av enzymer, metabolitter og sonder^22,23. De membranproteinholdige LUV-ene kan omdannes til gigantiske unilamellære vesikler (GUV) med/uten innkapsling av vannløselige komponenter, ved bruk av enten elektroformasjon²⁴ eller gelassistert hevelse²⁵ og spesifikke forhold for å bevare integriteten til membranproteinene²⁶.

Denne artikkelen presenterer en protokoll for rekonstituering i LUV-er av et metabolsk nettverk utenfor likevekt som regenererer ATP gjennom nedbrytning av L-arginin til L-ornitin²⁷. Dannelsen av ATP er koblet til produksjonen av glyserol-3-fosfat (G3P), en viktig byggestein for fosfolipidsyntese^22,28. Den metabolske veien består av to integrerte membranproteiner, en arginin/ornitin (ArcD) og en G3P/Pi-antiporter (GlpT). I tillegg kreves tre løselige enzymer (ArcA, ArcB, ArcC) for resirkulering av ATP, og GlpK brukes til å omdanne glyserol til glyserol 3-fosfat, ved bruk av ATP fra nedbrytningen av L-arginin, se figur 1 for en skjematisk oversikt over banen. Denne protokollen representerer et godt utgangspunkt for fremtidig konstruksjon av enda mer komplekse reaksjonsnettverk – for syntese av lipider eller proteiner eller deling av celler. Lipidsammensetningen til vesiklene støtter aktiviteten til et bredt utvalg av integrerte membranproteiner og er optimalisert for transport av forskjellige molekyler inn i eller ut av vesiklene 27,29,30.

Figur 1: Oversikt over veien for ATP-produksjon og syntese og utskillelse av glyserol 3-fosfat, klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Kort sagt, rensede membranproteiner (oppløst i dodecyl-β-D-maltosid, DDM) tilsettes til forhåndsformede lipidvesikler som har blitt destabilisert med Triton X-100, noe som gjør det mulig å sette inn proteinene i membranen. Vaskemiddelmolekylene fjernes deretter (sakte) ved tilsetning av aktiverte polystyrenperler, noe som resulterer i dannelse av godt forseglede proteoliposomer. Løselige komponenter kan deretter tilsettes vesiklene og innkapsles via fryse-tine-sykluser, som fanger molekylene i prosessen med membranfusjon. De oppnådde vesiklene er svært heterogene og mange er multilamellære. De ekstruderes deretter gjennom et polykarbonatfilter med en porestørrelse på 400, 200 eller 100 nm, noe som gir mer jevne vesikler; Jo mindre porestørrelsen er, desto mer homogene og unilamellære er vesiklene, men til prisen av et mindre indre volum. Ikke-inkorporerte proteiner og små molekyler fjernes fra den eksterne løsningen ved størrelseseksklusjonskromatografi. ProteoGUL-ene kan omdannes til vesikler i mikrometerstørrelse ved gelassistert hevelse, og disse proteoGUVene blir deretter samlet og fanget i en mikrofluidisk brikke for mikroskopisk karakterisering og manipulasjon. Figur 2 viser en skjematisk oversikt over hele protokollen.

Figur 2: Oversikt over protokollen for rekonstituering av membranproteiner og innkapsling av enzymer og vannløselige komponenter i lipidvesikler av submikrometer (UV) og mikrometerstørrelse (GUV). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Rekonstituerings- og innkapslingsprotokollene fungerer bra og funksjonaliteten til proteinene beholdes, men proteoGUL-ene og proteoGUV-ene er heterogene i størrelse. Mikrofluidiske tilnærminger ^31,32 tillater dannelse av vesikler i mikrometerstørrelse som er mer homogene i størrelse, men funksjonell rekonstituering av membranproteiner er generelt ikke mulig fordi gjenværende løsningsmiddel i dobbeltlaget inaktiverer proteinene. ProteoLÚVene varierer i størrelse fra 100 til 400 nm, og ved lave konsentrasjoner av enzymer kan innkapslingen føre til vesikler med ufullstendige metabolske veier (stokastiske effekter; se figur 3). LUV-er er ideelle for å konstruere spesifikke metabolske moduler, som vist her for produksjon av ATP og byggesteiner som G3P. Slike proteoLIV-er kan potensielt innkapsles i GUV-er og tjene som organelllignende rom for vertsvesiklene.

Figur 3: Antall molekyler per vesikkel med en diameter på 100, 200 eller 400 nm. (A) Når de innkapslede proteinene (enzymer, prober) er i området 1-10 μM. (B) Rekonstitueringen gjøres ved 1 til 1 000, 1 til 10 000 og 1 til 100 000 membranproteiner per lipid (mol/mol). Vi antar at molekyler er innkapslet i de angitte konsentrasjonene og inkorporert i membranen ved disse protein-til-lipid-forholdene. For noen enzymer har vi sett at de binder seg til membraner, noe som kan øke deres tilsynelatende konsentrasjon i vesiklene. Forkortelse: LPR = Lipid-Protein-Ratio Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

1. Generell forberedelse KjemikalierLøs opp lipider (i pulverform) til 25 mg/ml i CHCl3 for å lage forhåndsformede liposomer.MERK: Det er å foretrekke å tilberede ferske lipider, men stamløsningene kan også lagres ved -20 °C i noen uker. Å jobbe med lipider i pulverform er mer nøyaktig enn å bruke lipider som allerede er oppløst i CHCl3. CHCl3 skal håndteres ved hjelp av glasspipetter og/eller sprøyter og oppbevares i glassbeholdere da …

Representative Results

Rekonstituering av oppløste membranproteiner i liposomer krever destabilisering av forhåndsformede vesikler. Tilsetning av lave mengder Triton X-100 resulterer i utgangspunktet i en økning av absorbansen ved 540 nm (A540) på grunn av en økning i lysspredning ved hevelse i vesiklene (figur 4). Den maksimale A540-verdien er punktet der liposomene er mettet med vaskemiddel (Rsat), hvoretter ytterligere tilsetning av Triton X-100 vil resultere i del…

Discussion

Vi presenterer en protokoll for syntese av (membran)protein som inneholder lipidvesikler i submikrometerstørrelse (proteoGUL), og konvertering av proteoLÚVer til gigantiske unilamellære vesikler (proteoGUV). Protokollen bør gjelde for rekonstituering av andre membranproteiner 13,19,30,40 og innkapsling av andre metabolske nettverk enn L-arginin-nedbrytningen og glyserol-3-fosfatsynteseveiene presentert her.<sup cl…

Materials

Agarose	Sigma Aldrich	A9414-25g
Amicon cut-off filter	Sigma Aldrich	Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra
BioBeads	BioRad	152-3920
CHCl3	Macron Fine Chemicals	MFCD00000826
D(+)-Glucose	Formedium	–
D(+)-Sucrose	Formedium	–
DDM	Glycon	D97002 -C
Diethyl Ether	Biosolve	52805
DMSO	Sigma-Aldrich	276855-100ml
DOPC	Avanti	850375P-1g
DOPE	Avanti	850725P-1g
DOPG	Avanti	840475P-1g
DTT	Formedium	DTT005
EtOH	J.T.Baker Avantor	MFCD00003568
Extruder	Avestin Inc	LF-1
Fluorimeter	Jasco	Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol	BOOM	51171608
Gravity flow column	Bio-Rad	732-1010
Hamilton syringe 100 µL	Hamilton	7656-01
Hamilton syringe 1000 µL	Hamilton	81320
Handheld LCP dispenser	Art Robbins Instruments	620-411-00
Handheld Sonicator	Hielscher Ultrasound Technology	UP50H
HCl	BOOM	x76021889.1000
Imidazole	Roth	X998.4-250g
K2HPO4	Supelco	1.05099.1000
KCl	BOOM	76028270.1
KH2PO4	Supelco	1.04873.1000
Kimwipe	Kimtech Science	7552
Large Falcon tube centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810 R
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A5006-100G
Light microscope	Leica	DM LS2
L-Ornithine	Roth	T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope	Zeiss	LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-1KG
Microfluidic chip	Homemade	PDMS based	DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP	Sigma-Aldrich	A2754-1G
NaCl	Supelco	1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer	Isogen Life Science	ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH	Supelco	1.06498.1000
Needles for GUVs	Henke-Ject	14-14575	27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics	Henke-Ject	14-15538	18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose	Cytiva	17526802
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143-5MG
Nutator	VWR	83007-210
Osmolality meter	Gonotec Salmenkipp	Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner	Plasma Etch	PE-Avenger
Polycarbonate filter	Cytiva Whatman	Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104	0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube	Beckman Coulter	355647
Pyranine	Acros Organics	H1529-1G
Quartz cuvette (black)	Hellma Analytics	108B-10-40
Sephadex G-75 resin	GE Healthcare	17-0050-01
Sonicator	Sonics Sonics & Materials INC	Sonics vibra cell
Syringe filter	Sarstedt	Filtropur S plus 0.2	0.2 µm
Syringe pump	Harvard Apparatus	A-42467
Tabletop centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418
Teflon spacer	Homemade	Teflon based	45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris	PanReac AppliChem	A1086.1000
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-100 ml
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima Max-E
UV lamp	Spectroline	ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer	Jasco	V730 spectrophotometer
Valinomycin	Sigma-Aldrich	V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope	Zeiss	AxioObserver
β-Casein	Sigma Aldrich	C5890-500g