Summary
Metoder för att studera mitokondriell bioenergetik under fysiologiskt relevanta substratkoncentrationer i immunceller är begränsade. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll som använder högupplöst fluorespiromometri för att bedöma förändringar i svaret från mitokondriell membranpotential på energibehov i humana T-celler, monocyter och perifera mononukleära celler.
Abstract
Perifera mononukleära celler (PBMC) uppvisar robusta förändringar i mitokondriell andningskapacitet som svar på hälsa och sjukdom. Även om dessa förändringar inte alltid återspeglar vad som händer i andra vävnader, såsom skelettmuskulatur, är dessa celler en tillgänglig och värdefull källa till livskraftiga mitokondrier från människor. PBMC:er utsätts för systemiska signaler som påverkar deras bioenergetiska tillstånd. Att utöka våra verktyg för att undersöka mitokondriell metabolism i denna population kommer således att belysa mekanismer relaterade till sjukdomsprogression. Funktionella analyser av mitokondrier är ofta begränsade till att använda andningsutgångar efter maximala koncentrationer av substrat, hämmare och frånkopplare för att bestämma hela spektrumet av andningskapacitet, vilket kanske inte kan uppnås in vivo. Omvandlingen av adenosindifosfat (ADP) till adenosintrifosfat (ATP) av ATP-syntas resulterar i en minskning av mitokondriell membranpotential (mMP) och en ökning av syreförbrukningen. För att ge en mer integrerad analys av mitokondriell dynamik beskriver denna artikel användningen av högupplösande fluorespiromemetri för att mäta det samtidiga svaret av syreförbrukning och mitokondriell membranpotential (mMP) på fysiologiskt relevanta koncentrationer av ADP. Denna teknik använder tetrametylrhodaminmetylester (TMRM) för att mäta mMP-polarisering som svar på ADP-titreringar efter maximal hyperpolarisering med komplexa I- och II-substrat. Denna teknik kan användas för att kvantifiera hur förändringar i hälsotillstånd, såsom åldrande och metabola sjukdomar, påverkar känsligheten hos mitokondriellt svar på energibehov i PBMC, T-celler och monocyter från mänskliga försökspersoner.
Introduction
En cells förmåga att fungera och överleva under en period av fysiologisk stress är till stor del beroende av dess förmåga att uppfylla det energetiska behovet för att återställa homeostas 1,2. Energibehovet ökar som svar på en mängd olika stimuli. Till exempel ökar ökad muskelkontraktion under träning utnyttjandet av ATP och glukos av skelettmuskulaturen, och en ökning av proteinsyntesen efter infektion ökar utnyttjandet av ATP av immunceller för cytokinproduktion och proliferation 3,4,5,6. En ökning av energibehovet utlöser en serie bioenergetiska processer för att återställa ATP/ADP-förhållandet. När ATP konsumeras stiger ADP-nivåerna och stimulerar F1F0 ATP-syntas (komplex V), vilket kräver en protonmotorisk kraft för att driva dess mekaniska rotation och katalytiska omvandling av ADP till ATP i mitokondrien7. Protonmotorkraften är en elektrokemisk gradient som skapas genom pumpning av protoner under överföringen av elektroner från substrat till syre genom elektrontransportsystemet (ETS) i det inre mitokondriella membranet. Den resulterande skillnaden i protonkoncentration (delta pH) och elektrisk potential (membranpotential) skapar den protonmotoriska kraften som driver ATP-syntesen och syreförbrukningen som svar på energibehovet, vilket minskar ATP/ADP-förhållandet eller höjer ADP-nivåerna. Affiniteten hos mitokondrier till ADP kan bestämmas genom beräkning av Km eller EC50 av ADP-stimulerad andning av isolerade mitokondrier eller permeabiliserade celler 8,9. Denna metod har visat att permeabiliserade muskelfibrer från äldre människor kräver en större koncentration av ADP för att stimulera 50 % av deras maximala oxidativa fosforyleringskapacitet än de hos yngre försökspersoner9. På samma sätt kräver åldrande musskelettmuskler mer ADP för att sänka produktionen av mitokondriella reaktiva syreradikaler (ROS)10,11. Dessutom minskar ADP-känsligheten i permeabiliserade muskelfibrer hos möss med dietinducerad fetma i förhållande till kontroller och förbättras i närvaro av insulin och efter nitratkonsumtion12,13. Mitokondriernas förmåga att svara på energibehov varierar alltså under olika fysiologiska förhållanden, men detta har inte tidigare utforskats i samband med immunceller.
Mononukleära celler i perifert blod (PBMC) används ofta för att undersöka cellulär bioenergetik hos människor 14,15,16,17,18,19,20. Detta beror till stor del på att celler är lätta att få från okoagulerade blodprover i kliniska studier, cellernas känslighet för metabola störningar och de metoder som utvecklats av olika grupper för att undersöka mitokondriell metabolism genom att använda inhibitorer och uncouplers för att bestämma den maximala och minimala kapaciteten hos mitokondriell andning21,22. Dessa metoder har lett till en uppskattning av bioenergetikens roll i åldrande, metabola sjukdomar och immunfunktion 14,20,23,24. Mitokondriell andningskapacitet är ofta nedsatt i skelettmuskulatur och PBMC under tillstånd av hjärtsvikt18,25. PBMC-bioenergetiska ämnen är också korrelerade med kardiometabola riskfaktorer hos friska vuxna17 och svarar på behandlingar som nikotinamidribosid18. PBMC inkluderar neutrofiler, lymfocyter (B-celler och T-celler), monocyter, naturliga mördarceller och dendritiska celler, som alla bidrar till PBMC:s mitokondriella kapacitet 26,27,28. Dessutom spelar cellulära bioenergetiska ämnen en avgörande roll för aktivering, proliferation och förnyelse av immunceller23. En begränsning med dessa metoder är dock att cellerna inte fungerar under ett fysiologiskt intervall av substrat. Ytterligare metoder krävs därför för att undersöka mitokondriell funktion i substratkoncentrationer som är mer relevanta för vad celler upplever in vivo.
Mitokondriell membranpotential (mMP) är huvudkomponenten i en protonmotorisk kraft och är avgörande för en mängd olika mitokondriella processer utöver ATP-produktion, såsom reglering av andningsflöde, produktion av reaktiva syreradikaler, import av protein och joner, autofagi och apoptos. mMP kan bedömas med elektrokemiska sonder eller fluorescerande färgämnen som är känsliga för förändringar i membranpolarisering som JC-1, Rhod123, DiOC6, tetrametylrhodamin (TMRE) eller metylester (TMRM) och safranin. De två senare är lipofila katjoniska färgämnen som framgångsrikt har använts i högupplöst fluorespirometri av vävnadshomogenater, isolerade mitokondrier och permeabiliserad vävnad 11,29,30,31,32,33. I denna teknik används TMRM i släckningsläge, där celler utsätts för en hög koncentration av TMRM som ackumuleras i mitokondriell matris när den polariseras (hög mMP och protonisk kraft), vilket resulterar i släckning av cytosolisk TMRM-fluorescens. När mitokondrier depolariseras som svar på ADP eller kopplare frigörs färgämnet från matrisen, vilket ökar TMRM-fluorescerande signal34,35. Syftet med denna metod är att samtidigt mäta förändringar i mitokondriell andning och mMP som svar på ADP-titreringar i PBMC från människa, cirkulerande monocyter och T-celler, och den kan också tillämpas på Mjält-T-celler hos möss.
Protocol
Insamlingen av blodprover för data- och metodutveckling som presenteras häri har godkänts av Internal Review Board vid University of Washington. Representativa resultat inkluderar även data från hanmöss av C57BL/6J (5-7 månader gamla) inköpta från Jackson Laboratories. Alla djurförsök har godkänts av University of Washington Office of Animal Welfare. Protokollet överview visas i figur 1. Reagensberedning för detta protokoll finns i Supplementary File 1.
Figur 1: Översikt över protokollet. Arbetsflöde med högupplöst fluorespirometri för att bedöma förändringar i mitokondriell membranpotential i isolerade monocyter (CD14+) och T-celler (CD3+) från färska humana blodprover. Förkortningar: TMRM, tetrametylrhodaminmetylester; SUIT, titreringar av substrat-frånkopplare-inhibitor; ADP, adenosindifosfat; Gräva, digitonin; Mal, malat; Pyrr, pyruvat; Glutamat, glutamat; D1-10, 10 på varandra följande ADP-titreringar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
1. Separering av buffypäls från helblod
OBS: Cellisoleringen är modifierad från Kramer et al.27.
- Låt RPMI, densitetsgradient och centrifug nå rumstemperatur. Sterilisera biosäkerhetsskåpet och materialen innan du börjar.
- Samla venöst blod i tre 10 ml K2EDTA-rör. Vänd rören upp och ner minst 3 gånger.
- Centrifugera rören vid 500 x g 10 min (22 °C, 9 acceleration [acc], 2 retardation [dec]).
- Ta bort 1 ml plasma från varje rör och förvara vid -80 °C för framtida analyser.
- Överför plasman och hälften av de röda blodkropparna från varje rör till ett enda 50 ml koniskt rör. Lägg till RPMI upp till 40 ml-märket. Invertera minst 3 gånger.
- Skikta långsamt 10 ml plasmalösning i fyra 15 ml koniska rör som innehåller 3 ml densitetsgradient.
- Centrifugera vid 700 x g i 30 minuter (22 °C, 5 acc, 2 dec).
- Samla in all plasma och det buffy-hölje som innehåller de perifera mononukleära cellerna (PBMC) utan att störa de röda blodkropparna.
- Centrifugera vid 500 x g i 10 minuter (22 °C, 5 acc, 5 dec) och aspirera supernatanten.
- Tvätta PBMC-pelleten 1x-2x genom att hänga upp den i 10 ml RPMI och centrifugera vid 500 x g i 10 minuter (22 °C, 5 acc, 5 dec).
2. Magnetisk separation av CD14+- och CD3+-celler
- Placera en pelare i magnetfältet i en magnetisk cellseparator (se materialtabellen). Tvätta kolonnen med 3 ml RP-5.
- Återsuspendera PBMC-pelleten i 80 μL RP-5 och 20 μL anti-CD14-mikrokulor (se materialtabellen). Inkubera i 15 minuter vid 4 °C.
- Återsuspendera cellerna med 1 ml RP-5 och ladda suspensionen på kolonnen. Samla omärkta celler som strömmar igenom i ett 15 ml koniskt rör märkt "Flow-through 1". Vänta tills all cellsuspension har gått igenom kolonnen och fortsätt sedan tvätta med 3 ml RP-5 3x, samla upp allt flöde.
- Ta försiktigt bort kolonnen från magnetfältet och placera den på ett nytt 15 ml koniskt rör. Tillsätt 5 ml RP-5 och använd omedelbart kolven för att tömma kolonnens innehåll i ett uppsamlingsrör märkt "CD14+".
- Centrifugera "Flow-through 1" vid 500 x g i 10 minuter (22 °C, 5 acc, 5 dec) och aspirera supernatanten.
- Använd celler från Flow-through 1, upprepa steg 2.2-2.5 med anti-CD3-mikropärlor (se materialtabellen) för att isolera T-celler.
- Centrifugrör som innehåller T-celler (CD3+) och monocyter (CD14+) vid 300 x g i 5 min. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml RP-5.
- Bestäm cellkoncentrationen med hjälp av en hemocytometer eller automatisk cellräknare.
OBS: Celler kan räknas genom att tillsätta 10 μL av en cellutspädning på 1:10 eller 1:20 till en hemocytometer. Man kan hänvisa till tidigare publicerade protokoll för att räkna celler med hjälp av en hemocytometer36. - Pipettera 2,5 miljoner monocyter eller 5 miljoner T-celler i ett nytt centrifugrör. Centrifugera i 30 s vid 2000 x g, aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i MiR05 för en total volym på 20 μL och en slutlig koncentration på 125 miljoner monocyter eller 250 miljoner T-celler per ml.
OBS: Den slutliga koncentrationen valdes ut för att injicera 2,5 miljoner monocyter eller 5 miljoner T-celler i en volym på 20 μL. T-celler från möss som isolerats från mjälten har också testats med denna metod. Proceduren finns i Supplementary File 1.
3. Högupplöst fluorespirometri - Kalibrering av syre och TMRM-fluorescens
OBS: Denna metod anpassades från tidigare arbete som gjorts på permeabiliserade fibrer av Pharaoh et al.11. En hög, ohämmande koncentration av TMRM används för kylningsläge, där förhållandet mellan mMP och TMRM-koncentration i matrisen är omvänt. Således leder en minskning av mMP till frisättning av TMRM-färgämne från matrisen och en ökning av fluorescens32.
- Installera 0.5 ml kammare i O2K-andningsskyddet enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabell). Slå på instrumentet och anslut det till programvaran som tillhandahålls av tillverkaren för datainsamling.
- Justera temperaturen till 37 °C och rör om hastigheten till 750 rpm.
- Tvätta kamrarna med destillerat vatten 3x. Byt ut vatten mot 0.54 ml Mir05, stäng propparna helt och ta bort överflödig buffert med det integrerade sugsystemet (ISS). Höj propparna så att syret i rummet kan komma i jämvikt med syret i kammaren med hjälp av en proppdistans.
- När syreflödet är stabilt, utför luftsyrekalibreringen (R1) enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Det kan ta >30 minuter för syreflödet att stabiliseras. Syresensorer kräver bestämning av nollpunktssyre (R0) och bakgrundssyreflöde från 50-200 μM från separata experiment med ditionittitreringar. Specifika metoder finns i tillverkarens manual. - Täta kammaren genom att stänga propparna.
OBS: Till skillnad från experiment med permeabiliserade fibrer kräver kamrarna inte hyperoxygenering för PBMC. Tätning av kammaren efter R1-kalibrering ger tillräckligt med syre för experimentet. Syrehalten bör hållas mellan 50-250 μM. Om syrekoncentrationen sjunker under tröskeln kan kammaren öppnas delvis så att kammarens syre kan komma i jämvikt med syret i rumsluften. - TMRM-kalibrering
- Använd de gröna LED-fluosensorerna (ex. 525 nm) med AmR-filtersetet (se materialtabell). Ställ in Fluorometer Gain till 1000 och Intensity (Intensitet ) till 1000. Slå på fluo-sensorerna och börja registrera baslinjen.
- Injicera 2,5 μL 0,05 mM TMRM och låt signalen stabiliseras (~2 min) innan nästa 2,5 μL injektion tills totalt 4 injektioner utförs för en total TMRM-koncentration på 1 μM TMRM i kammaren. Använd en Hamilton-spruta för alla injektioner.
- Kalibrera fluosensorn genom att välja den fluorescerande signalen (spänningen) för varje injektion som representerar 0, 0,25, 0,5, 0,75 och 1,0 μM TMRM för en fempunktskalibrering.
4. Protokoll för titrering av substrat-uncoupler-inhibitor (SUIT)
OBS: Kör blinda experiment där 20 μL Mir05 injiceras i kammaren istället för 20 μL cellsuspension, eftersom TMRM-signalen kommer att ändras som svar på enbart injektioner (diskuteras i representativa resultat). Låt syreflödessignalen stabiliseras (ca 2-3 min) före nästa injektion för både blank- och provexperiment. Följande titreringsprotokoll och förväntade observationer finns i tabell 1.
- När syreflödet är stabilt, välj och märk både syreflödet och TMRM-signalen "pre-cell".
- Injicera cellsuspensionen innehållande antingen 5 miljoner T-celler eller 2,5 miljoner monocyter i ~20 μL och mät i cirka 10 minuter. Välj och märk både syreflödet och TMRM-signalen som "Cell".
- Permeabilisera celler genom att injicera 2 μL 1 mg/ml digitonin (slutlig koncentration: 4 μg/ml). Vänta i 20 minuter. Välj och märk både syreflödet och TMRM-signalen som "Dig".
OBS: Det föreslås att digitaloninkoncentrationen optimeras i separata experiment. - Tillsätt 2,5 μl 1 M succinat (slutlig koncentration: 5 mM). Välj och märk både syreflödet och TMRM-signalen som "SUCC".
- När syreflödet är stabilt, tillsätt 5 μL 100 mM malat (slutlig koncentration: 1,0 mM), 5 μL 1 M glutamat (slutlig koncentration: 10 mM) och 5 μL 500 mM pyruvat (slutlig koncentration: 5 mM). Välj och märk både syreflödet och TMRM-signalen som "MPG".
- När syreflödet är stabilt, titrera ADP. Välj hastigheter för varje titrering och märk dem "D" sekventiellt 1 till 10, beroende på antalet titreringar. Använd titreringsschemat i tabell 2.
- När syreflödet är stabilt, utför en serie 1 μL titreringar av 0,25 mM karbonylcyanid p-(tri-fluromethoxi) fenylhydrazon (FCCP) tills den fluorescerande signalen når sitt maximum. Välj och märk både syreflödet och TMRM-signalen som representerar minsta membranpotential och märk den "FCCP".
OBS: FCCP-koncentration på 0.5-1.0 μM krävs vanligtvis för att utarma mitokondriell membranpotential.
VARNING: FCCP är giftigt. Se säkerhetsdatabladet (SDS) för korrekt hantering. - VALFRITT: När syreflödet är stabilt, injicera 1 μL 0,25 mM rotenon för att hämma komplex I och bestämma andningskapaciteten genom komplex II.
ANM.: Förändringar i membranpotentialen är inte längre relevanta efter titrering med frånkopplare.
VARNING: Rotenon är giftigt. Se SDS för korrekt hantering. - När syreflödet är stabilt, injicera 1 μl 1,25 mM (slutlig koncentration: 2,5 μM) antimycin A för att hämma mitokondriell andning.
VARNING: Antimycin A är giftigt. Se SDS för korrekt hantering.
5. Beräkning av mitokondriell membranpotential och analys
- Anteckna de kalibrerade TMRM-värdena (mikromolär TMRM) med hjälp av blindprov (förprov) före injektionen av blindprovet ("förprovet") och för var och en av injektionerna. Se figur 2.
- För varje blankprovsexperiment, beräkna bakgrundsförhållandet genom att ställa in TMRM-koncentrationen "pre-sample" till 1,0. Beräkna den efterföljande proportionella minskningen av TMRM. Beräkna det genomsnittliga bakgrundsförhållandet från alla tomma experiment.
OBS: Antalet tomma experiment som ska inkluderas kan bero på instrumentets precision. Se beräkningsexemplet i tabell 3 från fem olika blankprov, där standardavvikelsen för det genomsnittliga bakgrundsförhållandet låg mellan 0 och 0,016 för varje titrering. - Bakgrundsberäkning: Beräkna bakgrunden för varje provexperiment genom att multiplicera TMRM "pre-sample" från provexperimentet gånger det genomsnittliga bakgrundsförhållandet för varje injektion. Se beräkningsexemplet i tabell 3.
- Bakgrundskorrigering: Subtrahera experimentets bakgrund till de uppmätta TMRM-värdena för provet. Se beräkningsexemplet i tabell 4.
- FCCP-korrigering: Subtrahera FCCP-bakgrundskorrigerad mMP från varje injektion. Se beräkningsexemplet i tabell 4.
- ADP-känslighetskurva: Normalisera den ADP-drivna minskningen av mMP genom att ställa in den högsta och lägsta membranpotentialen som 100 % respektive 0 %, med hjälp av de mMP-värden som samlats in under ADP-titreringen. Passa in data i en icke-linjär regressionsmodell med hjälp av den föredragna statistiska programvaran för att beräkna den halva maximala hämmande koncentrationen (IC50) av ADP på mMP.
OBS: Kurvan passar [Inhibitor] vs. normaliserad respons - Variabel lutning i Prism.
Figur 2: Beräkning av mitokondriell membranpotential (mMP) och ADP-känslighet från TMRM-fluorescens. Steg för beräkning av mitokondriell membranpotential (mMP) och ADP-känslighet från mätningar av TMRM-fluorescens med högupplösande fluorespiromemetri av ett prov av T-celler (n = 1). Steg 1: TMRM-fluorescens mäts i blankprover på samma sätt som i det biologiska provet. Steg 2: Bestäm förhållandet i TMRM-signalen med varje titrering i förhållande till signalen före provet för varje blankexperiment. Beräkna medelvärdet för varje titrering av alla tomma experiment. Steg 3: Beräkna bakgrunden för varje provexperiment genom att multiplicera "pre-sample"-fluorescensen med det genomsnittliga bakgrundsförhållandet för varje titrering. Steg 4: Beräkna skillnaden mellan bakgrunds- och prov-TMRM-fluorescens för varje titrering för att uttrycka data som mMP eller mitokondriellt TMRM-upptag. Steg 5: Korrigera mMP så att fullständig frikoppling med FCCP återspeglar noll mMP. Steg 6: Utför icke-linjär regression för att kartlägga förändringar i mMP med ökande ADP-koncentrationer. Mätningarna utfördes i 0,5 ml kammare, varav en innehöll 5 miljoner T-celler från en frisk frivillig. Medelvärdet av data uttrycks som medelvärdet ± SEM. Enskilda datapunkter för ett enda replikat uttrycks utan felstaplar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Representative Results
För att illustrera skillnaderna i optimal cellkoncentration för analysen laddades 5 miljoner T-celler i en 0,5 ml kammare (10 miljoner celler/ml) och 1,25 miljoner celler laddades in i en annan kammare (2,5 miljoner celler/ml) innehållande 1 μM TMRM (Figur 3A-G). Tre tomma experiment inkluderades också för att beräkna TMRM-bakgrunden. Vi fann att en högre koncentration av T-celler resulterade i en mer urskiljbar förändring i TMRM-fluorescens i förhållande till bakgrunden (Figur 3B,D). Dessutom gjorde en högre cellkoncentration det möjligt för oss att upptäcka den förväntade ökningen av syreförbrukning och samtidig utarmning av mMP som svar på tillsatsen av FCCP (Figur 3E,F). Att använda en låg koncentration av celler gav en svag förändring i fluorescens som var parallell med bakgrunden. Eftersom beräkningen av mMP subtraherar bakgrunden från signalen, tillåter en låg cellkoncentration inte bestämning av förändringar i mMP som svar på substrat och frånkopplare. Förutom att använda de högre koncentrationerna av celler i denna analys rekommenderar vi att du håller cellkoncentrationen konstant för varje celltyp mellan experimenten.
För att validera ATP-syntas inverkan på avledningen av mMP med ADP-titreringar körde vi parallella experiment på PBMC och T-celler där en kammare fick oligomycin före ADP-titrering (Figur 4). Vi fann ingen minskning av mMP som svar på ADP i celler behandlade med oligomycin, vilket tyder på att den gradvisa minskningen av mMP med ADP är ett resultat av protonflöde genom ATP-syntas (Figur 4A-F). Vi jämförde också ADP-känslighet mellan T-celler och PBMC från samma deltagare och fann att ADP-känsligheten var lägre (högre EC50) i T-cellsfraktionen (Figur 4G,H).
Vi utförde en serie blankexperiment för att bestämma påverkan av tid eller SUIT-protokollet på TMRM-fluorescens. Vi fann att TMRM-signalen i blanka experiment påverkas mest av SUIT-titreringar (Figur 5A) i motsats till tidpunkten för titreringarna (Figur 5B).
Vi jämförde ADP-drivna förändringar i syreförbrukningshastighet (OCR) och i mMP i T-celler och monocyter från 11 friska, samhällsboende frivilliga (Figur 6A-H). I likhet med resultaten av tidigare publicerade experiment med extracellulärt flöde och enzymatiska analyser, uppvisade monocyter en större mitokondriell andningskapacitet än lymfocyter26,27 (Figur 6A,H). Däremot kunde vi inte påvisa någon typisk dos-responsökning av OCR med ADP i någon av celltyperna (Figur 6C,D), i motsats till vad denna metod visar vid användning av högmetaboliska vävnader som muslever (Figur 7A-H). Å andra sidan gjorde användningen av TMRM det möjligt för oss att upptäcka en gradvis minskning av mMP med ADP i humana immunceller (Figur 6E-G) och i mjält-T-celler från möss (Figur 7E-H). Även om vi inte direkt jämförde mänskliga och mus-T-celler med samma titreringsprotokoll, fann vi att IC50 för T-celler från möss var lägre med en faktor 10 jämfört med den för cirkulerande T-celler från mänskliga försökspersoner.
Figur 3: Högupplösta fluorespiromerexperiment (A-D) Spår av högupplösta fluorespirometriexperiment med T-cellskoncentrationer på 10 miljoner celler/ml och 2,5 miljoner celler/ml i 0,5 ml kammare. (A) 10 miljoner celler/ml i 0,5 ml kammare. (C) 2,5 miljoner celler/ml i 0,5 ml kammare. Syreflödet (pmol/s/ml) visas i den övre panelen (röd) och den kalibrerade TMRM-signalen visas i den nedre panelen (svart). Förändringar i TMRM under hela SUIT för provet och dess beräknade bakgrund plottades för kamrarna som innehöll (B) 10 miljoner celler/ml och (D) 2,5 miljoner celler/ml. (E) För varje cellkoncentration beräknades syreflödet (pmol/s/miljon celler) och (F) mitokondriell membranpotential. (G) ADP-känslighetskurvan ritades ut och anpassades till en icke-linjär regressionsmodell (heldragna linjer). Förkortningar: mMP, mitokondriell membranpotential; TMRM, tetrametylrhodaminmetylester; SUIT, titreringar av substrat-frånkopplare-inhibitor; ADP, adenosindifosfat; Gräva, digitonin; Mal, malat; Pyrr, pyruvat; Glutamat, glutamat; D1-11, 11 på varandra följande ADP-titreringar; U, frånkopplare FCCP på 0,5 och 1,0 μM; AMA, antimycin A. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: ATP-syntas driver ADP-driven minskning av membranpotentialen i T-celler och PBMC. (A-H) Protokollet som beskrivs här testades på PBMC och T-celler. Två O2K-kammare injicerades med PBMC, och två kammare med ytterligare O2K injicerades med T-celler från samma deltagare. Efter att ha injicerat substraten malat, pyruvat och glutamat i alla kammare fick en kammare med PBMC och T-celler oligomycin. Oligomycin förhindrade en ADP-driven ökning av andningen i (A) PBMC och (D) T-celler eller minskning av mitokondriell membranpotential i (B,C) PBMC och (E,F) T-celler. (G,H) ADP-känsligheten var större hos PBMC jämfört med T-celler. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Blankexperiment visar förändringen i TMRM-fluorescens som svar på tid och titreringar av substrat, kopplare och hämmare (SUIT). (A) Förändring i TMRM-fluorescens som svar på titrering. (B) Förändring i TMRM-fluorescens som svar på tid. Experimenten utfördes i 0,5 ml kammare fyllda med Mir05 innehållande 1 μM TMRM. En kammare fick inga SUIT-titreringar (ingen injektion); två kammare i två olika instrument fick ett standarddräktsprotokoll (standardinjektion); En kammare fick samma SUIT-titreringar men med en fördröjning mellan varje injektion (fördröjd injektion). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Skillnader i ADP-känslighet mellan T-celler och monocyter med hjälp av OCR och mMP. (A) Spår av högupplöst fluorespiromometriexperiment från en försökspersons monocyt- och T-cellsprov. (B) Syreförbrukning i monocyter (n= 11) och T-celler (n= 13) från blod från friska frivilliga. (C,D) Icke-linjär regressionsanpassning av den plottade ökningen av respiration med ADP-titreringar för att beräkna ett EC50. E) Samtidig mätning av mitokondriell membranpotential. (F,G) Icke-linjär regressionsanpassning av den plottade minskningen av mitokondriell membranpotential med ADP-titreringar för att beräkna en IC50. H) Parametrar för andningskapaciteten hos monocyter och T-celler. Data uttrycks som medelvärde ± SEM för linjediagram och medelvärde ± SD för stapeldiagram. Statistiskt signifikanta skillnader efter t-tester uttrycks som *p < 0,05. **p < 0,01 och ****p < för 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Jämförelse av ADP-svar i andning och mitokondriell membranpotential (mMP) i permeabiliserade mjält-T-celler och lever. (A-D) Respons i andning i permeabiliserade mjält-T-celler och lever. (E-H) Respons i mMP i permeabiliserade mjält-T-celler och lever hos möss. Färsk lever och mjälte dissekerades från tre möss efter cervikal luxation. Mjälten T-celler isolerades med hjälp av antikroppskonjugerad magnetisk pärlseparation. Båda proverna genomgick samma SUIT-protokoll i närvaro av 1 μM TMRM. (I,J) Jämförelse av EC50 beräknad från ökningen av syreförbrukning (OCR) och IC50 från minskningen av mMP som svar på ADP. N = 3 per grupp. Data uttrycks som medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Exempel på SUIT-protokoll för att bedöma mitokondriell membranpotential i nyligen isolerade T-celler och monocyter med hjälp av 0,5 ml-kamrarna. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Rekommenderad ADP-titrering för 0,5 ml kammare. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 3: Beräkning av det genomsnittliga bakgrundsförhållandet med hjälp av fem oberoende blankprov. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 4: Beräkning av mitokondriell membranpotential (mMP) från provexperiment. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande figur 1: Effekt av Mir05 och DMSO på mitokondriell andning och membranpotential. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 1: Beredning av reagens och protokoll för isolering av T-celler från mjälte hos möss. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Detta protokoll använder högupplöst fluorespiromemetri för att mäta känsligheten hos det mitokondriella svaret på energibehov genom att mäta förlusten av mMP som svar på ökande nivåer av ADP i PBMC, monocyter och T-celler. Detta görs genom att tillsätta komplexa I- och II-substrat för att maximera mitokondriernas membranpotential och titrera ADP för att gradvis stimulera ATP-syntas för att använda protongradienten för ATP-generering.
Kritiska steg i protokollet inkluderar att ställa in fluoroforens förstärkning och intensitet till 1000 och se till att en TMRM-fluorescerande signal förvärvas under TMRM-titreringen. Eftersom TMRM-fluorescensen minskar efter varje titrering (en begränsning med denna metod) är det absolut nödvändigt att köra bakgrundsexperiment med tomma prover. Vi har också funnit att DMSO har en hämmande effekt på mitokondriell andning och membranpotential och rekommenderar därför spädning av arbetslösningen av TMRM i Mir05 (Kompletterande Figur 1).
Några modifieringar som kan användas när du provar detta protokoll är att justera cellkoncentrationerna och använda standardkammaren på 2 ml. Kammaren på 0,5 ml är dock att föredra för T-celler och monocyter på grund av den höga koncentrationen av celler som behövs för optimal respons på membranpotential och syreflöde. En lägre koncentration av celler kan vara optimal när man testar celler med större andningskapacitet, som makrofager.
Ytterligare begränsningar med den metod som presenteras här är kravet på minst 5 miljoner T-celler och 2,5 miljoner monocyter. Vi kan ofta få tillräckligt med celler från ~20 ml blod från friska deltagare, men dessa siffror kan variera beroende på hälsotillstånd, ålder och kön26. Dessutom, som i de flesta metoder för att bedöma mitokondriell kapacitet, måste cellerna isoleras på nytt. Denna metod skulle dock kunna testas i kryokonserverade celler i framtiden. I jämförelse med utbytet från mänskligt blod är T-cellsutbytet från mjälten hos friska möss tillräckligt högt för att utföra denna analys.
Cirkulerande T-celler, särskilt långlivade minnesceller (TM) och regulatoriska celler (Treg), är beroende av oxidativ fosforylering för energi37. Även om deras energibehov och syreförbrukning är låga (t.ex. jämfört med den för vilande muskler), är deras överlevnad avgörande för ett effektivt immunsvar mot återinfektion och cancer 38,39,40. En minskning av T-cells oxidativ fosforylering resulterar i försämrad proliferativ kapacitet och främjar T-cellsutmattning och åldrande 5,41. Dessutom främjar mitokondriell hyperpolarisering en ihållande produktion av cytokiner (IL-4 och IL-21) av effektorns CD4 T-celler under aktivering42. Vid infektion kan energibehovet för aktivering och proliferation av immunceller vara så högt som 25%-30% av den basala ämnesomsättningen43. Därför fungerar immunceller inom ett brett och extremt spektrum av energibehov, och detta protokoll kan testa mitokondriella svar inom det intervallet.
Kronisk inflammation är ett vanligt inslag i fetma, diabetes och åldrande. Dysreglerade nivåer av cirkulerande hormoner, lipider och glukos har systemiska effekter och kan därmed påverka hur mitokondrier svarar på en energetisk utmaning. Här har vi presenterat en metod för att bedöma mitokondriell ADP-känslighet i cirkulerande PBMC. Ytterligare studier behövs för att avgöra hur ADP-känslighet kan moduleras vid metabol sjukdom och hur det påverkar hälsotillståndet.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi vill tacka de vänliga volontärer som donerade blod till detta projekt. Vi uttrycker också vår uppriktiga uppskattning till Dr. Ellen Schur och hennes team för att ha försett oss med ytterligare prover från deras studie. Vi vill också tacka Andrew Kirsh för att ha granskat manuskriptet och redigerat det för läsbarhet. Detta arbete stöddes av följande finansieringskällor: P01AG001751, R01AG078279, P30AR074990, P30DK035816, P30DK017047, R01DK089036, K01HL154761, T32AG066574.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine Diphosphate | Sigma-Aldrich | A5285 | Fluorespirometry |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Fluorespirometry |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003 | Mir05 buffer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A6003 | Cell isolation |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | Fluorespirometry |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | Isolation of T-cells from mouse spleen protocol |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | Cell isolation |
| CD3 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | Cell isolation |
| DatLab | Oroboros | Version 8 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | Fluorespirometry |
| D-Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Mir05 buffer |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | Mir05 buffer |
| Filter Set AmR | Oroboros | 44321-01 | |
| HBSS (10x) | Gibco | 12060-040 | |
| HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich | H7523 | Mir05 buffer |
| Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | Cell isolation |
| K2EDTA blood collection tubes | BD Vacutainer | 366643 | Cell isolation |
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | Mir05 buffer |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1626 | Fluorespirometry |
| L-Malic Acid | Sigma-Aldrich | M1000 | Fluorespirometry |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Cell isolation |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | Mir05 buffer |
| Multi-MACS stand and MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-301 | Cell isolation |
| O2k-Fluo Smart-Module | Oroboros | 12100-03 | |
| O2k-FluoRespirometer series J | Oroboros | 10201-03 | |
| O2k-sV-Module (0.5 chamber) | Oroboros | 11200-01 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 04876 | Fluorespirometry |
| Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi | 130095130 | Isolation of T-cells from mouse spleen protocol |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | Mir05 buffer |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | Mir05 buffer |
| Prism | GraphPad | Version 10 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Fluorespirometry |
| RPMI Buffer | Corning | 17-105-CV | Cell isolation |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Fluorespirometry |
| Succinate disodium salt | Sigma-Aldrich | S2378 | Fluorespirometry |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | Mir05 buffer |
| Tetramethyrhodamine methyl ester perchlorite | Sigma-Aldrich | T5428 | Fluorespirometry |
References
- Eisner, V., Picard, M., Hajnóczky, G. Mitochondrial dynamics in adaptive and maladaptive cellular stress responses. Nat Cell Biol. 20 (7), 755-765 (2018).
- Sokolova, I. Bioenergetics in environmental adaptation and stress tolerance of aquatic ectotherms: linking physiology and ecology in a multi-stressor landscape. J Exp Biol. 224 (Pt Suppl 1), jeb.236802 (2021).
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312 (Pt 1), 163-167 (1995).
- Schmid, D., Burmester, G. R., Tripmacher, R., Kuhnke, A., Buttgereit, F. Bioenergetics of human peripheral blood mononuclear cell metabolism in quiescent, activated, and glucocorticoid-treated states. Biosci Rep. 20 (4), 289-302 (2000).
- Vardhana, S. A., et al. Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation limits the self-renewal of T cells exposed to persistent antigen. Nat Immunol. 21 (9), 1022-1033 (2020).
- Nelson, S. R., Li, A., Beck-Previs, S., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M. Imaging ATP consumption in resting skeletal muscle: One molecule at a time. Biophys J. 119 (6), 1050-1055 (2020).
- Meyrat, A., von Ballmoos, C. ATP synthesis at physiological nucleotide concentrations. Sci Rep. 9 (1), 3070 (2019).
- Gouspillou, G., et al. Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20709 (2011).
- Holloway, G. P., et al. Age-associated impairments in mitochondrial ADP sensitivity contribute to redox stress in senescent human skeletal muscle. Cell Rep. 22 (11), 2837-2848 (2018).
- Pharaoh, G., Brown, J., Ranjit, R., Ungvari, Z., Van Remmen, H. Reduced adenosine diphosphate sensitivity in skeletal muscle mitochondria increases reactive oxygen species production in mouse models of aging and oxidative stress but not denervation. JCSM Rapid Commun. 4 (1), 75-89 (2021).
- Pharaoh, G., et al. The mitochondrially targeted peptide elamipretide (SS-31) improves ADP sensitivity in aged mitochondria by increasing uptake through the adenine nucleotide translocator (ANT). Geroscience. 45 (6), 3529-3548 (2023).
- Brunetta, H. S., Petrick, H. L., Vachon, B., Nunes, E. A., Holloway, G. P. Insulin rapidly increases skeletal muscle mitochondrial ADP sensitivity in the absence of a high lipid environment. Biochem J. 478 (13), 2539-2553 (2021).
- Brunetta, H. S., et al. Nitrate consumption preserves HFD-induced skeletal muscle mitochondrial ADP sensitivity and lysine acetylation: A potential role for SIRT1. Redox Biol. 52, 102307 (2022).
- Tyrrell, D. J., et al. Blood-cell bioenergetics are associated with physical function and inflammation in overweight/obese older adults. Exp Gerontol. 70, 84-91 (2015).
- Liepinsh, E., et al. Low-intensity exercise stimulates bioenergetics and increases fat oxidation in mitochondria of blood mononuclear cells from sedentary adults. Physiol Rep. 8 (12), e14489 (2020).
- Hedges, C. P., et al. Peripheral blood mononuclear cells do not reflect skeletal muscle mitochondrial function or adaptation to high-intensity interval training in healthy young men. J Appl Physiol (1985). 126 (2), 454-461 (2019).
- DeConne, T. M., Muñoz, E. R., Sanjana, F., Hobson, J. C., Martens, C. R. Cardiometabolic risk factors are associated with immune cell mitochondrial respiration in humans. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 319 (2), H481-H487 (2020).
- Zhou, B., et al. Boosting NAD level suppresses inflammatory activation of PBMCs in heart failure. J Clin Invest. 130 (11), 6054-6063 (2020).
- Altintas, M. M., DiBartolo, S., Tadros, L., Samelko, B., Wasse, H. Metabolic changes in peripheral blood mononuclear cells isolated from patients with end stage renal disease. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 629239 (2021).
- Pence, B. D., Yarbro, J. R. Aging impairs mitochondrial respiratory capacity in classical monocytes. Exp Gerontol. 108, 112-117 (2018).
- van der Windt, G. J. W., Chang, C. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T Cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Curr Protoc Immunol. 113, 3.16B.11-3.16B.14 (2016).
- Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).
- Buck, M. D., et al. Mitochondrial dynamics controls T Cell fate through metabolic programming. Cell. 166 (1), 63-76 (2016).
- Quinn, K. M., et al.
- Scandalis, L., et al. Skeletal muscle mitochondrial respiration and exercise intolerance in patients with heart failure with preserved ejection fraction. JAMA Cardiol. 8 (6), 575-584 (2023).
- Rausser, S., et al. Mitochondrial phenotypes in purified human immune cell subtypes and cell mixtures. Elife. 10, e70899 (2021).
- Kramer, P. A., et al. Bioenergetics and the oxidative burst: protocols for the isolation and evaluation of human leukocytes and platelets. J Vis Exp. 85, 51301 (2014).
- Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biol. 2, 206-210 (2014).
- Teodoro, J. S., Machado, I. F., Castela, A. C., Rolo, A. P., Palmeira, C. M. The evaluation of mitochondrial membrane potential using fluorescent dyes or a membrane-permeable cation (TPP+) electrode in isolated mitochondria and intact cells. Methods Mol Biol. 2184, 197-213 (2020).
- Hassan, H., Zakaria, F., Makpol, S., Karim, N. A. A link between mitochondrial dysregulation and idiopathic autism spectrum disorder (ASD): Alterations in mitochondrial respiratory capacity and membrane potential. Curr Issues Mol Biol. 43 (3), 2238-2252 (2021).
- Williams, A. S., et al. Disruption of Acetyl-Lysine turnover in muscle mitochondria promotes insulin resistance and redox stress without overt respiratory dysfunction. Cell Metab. 31 (1), 131-147.e111 (2020).
- Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
- Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Biosci Rep. 36 (1), e00286 (2015).
- Vianello, C., et al. High-throughput microscopy analysis of mitochondrial membrane potential in 2D and 3D models. Cells. 12 (7), (2023).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).
- Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
- Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. J Clin Invest. 123 (10), 4479-4488 (2013).
- Gerriets, V. A., et al. Foxp3 and Toll-like receptor signaling balance T. Nat Immunol. 17 (12), 1459-1466 (2016).
- MacIver, N. J., Michalek, R. D., Rathmell, J. C.
- Desdín-Micó, G., et al. T cells with dysfunctional mitochondria induce multimorbidity and premature senescence. Science. 368 (6497), 1371-1376 (2020).
- Yang, R., et al. Mitochondrial Ca2+ and membrane potential, an alternative pathway for Interleukin 6 to regulate CD4 cell effector function. Elife. 4, e06376 (2015).
- Straub, R. H., Cutolo, M., Buttgereit, F., Pongratz, G. Energy regulation and neuroendocrine-immune control in chronic inflammatory diseases. J Intern Med. 267 (6), 543-560 (2010).
