Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Højopløselig fluorespirometri til vurdering af dynamiske ændringer i mitokondriemembranpotentiale i humane immunceller

Published: May 24, 2024 doi: 10.3791/66863
Automatic Translation
1, 2, 1, 2,3
1Division of Metabolism, Endocrinology and Nutrition, Department of Medicine, University of Washington, 2Department of Radiology, University of Washington, 3Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Washington

Summary

Metoder til at studere mitokondriel bioenergetik under fysiologisk relevante substratkoncentrationer i immunceller er begrænsede. Vi leverer en detaljeret protokol, der bruger højopløsningsfluorespirometri til at vurdere ændringer i mitokondriemembranpotentialets respons på energibehov i humane T-celler, monocytter og perifere mononukleære celler.

Abstract

Perifere mononukleære celler (PBMC'er) udviser robuste ændringer i mitokondriel respirationskapacitet som reaktion på sundhed og sygdom. Selvom disse ændringer ikke altid afspejler, hvad der sker i andre væv, såsom skeletmuskulatur, er disse celler en tilgængelig og værdifuld kilde til levedygtige mitokondrier fra mennesker. PBMC'er udsættes for systemiske signaler, der påvirker deres bioenergetiske tilstand. Udvidelse af vores værktøjer til at undersøge mitokondriel metabolisme i denne population vil således belyse mekanismer relateret til sygdomsprogression. Funktionelle analyser af mitokondrier er ofte begrænset til at bruge respiratoriske output efter maksimale substrat-, inhibitor- og uncoupler-koncentrationer for at bestemme hele spektret af respirationskapacitet, som muligvis ikke kan opnås in vivo. Omdannelsen af adenosindiphosphat (ADP) til adenosintrifosfat (ATP) ved hjælp af ATP-syntase resulterer i et fald i mitokondriemembranpotentialet (mMP) og en stigning i iltforbruget. For at give en mere integreret analyse af mitokondriedynamik beskriver denne artikel brugen af højopløsningsfluorespirometri til at måle den samtidige respons af iltforbrug og mitokondriemembranpotentiale (mMP) på fysiologisk relevante koncentrationer af ADP. Denne teknik bruger tetramethylrhodaminmethylester (TMRM) til at måle mMP-polarisering som reaktion på ADP-titreringer efter maksimal hyperpolarisering med komplekse I- og II-substrater. Denne teknik kan bruges til at kvantificere, hvordan ændringer i sundhedstilstand, såsom aldring og metabolisk sygdom, påvirker følsomheden af mitokondriel respons på energibehov i PBMC'er, T-celler og monocytter fra mennesker.

Introduction

En celles evne til at fungere og overleve i en periode med fysiologisk stress er i høj grad afhængig af dens evne til at opfylde det energetiske behov for at genoprette homeostase 1,2. Energiefterspørgslen stiger som reaktion på en række forskellige stimuli. For eksempel øger øget muskelsammentrækning under træning udnyttelsen af ATP og glukose i skeletmuskulaturen, og en stigning i proteinsyntese efter infektion øger immuncellernes udnyttelse af ATP til cytokinproduktion og -spredning 3,4,5,6. En stigning i energiefterspørgslen udløser en række bioenergetiske processer for at genoprette ATP/ADP-forholdet. Når ATP indtages, stiger ADP-niveauerne og stimulerer F1F0 ATP-syntase (kompleks V), som kræver en protonaktiv kraft til at drive dens mekaniske rotation og katalytiske omdannelse af ADP til ATP i mitokondriet7. Protonkraften er en elektrokemisk gradient skabt ved pumpning af protoner under overførsel af elektroner fra substrater til ilt gennem elektrontransportsystemet (ETS) i den indre mitokondriemembran. Den resulterende forskel i protonkoncentration (delta pH) og elektrisk potentiale (membranpotentiale) skaber den protondrevne kraft, der driver ATP-syntese og iltforbrug som reaktion på energibehov, hvilket reducerer ATP/ADP-forholdet eller hæver ADP-niveauet. Mitokondriernes affinitet til ADP kan bestemmes ved beregning af Km eller EC50 for ADP-stimuleret respiration af isolerede mitokondrier eller permeabiliserede celler 8,9. Denne metode har vist, at permeabiliserede muskelfibre fra ældre mennesker kræver en større koncentration af ADP for at stimulere 50 % af deres maksimale oxidative fosforyleringskapacitet end hos yngre forsøgspersoner9. På samme måde kræver aldrende museskeletmuskulatur mere ADP for at sænke produktionen af mitokondrielle reaktive iltarter (ROS)10,11. Derudover reduceres ADP-følsomheden i permeabiliserede muskelfibre hos mus med diætinduceret fedme i forhold til kontroller og forbedres i nærvær af insulin og efter nitratforbrug 12,13. Mitokondriernes evne til at reagere på energibehovet varierer således under forskellige fysiologiske forhold, men dette er ikke tidligere blevet undersøgt i forbindelse med immunceller.

Perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) bruges almindeligvis til at undersøge cellulær bioenergetik hos mennesker 14,15,16,17,18,19,20. Dette skyldes i høj grad, at celler let kan fås fra ukoagulerede blodprøver i kliniske undersøgelser, cellernes reaktionsevne på metaboliske forstyrrelser og de metoder, der er udviklet af forskellige grupper til at undersøge mitokondriemetabolisme ved hjælp af inhibitorer og afkoblinger til at bestemme den maksimale og minimale kapacitet af mitokondrieåndedræt 21,22. Disse metoder har ført til en forståelse af bioenergetiske stoffers rolle i aldring, metaboliske sygdomme og immunfunktion 14,20,23,24. Mitokondriel respirationskapacitet er ofte reduceret i skeletmuskulatur og PBMC'er under tilstande med hjertesvigt18,25. PBMC bioenergetik er også korreleret med kardiometaboliske risikofaktorer hos raske voksne17 og reagerer på behandlinger såsom nikotinamidribosid18. PBMC'er omfatter neutrofiler, lymfocytter (B-celler og T-celler), monocytter, naturlige dræberceller og dendritiske celler, som alle bidrager til PBMC-mitokondriekapacitet 26,27,28. Derudover spiller cellulær bioenergetik en afgørende rolle i immuncelleaktivering, proliferation og fornyelse23. En begrænsning ved disse metoder er imidlertid, at cellerne ikke fungerer under et fysiologisk udvalg af substrater. Der kræves derfor yderligere metoder til at undersøge mitokondriefunktion i substratkoncentrationer, der er mere relevante for, hvad celler oplever in vivo.

Mitokondriemembranpotentiale (mMP) er hovedkomponenten i en protonmotorisk kraft og er afgørende for en række mitokondrielle processer ud over ATP-produktion, såsom regulering af respiratorisk flux, produktion af reaktive iltarter, protein- og ionimport, autofagi og apoptose. mMP kan vurderes med elektrokemiske sonder eller fluorescerende farvestoffer, der er følsomme over for ændringer i membranpolarisering som JC-1, Rhod123, DiOC6, tetramethylrhodamin (TMRE) eller methylester (TMRM) og safranin. De to sidstnævnte er lipofile kationiske farvestoffer, der med succes er blevet brugt i højopløselig fluorespirometri af vævshomogenater, isolerede mitokondrier og permeabiliseret væv 11,29,30,31,32,33. I denne teknik bruges TMRM i quench-tilstand, hvor celler udsættes for en høj koncentration af TMRM, der akkumuleres i mitokondriematrixen, når den polariseres (høj mMP og protonmotorisk kraft), hvilket resulterer i slukning af cytosolisk TMRM-fluorescens. Når mitokondrier depolariseres som reaktion på ADP eller afkoblinger, frigives farvestoffet fra matrixen, hvilket øger TMRM-fluorescerende signal34,35. Formålet med denne metode er samtidig at måle ændringer i mitokondriel respiration og mMP som reaktion på ADP-titreringer i humant afledte PBMC'er, cirkulerende monocytter og T-celler, og den kan også anvendes på T-celler fra musemilt.

Protocol

Indsamlingen af blodprøver til data- og metodeudvikling, der præsenteres heri, blev godkendt af Internal Review Board ved University of Washington. Repræsentative resultater inkluderer også data fra hanmus C57BL/6J (5-7 måneder gamle) købt fra Jackson Laboratories. Alle dyreforsøg blev godkendt af University of Washington Office of Animal Welfare. Protokoloversigten er afbilledet i figur 1. Reagensforberedelse til denne protokol kan findes i supplerende fil 1.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over protokollen. Arbejdsgang ved hjælp af højopløselig fluorespirometri til at vurdere ændringer i mitokondriemembranpotentiale i isolerede monocytter (CD14+) og T-celler (CD3+) fra friske humane blodprøver. Forkortelser: TMRM, tetramethylrhodamin methylester; SUIT, substrate-uncoupler-inhibitor titreringer; ADP, adenosindiphosphat; Dig, digitonin; Mal, malat; Pyr, pyruvat; Glut, glutamat; D1-10, 10 på hinanden følgende ADP-titreringer. Klik her for at se en større version af denne figur.

1. Adskillelse af buffy coat fra fuldblod

BEMÆRK: Celleisolering er modificeret fra Kramer et al.27.

  1. Lad RPMI, densitetsgradient og centrifuge nå stuetemperatur. Steriliser biosikkerhedsskabet og materialerne inden start.
  2. Opsaml venøst blod i tre 10 ml K2EDTA-rør. Vend rørene mindst 3 gange.
  3. Centrifuger rørene ved 500 x g 10 min (22 °C, 9 acceleration [acc], 2 deceleration [dec]).
  4. Fjern 1 ml plasma fra hvert rør og opbevar ved -80 °C til fremtidige analyser.
  5. Overfør plasmaet og halvdelen af det røde blodlegemelag fra hvert rør til et enkelt 50 ml konisk rør. Tilføj RPMI op til 40 ml-mærket. Vend mindst 3 gange.
  6. Læg langsomt 10 ml af plasmaopløsningen i fire 15 ml koniske rør indeholdende 3 ml af densitetsgradienten.
  7. Centrifuger ved 700 x g i 30 minutter (22 °C, 5 acc, 2 dec).
  8. Opsaml alt plasma og den buffy coat, der indeholder de perifere mononukleære celler (PBMC'er) uden at forstyrre de røde blodlegemer.
  9. Centrifuger ved 500 x g i 10 minutter (22 °C, 5 acc, 5 dec) og aspirer supernatanten.
  10. Vask PBMC-pillen 1x-2x ved at opløse den i 10 ml RPMI og centrifugere ved 500 x g i 10 min (22 °C, 5 acc, 5 dec).

2. Magnetisk adskillelse af CD14+ og CD3+ celler

  1. Placer en søjle i magnetfeltet på en magnetisk celleseparator (se materialetabellen). Vask søjlen med 3 ml RP-5.
  2. Resuspender PBMC-pelleten i 80 μL RP-5 og 20 μL anti-CD14-mikroperler (se materialetabellen). Inkuber i 15 minutter ved 4 °C.
  3. Ophæng cellerne igen med 1 ml RP-5 og læg suspensionen på søjlen. Saml umærkede celler, der strømmer igennem i et 15 ml konisk rør mærket "Gennemstrømning 1". Vent, indtil al cellesuspension er gået gennem søjlen, og fortsæt derefter med at vaske med 3 ml RP-5 3x, og opsaml al gennemstrømning.
  4. Fjern forsigtigt søjlen fra magnetfeltet og placer den på et nyt 15 ml konisk rør. Tilsæt 5 ml RP-5 og brug straks stemplet til at rense kolonneindholdet i et opsamlingsrør mærket "CD14+".
  5. Centrifuger "Gennemstrømning 1" ved 500 x g i 10 minutter (22 °C, 5 acc, 5 dec) og aspirer supernatanten.
  6. Brug celler fra gennemstrømning 1 til at gentage trin 2.2-2.5 ved hjælp af anti-CD3-mikroperler (se materialetabellen) for at isolere T-celler.
  7. Centrifuger rør indeholdende T-celler (CD3+) og monocytter (CD14+) ved 300 x g i 5 min. Opsug supernatanten og ophæng pelleten i 1 ml RP-5.
  8. Bestem cellekoncentrationen ved hjælp af et hæmocytometer eller automatisk celletæller.
    BEMÆRK VENLIGST: Celler kan tælles ved at tilføje 10 μL af en cellefortynding på 1:10 eller 1:20 til et hæmocytometer. Man kan henvise til tidligere offentliggjorte protokoller til at tælle celler ved hjælp af et hæmocytometer36.
  9. Pipettere 2,5 millioner monocytter eller 5 millioner T-celler i et nyt centrifugerør. Centrifuger i 30 s ved 2000 x g, aspirer supernatanten og resuspender cellerne i MiR05 til et samlet volumen på 20 μL og en slutkoncentration på 125 millioner monocytter eller 250 millioner T-celler pr. ml.
    BEMÆRK: Den endelige koncentration blev valgt til at injicere 2,5 millioner monocytter eller 5 millioner T-celler i et volumen på 20 μL. Muse-T-celler isoleret fra milten er også blevet testet ved hjælp af denne metode. Proceduren findes i supplerende sag 1.

3. Fluorespirometri i høj opløsning - Kalibrering af ilt og TMRM-fluorescens

BEMÆRK: Denne metode blev tilpasset fra tidligere arbejde udført på permeabiliserede fibre af Pharaoh et al.11. En høj, uhæmmende koncentration af TMRM bruges til quench-tilstand, hvor forholdet mellem mMP og TMRM-koncentration i matrixen er inverteret. Således fører et fald i mMP til frigivelse af TMRM-farvestof fra matrixen og en stigning i fluorescens32.

  1. Installer 0.5 ml kamre i O2K-respirometeret i henhold til producentens anvisninger (se materialetabellen). Tænd for instrumentet, og tilslut det til softwaren fra producenten til dataindsamling.
  2. Juster temperaturen til 37 °C og omrøringshastigheden til 750 omdr./min.
  3. Vask kamrene med destilleret vand 3x. Udskift vand med 0.54 ml Mir05, luk propperne helt, og fjern overskydende buffer med det integrerede sugesystem (ISS). Hæv propperne for at lade rumilt komme i ligevægt med kammerilt ved hjælp af en prop-afstandsstykker.
  4. Når iltfluxen er stabil, skal du udføre luftiltkalibreringen (R1) i henhold til producentens anvisninger.
    BEMÆRK VENLIGST: Det kan tage >30 minutter for iltfluxen at stabilisere sig. Iltsensorer kræver bestemmelse af nulpunktsilt (R0) og baggrundsiltflux fra 50-200 μM fra separate eksperimenter ved hjælp af dithionittitreringer. Specifikke metoder kan findes i producentens manual.
  5. Forsegl kammeret ved at lukke propperne.
    BEMÆRK: I modsætning til eksperimenter med permeabiliserede fibre, kræver kamrene ikke hyperiltning til PBMC'er. Iltniveauet bør holdes mellem 50-250 μM. Hvis iltkoncentrationen falder under tærsklen, kan kammeret åbnes delvist, så kammerets ilt kan komme i ligevægt med rumluftens ilt.
  6. TMRM kalibrering
    1. Brug de grønne LED-fluo-sensorer (f.eks. 525 nm) med AmR-filtersættet (se materialetabellen). Indstil fluorometerforstærkning til 1000 og intensitet til 1000. Tænd for fluo-sensorerne, og begynd at registrere baseline.
    2. Injicer 2,5 μL 0,05 mM TMRM og lad signalet stabilisere sig (~2 min) før den næste 2,5 μL injektion, indtil der udføres i alt 4 injektioner for en samlet TMRM-koncentration på 1 μM TMRM i kammeret. Brug en Hamilton sprøjte til alle injektioner.
    3. Kalibrer fluo-sensoren ved at vælge det fluorescerende signal (voltage) for hver injektion, der repræsenterer 0, 0,25, 0,5, 0,75 og 1,0 μM TMRM for en fempunktskalibrering.

4. Protokol for titrering af substrat-afkoblingshæmmere (SUIT)

BEMÆRK: Kør blanke eksperimenter, hvor 20 μL Mir05 injiceres i kammeret i stedet for 20 μL cellesuspension, da TMRM-signalet vil ændre sig som reaktion på injektioner alene (diskuteret i repræsentative resultater). Tillad iltfluxsignalet at stabilisere sig (ca. 2-3 min) før den næste injektion for både blind- og prøveforsøg. Følgende titreringsprotokol og forventede observationer findes i tabel 1.

  1. Når iltfluxen er stabil, skal du vælge og mærke både iltfluxen og TMRM-signalet "pre-cell".
  2. Injicer cellesuspensionen, der indeholder enten 5 millioner T-celler eller 2,5 millioner monocytter i ~20 μL og mål i ca. 10 minutter. Vælg og mærk både iltfluxen og TMRM-signalet som "Celle".
  3. Permeabiliser celler ved at injicere 2 μL 1 mg/ml digitonin (slutkoncentration: 4 μg/ml). Vent i 20 min. Vælg og mærk både iltfluxen og TMRM-signalet som "Dig".
    BEMÆRK: Det foreslås at optimere digitoninkoncentrationen i separate eksperimenter.
  4. Tilsæt 2,5 μL 1 M succinat (endelig koncentration: 5 mM). Vælg og mærk både iltfluxen og TMRM-signalet som "SUCC".
  5. Når iltfluxen er stabil, tilsættes 5 μL 100 mM malat (slutkoncentration: 1,0 mM), 5 μL 1 M glutamat (slutkoncentration: 10 mM) og 5 μL 500 mM pyruvat (slutkoncentration: 5 mM). Vælg og mærk både iltfluxen og TMRM-signalet som "MPG".
  6. Når iltfluxen er stabil, titreres ADP. Vælg hastigheder for hver titrering, og mærk dem "D" sekventielt 1 til 10, afhængigt af antallet af titreringer. Brug titreringsskemaet i tabel 2.
  7. Når iltfluxen er stabil, skal du udføre en serie af 1 μL titreringer af 0,25 mM carbonylcyanid p-(tri-fluromethoxy) phenyl-hydrazone (FCCP), indtil det fluorescerende signal når sit maksimum. Vælg og mærk både iltfluxen og TMRM-signalet, der repræsenterer det minimale membranpotentiale, og mærk det "FCCP".
    BEMÆRK VENLIGST: FCCP-koncentration på 0,5-1,0 μM er normalt påkrævet for at nedbryde mitokondriemembranpotentialet.
    FORSIGTIG: FCCP er giftigt. Se sikkerhedsdatabladet (SDS) for korrekt håndtering.
  8. VALGFRIT: Når iltfluxen er stabil, injiceres 1 μL 0,25 mM rotenon for at hæmme kompleks I og bestemme respirationskapaciteten gennem kompleks II.
    BEMÆRK: Ændringer i membranpotentiale er ikke længere relevante efter titrering med afkobling.
    FORSIGTIG: Rotenon er giftigt. Se sikkerhedsdatabladet for korrekt håndtering.
  9. Når iltfluxen er stabil, injiceres 1 μL 1,25 mM (slutkoncentration: 2,5 μM) Antimycin A for at hæmme mitokondriel respiration.
    FORSIGTIG: Antimycin A er giftigt. Se sikkerhedsdatabladet for korrekt håndtering.

5. Beregning af mitokondriemembranpotentiale og analyse

  1. Ved hjælp af blindprøver registreres de kalibrerede TMRM-værdier (mikromolar TMRM) før injektionen af blindprøven ("pre-sample") og for hver af injektionerne. Se figur 2.
  2. For hvert blindeksperiment beregnes baggrundsforholdet ved at indstille "pre-sample" TMRM-koncentrationen til 1.0. Beregn det efterfølgende proportionale fald i TMRM. Beregn det gennemsnitlige baggrundsforhold fra alle tomme eksperimenter.
    BEMÆRK: Antallet af tomme eksperimenter, der skal inkluderes, kan afhænge af instrumentets præcision. Se beregningseksemplet i tabel 3 fra fem forskellige blindforsøg, hvor standardafvigelsen for det gennemsnitlige baggrundsforhold faldt mellem 0 og 0,016 for hver titrering.
  3. Baggrundsberegning: Beregn baggrunden for hvert prøveeksperiment ved at gange "pre-sample" TMRM for prøveeksperimentet gange det gennemsnitlige baggrundsforhold for hver injektion. Se beregningseksemplet i tabel 3.
  4. Baggrundskorrektion: Træk eksperimentets baggrund fra de målte TMRM-værdier for prøven. Se beregningseksemplet i tabel 4.
  5. FCCP-korrektion: Træk den FCCP-baggrundskorrigerede mMP fra hver injektion. Se beregningseksemplet i tabel 4.
  6. ADP-følsomhedskurve: Normaliser det ADP-drevne fald i mMP ved at indstille det højeste og laveste membranpotentiale til henholdsvis 100 % og 0 % ved hjælp af de mMP-værdier, der er indsamlet gennem ADP-titreringen. Tilpas dataene ind i en ikke-lineær tilpasningsregressionsmodel ved hjælp af den foretrukne statistiske software til at beregne den halvmaksimale hæmmende koncentration (IC50) af ADP på mMP.
    BEMÆRK: Kurven passer til [Inhibitor] vs. normaliseret respons - Variabel hældning i Prisme.

Figure 2
Figur 2: Beregning af mitokondriemembranpotentiale (mMP) og ADP-følsomhed ud fra TMRM-fluorescens. Trin til beregning af mitokondriemembranpotentiale (mMP) og ADP-følsomhed fra målinger af TMRM-fluorescens ved højopløsningsfluorespirometri af en prøve af T-celler (n = 1). Trin 1: TMRM-fluorescens måles i blindprøver som gjort i den biologiske prøve. Trin 2: Bestem forholdet i TMRM-signalet med hver titrering i forhold til signalet før prøven for hvert blankeksperiment. Gennemsnittet for hver titrering af alle blindprøver beregnes. Trin 3: Beregn baggrunden for hvert prøveeksperiment ved at gange "pre-sample"-fluorescensen med det gennemsnitlige baggrundsforhold for hver titrering. Trin 4: Beregn forskellen mellem baggrunds- og sample TMRM-fluorescens for hver titrering for at udtrykke data som mMP eller mitokondriel TMRM-optagelse. Trin 5: Korrekt mMP, så fuld afkobling med FCCP reflekterer nul mMP. Trin 6: Udfør ikke-lineær regression til grafændringer i mMP med stigende ADP-koncentrationer. Målinger blev udført i 0,5 ml kamre, et indeholdende 5 millioner T-celler fra en rask frivillig. Gennemsnitsdata udtrykkes som gennemsnit ± SEM. Enkelte datapunkter for et enkelt replikat udtrykkes uden fejlbjælker. Klik her for at se en større version af denne figur.

Representative Results

For at illustrere forskellene i optimal cellekoncentration for analysen blev 5 millioner T-celler indlæst i et 0,5 ml kammer (10 millioner celler/ml), og 1,25 millioner celler blev indlæst i et andet kammer (2,5 millioner celler/ml) indeholdende 1 μM TMRM (figur 3A-G). Tre blanke eksperimenter blev også inkluderet for at beregne TMRM-baggrunden. Vi fandt, at en højere koncentration af T-celler resulterede i en mere skelnelig ændring i TMRM-fluorescens i forhold til baggrunden (figur 3B,D). Derudover gjorde en højere cellekoncentration det muligt for os at detektere den forventede stigning i iltforbrug og samtidig udtømning af mMP som reaktion på tilsætning af FCCP (figur 3E,F). Brug af en lav koncentration af celler gav en svag ændring i fluorescens, der var parallel med baggrunden. Da beregningen af mMP trækker baggrunden fra signalet, tillader en lav cellekoncentration ikke bestemmelse af ændringer i mMP som reaktion på substrater og afkoblinger. Ud over at bruge de højere koncentrationer af celler i dette assay, anbefaler vi at holde cellekoncentrationen konstant for hver celletype mellem eksperimenterne.

For at validere indflydelsen af ATP-syntase i spredningen af mMP med ADP-titreringer kørte vi parallelle eksperimenter på PBMC'er og T-celler, hvor et kammer modtog oligomycin før ADP-titrering (figur 4). Vi fandt ingen spredning af mMP som reaktion på ADP i celler behandlet med oligomycin, hvilket tyder på, at det gradvise fald i mMP med ADP er et resultat af protonflux gennem ATP-syntase (figur 4A-F). Vi sammenlignede også ADP-følsomheden mellem T-celler og PBMC'er fra den samme deltager og fandt, at ADP-følsomheden var lavere (højere EC50) i T-cellefraktionen (figur 4G,H).

Vi udførte en række blanke eksperimenter for at bestemme indflydelsen af tid eller SUIT-protokollen på TMRM-fluorescens. Vi fandt, at TMRM-signalet i blanke eksperimenter for det meste er påvirket af SUIT-titreringer (figur 5A) i modsætning til timingen af titreringerne (figur 5B).

Vi sammenlignede ADP-drevne ændringer i iltforbrugshastigheder (OCR) og i mMP i T-celler og monocytter fra 11 raske, frivillige i lokalsamfundet (figur 6A-H). I lighed med resultaterne af tidligere offentliggjorte eksperimenter med ekstracellulær flux og enzymatiske assays udviste monocytter en større mitokondriel respirationskapacitet end lymfocytter 26,27 (figur 6A,H). Vi påviste dog ikke en typisk dosis-respons-stigning i OCR med ADP i nogen af celletyperne (figur 6C,D), i modsætning til hvad denne metode viser ved brug af stærkt metabolisk væv som muselever (figur 7A-H). På den anden side gjorde brugen af TMRM det muligt for os at påvise et gradvist fald i mMP med ADP i humane immunceller (figur 6E-G) og i milt-T-celler fra mus (figur 7E-H). Selvom vi ikke direkte sammenlignede humane og muse-T-celler ved hjælp af den samme titreringsprotokol, fandt vi, at IC50 for muse-T-celler var lavere med en faktor 10 sammenlignet med cirkulerende T-celler fra mennesker.

Figure 3
Figur 3: Fluorespirometrieksperimenter med høj opløsning. (A-D) Spor af fluorespirometrieksperimenter med høj opløsning ved hjælp af T-cellekoncentrationer på 10 millioner celler/ml og 2,5 millioner celler/ml i 0,5 ml kamre. (A) 10 millioner celler/ml i 0,5 ml kamre. (C) 2,5 millioner celler/ml i 0,5 ml kamre. Iltflux (pmol/s/ml) er vist i toppanelet (rødt), og det kalibrerede TMRM-signal vises i bundpanelet (sort). Ændringer i TMRM i hele SUIT for prøven og dens beregnede baggrund blev plottet for kamrene indeholdende (B) 10 millioner celler/ml og (D) 2,5 millioner celler/ml. (E) For hver cellekoncentration blev iltflux (pmol/s/million celler) og (F) mitokondriemembranpotentiale beregnet. (G) ADP-følsomhedskurven blev plottet og tilpasset til en ikke-lineær regressionsmodel (ubrudte linjer). Forkortelser: mMP, mitokondriemembranpotentiale; TMRM, tetramethylrhodaminmethylester; SUIT, substrate-uncoupler-inhibitor titreringer; ADP, adenosindiphosphat; Dig, digitonin; Mal, malat; Pyr, pyruvat; Glut, glutamat; D1-11, 11 på hinanden følgende ADP-titreringer; U, afkobling FCCP på 0,5 og 1,0 μM; AMA, antimycin A. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: ATP-syntase driver ADP-drevet fald i membranpotentiale i T-celler og PBMC'er. (A-H) Protokollen beskrevet her blev testet i PBMC'er og T-celler. To O2K-kamre blev injiceret med PBMC'er, og to kamre med en yderligere O2K blev injiceret med T-celler fra samme deltager. Efter injektion af substrater malat, pyruvat og glutamat i alle kamre modtog et kammer af PBMC'er og T-celler oligomycin. Oligomycin forhindrede enhver ADP-drevet stigning i respiration i (A) PBMC'er og (D) T-celler eller fald i mitokondriemembranpotentiale i (B,C) PBMC'er og (E,F) T-celler. (G,H) ADP-følsomheden var større i PBMC'er sammenlignet med T-celler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Blanke eksperimenter viser ændringen i TMRM-fluorescens som reaktion på tid og titreringer af substrater, afkoblinger og inhibitorer (SUIT). (A) Ændring i TMRM-fluorescens som reaktion på titrering. (B) Ændring i TMRM-fluorescens som reaktion på tid. Eksperimenter blev udført i 0,5 ml kamre fyldt med Mir05 indeholdende 1 μM TMRM. Det ene kammer modtog ingen SUIT-titreringer (ingen injektion); to kamre i to forskellige instrumenter modtog en standarddragtprotokol (standardinjektion); et kammer modtog de samme SUIT-titreringer, men med en forsinkelse mellem hver injektion (forsinket injektion). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Forskelle i ADP-følsomhed mellem T-celler og monocytter ved brug af OCR og mMP. (A) Spor af højopløseligt fluorespirometrieksperiment fra en forsøgspersons monocyt- og T-celleprøve. (B) Iltforbrug i monocytter (n= 11) og T-celler (n= 13) fra blodet fra raske frivillige. (C,D) Ikke-lineær regressionstilpasning af den plottede stigning i respiration med ADP-titreringer for at beregne en EC50. (E) Samtidig måling af mitokondriemembranpotentiale. (F,G) Ikke-lineær regressionstilpasning af det plottede fald i mitokondriemembranpotentiale med ADP-titreringer for at beregne en IC50. H) Parametre for monocytters og T-cellers respirationskapacitet. Data udtrykkes som gennemsnit ± SEM for linjediagrammer og gennemsnit ± SD for søjlediagrammer. Statistisk signifikante forskelle efter t-test udtrykkes som *p < 0,05. **p < 0,01 og ****p < for 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Sammenligning af ADP-respons i respiration og mitokondriemembranpotentiale (mMP) i permeabiliserede T-celler i milt fra mus og lever. (A-D) Respons i respiration i permeabiliserede T-celler fra musemilt og lever. (E-H) Respons i mMP i permeabiliserede T-celler i milt og lever fra mus. Frisk lever og milt blev dissekeret fra tre mus efter cervikal dislokation. Miltpan-T-celler blev isoleret ved hjælp af antistofkonjugeret magnetisk perleseparation. Begge prøver gennemgik den samme SUIT-protokol i nærvær af 1 μM TMRM. (I,J) Sammenligning af EC50 beregnet ud fra stigningen i iltforbrug (OCR) og IC50 ud fra faldet i mMP som reaktion på ADP. N = 3 pr. gruppe. Data er udtrykt som gennemsnit ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Eksempel på SUIT-protokol til vurdering af mitokondriemembranpotentiale i friskisolerede T-celler og monocytter ved hjælp af 0,5 ml-kamrene. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Anbefalet ADP-titrering for 0,5 ml kammer. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Beregning af det gennemsnitlige baggrundsforhold ved hjælp af fem uafhængige blanke eksperimenter. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4: Beregning af mitokondriemembranpotentiale (mMP) fra prøveforsøg. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende figur 1: Effekt af Mir05 og DMSO på mitokondriel respiration og membranpotentiale. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1: Reagensforberedelse og protokol til isolering af T-celler fra musemilt. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Denne protokol bruger højopløselig fluorespirometri til at måle følsomheden af mitokondrieresponsen på energibehov ved at måle spredningen af mMP som reaktion på stigende niveauer af ADP i PBMC'er, monocytter og T-celler. Dette gøres ved at tilføje komplekse I- og II-substrater for at maksimere mitokondriemembranpotentialet og titrere ADP for gradvist at stimulere ATP-syntase til at bruge protongradienten til ATP-generering.

Kritiske trin i protokollen omfatter indstilling af fluoroforens forstærkning og intensitet til 1000 og sikring af, at der opnås et TMRM-fluorescerende signal under TMRM-titreringen. Fordi TMRM-fluorescens falder efter hver titrering (en begrænsning ved denne metode), er det bydende nødvendigt at køre baggrundseksperimenter ved hjælp af blankprøver. Vi har også fundet, at DMSO har en hæmmende effekt på mitokondriel respiration og membranpotentiale og anbefaler derfor at fortynde arbejdsopløsningen af TMRM i Mir05 (supplerende figur 1).

Nogle ændringer, der kan bruges, når du prøver denne protokol, er justering af cellekoncentrationer og brug af standard 2 ml kammeret. Imidlertid foretrækkes 0,5 ml-kammeret til T-celler og monocytter på grund af den høje koncentration af celler, der er nødvendige for optimal respons i membranpotentiale og iltflux. En lavere koncentration af celler kan være optimal, når man tester celler med større respirationskapacitet, som makrofager.

Yderligere begrænsninger ved den metode, der præsenteres her, inkluderer kravet om mindst 5 millioner T-celler og 2,5 millioner monocytter. Vi kan ofte få nok celler fra ~20 ml blod fra raske deltagere, men disse tal kan variere efter helbredstilstand, alder og køn26. Derudover, som i de fleste metoder, der vurderer mitokondriekapacitet, skal cellerne være friskisolerede. Denne metode kan dog afprøves i kryokonserverede celler i fremtiden. I sammenligning med udbyttet fra menneskeligt blod er T-celleudbyttet fra milten hos raske mus højt nok til at udføre denne analyse.

Cirkulerende T-celler, især langlivet hukommelse(TM) og regulatoriske (Treg) celler, er afhængige af oxidativ fosforylering til energi37. Mens deres energibehov og iltforbrug er lavt (f.eks. sammenlignet med hvilemuskler), er deres overlevelse afgørende for et effektivt immunrespons på reinfektion og kræft 38,39,40. En reduktion i T-celle oxidativ phosphorylering resulterer i nedsat proliferativ kapacitet og fremmer T-celleudmattelse og aldring 5,41. Derudover fremmer mitokondriel hyperpolarisering en vedvarende produktion af cytokiner (IL-4 og IL-21) af effektor CD4 T-celler under aktivering42. Ved infektion kan energibehovet til aktivering og spredning af immunceller være så højt som 25%-30% af den basale stofskiftehastighed43. Derfor fungerer immunceller i et bredt og ekstremt område af energibehov, og denne protokol kan teste mitokondrieresponser inden for dette område.

Kronisk betændelse er et almindeligt træk ved fedme, diabetes og aldring. Dysregulerede niveauer af cirkulerende hormoner, lipider og glukose har systemiske virkninger og kan således påvirke, hvordan mitokondrier reagerer på en energisk udfordring. Her har vi præsenteret en metode til at vurdere mitokondriel ADP-følsomhed i cirkulerende PBMC'er. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at bestemme, hvordan ADP-følsomhed kan moduleres ved metabolisk sygdom, og hvordan det påvirker sundhedstilstanden.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke de venlige frivillige, der donerede blod til dette projekt. Vi udtrykker også vores oprigtige taknemmelighed til Dr. Ellen Schur og hendes team for at give os yderligere prøver fra deres undersøgelse. Vi vil også gerne takke Andrew Kirsh for at gennemgå manuskriptet og redigere det for læsbarhed. Dette arbejde blev støttet af følgende finansieringskilder: P01AG001751, R01AG078279, P30AR074990, P30DK035816, P30DK017047, R01DK089036, K01HL154761 T32AG066574.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine Diphosphate Sigma-Aldrich A5285 Fluorespirometry
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 Fluorespirometry
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A6003 Mir05 buffer
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A6003 Cell isolation
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma-Aldrich C2920 Fluorespirometry
Cell strainers Fisher Scientific 22-363-548 Isolation of T-cells from mouse spleen protocol
CD14 Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-050-201 Cell isolation
CD3 Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-050-101 Cell isolation
DatLab Oroboros Version 8
Digitonin Sigma-Aldrich D141 Fluorespirometry
D-Sucrose Sigma-Aldrich 84097 Mir05 buffer
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E4378 Mir05 buffer
Filter Set AmR Oroboros 44321-01
HBSS (10x) Gibco 12060-040
HEPES sodium salt Sigma-Aldrich H7523 Mir05 buffer
Histopaque 1077 Sigma-Aldrich 10771 Cell isolation
K2EDTA blood collection tubes BD Vacutainer 366643 Cell isolation
Lactobionic acid Sigma-Aldrich 153516 Mir05 buffer
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G1626 Fluorespirometry
L-Malic Acid Sigma-Aldrich M1000 Fluorespirometry
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 Cell isolation
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M9272 Mir05 buffer
Multi-MACS stand and MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-301 Cell isolation
O2k-Fluo Smart-Module Oroboros 12100-03
O2k-FluoRespirometer series J Oroboros 10201-03
O2k-sV-Module (0.5 chamber) Oroboros 11200-01
Oligomycin Sigma-Aldrich 04876 Fluorespirometry
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse Miltenyi 130095130 Isolation of T-cells from mouse spleen protocol
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P0662 Mir05 buffer
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich 221473 Mir05 buffer
Prism GraphPad Version 10
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Fluorespirometry
RPMI Buffer Corning 17-105-CV Cell isolation
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Fluorespirometry
Succinate disodium salt Sigma-Aldrich S2378 Fluorespirometry
Taurine Sigma-Aldrich T0625 Mir05 buffer
Tetramethyrhodamine methyl ester perchlorite Sigma-Aldrich T5428 Fluorespirometry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eisner, V., Picard, M., Hajnóczky, G. Mitochondrial dynamics in adaptive and maladaptive cellular stress responses. Nat Cell Biol. 20 (7), 755-765 (2018).
  2. Sokolova, I. Bioenergetics in environmental adaptation and stress tolerance of aquatic ectotherms: linking physiology and ecology in a multi-stressor landscape. J Exp Biol. 224 (Pt Suppl 1), jeb.236802 (2021).
  3. Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312 (Pt 1), 163-167 (1995).
  4. Schmid, D., Burmester, G. R., Tripmacher, R., Kuhnke, A., Buttgereit, F. Bioenergetics of human peripheral blood mononuclear cell metabolism in quiescent, activated, and glucocorticoid-treated states. Biosci Rep. 20 (4), 289-302 (2000).
  5. Vardhana, S. A., et al. Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation limits the self-renewal of T cells exposed to persistent antigen. Nat Immunol. 21 (9), 1022-1033 (2020).
  6. Nelson, S. R., Li, A., Beck-Previs, S., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M. Imaging ATP consumption in resting skeletal muscle: One molecule at a time. Biophys J. 119 (6), 1050-1055 (2020).
  7. Meyrat, A., von Ballmoos, C. ATP synthesis at physiological nucleotide concentrations. Sci Rep. 9 (1), 3070 (2019).
  8. Gouspillou, G., et al. Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20709 (2011).
  9. Holloway, G. P., et al. Age-associated impairments in mitochondrial ADP sensitivity contribute to redox stress in senescent human skeletal muscle. Cell Rep. 22 (11), 2837-2848 (2018).
  10. Pharaoh, G., Brown, J., Ranjit, R., Ungvari, Z., Van Remmen, H. Reduced adenosine diphosphate sensitivity in skeletal muscle mitochondria increases reactive oxygen species production in mouse models of aging and oxidative stress but not denervation. JCSM Rapid Commun. 4 (1), 75-89 (2021).
  11. Pharaoh, G., et al. The mitochondrially targeted peptide elamipretide (SS-31) improves ADP sensitivity in aged mitochondria by increasing uptake through the adenine nucleotide translocator (ANT). Geroscience. 45 (6), 3529-3548 (2023).
  12. Brunetta, H. S., Petrick, H. L., Vachon, B., Nunes, E. A., Holloway, G. P. Insulin rapidly increases skeletal muscle mitochondrial ADP sensitivity in the absence of a high lipid environment. Biochem J. 478 (13), 2539-2553 (2021).
  13. Brunetta, H. S., et al. Nitrate consumption preserves HFD-induced skeletal muscle mitochondrial ADP sensitivity and lysine acetylation: A potential role for SIRT1. Redox Biol. 52, 102307 (2022).
  14. Tyrrell, D. J., et al. Blood-cell bioenergetics are associated with physical function and inflammation in overweight/obese older adults. Exp Gerontol. 70, 84-91 (2015).
  15. Liepinsh, E., et al. Low-intensity exercise stimulates bioenergetics and increases fat oxidation in mitochondria of blood mononuclear cells from sedentary adults. Physiol Rep. 8 (12), e14489 (2020).
  16. Hedges, C. P., et al. Peripheral blood mononuclear cells do not reflect skeletal muscle mitochondrial function or adaptation to high-intensity interval training in healthy young men. J Appl Physiol (1985). 126 (2), 454-461 (2019).
  17. DeConne, T. M., Muñoz, E. R., Sanjana, F., Hobson, J. C., Martens, C. R. Cardiometabolic risk factors are associated with immune cell mitochondrial respiration in humans. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 319 (2), H481-H487 (2020).
  18. Zhou, B., et al. Boosting NAD level suppresses inflammatory activation of PBMCs in heart failure. J Clin Invest. 130 (11), 6054-6063 (2020).
  19. Altintas, M. M., DiBartolo, S., Tadros, L., Samelko, B., Wasse, H. Metabolic changes in peripheral blood mononuclear cells isolated from patients with end stage renal disease. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 629239 (2021).
  20. Pence, B. D., Yarbro, J. R. Aging impairs mitochondrial respiratory capacity in classical monocytes. Exp Gerontol. 108, 112-117 (2018).
  21. van der Windt, G. J. W., Chang, C. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T Cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Curr Protoc Immunol. 113, 3.16B.11-3.16B.14 (2016).
  22. Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).
  23. Buck, M. D., et al. Mitochondrial dynamics controls T Cell fate through metabolic programming. Cell. 166 (1), 63-76 (2016).
  24. Quinn, K. M., et al. Metabolic characteristics of CD8. Nat Commun. 11 (1), 2857 (2020).
  25. Scandalis, L., et al. Skeletal muscle mitochondrial respiration and exercise intolerance in patients with heart failure with preserved ejection fraction. JAMA Cardiol. 8 (6), 575-584 (2023).
  26. Rausser, S., et al. Mitochondrial phenotypes in purified human immune cell subtypes and cell mixtures. Elife. 10, e70899 (2021).
  27. Kramer, P. A., et al. Bioenergetics and the oxidative burst: protocols for the isolation and evaluation of human leukocytes and platelets. J Vis Exp. 85, 51301 (2014).
  28. Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biol. 2, 206-210 (2014).
  29. Teodoro, J. S., Machado, I. F., Castela, A. C., Rolo, A. P., Palmeira, C. M. The evaluation of mitochondrial membrane potential using fluorescent dyes or a membrane-permeable cation (TPP+) electrode in isolated mitochondria and intact cells. Methods Mol Biol. 2184, 197-213 (2020).
  30. Hassan, H., Zakaria, F., Makpol, S., Karim, N. A. A link between mitochondrial dysregulation and idiopathic autism spectrum disorder (ASD): Alterations in mitochondrial respiratory capacity and membrane potential. Curr Issues Mol Biol. 43 (3), 2238-2252 (2021).
  31. Williams, A. S., et al. Disruption of Acetyl-Lysine turnover in muscle mitochondria promotes insulin resistance and redox stress without overt respiratory dysfunction. Cell Metab. 31 (1), 131-147.e111 (2020).
  32. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
  33. Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Biosci Rep. 36 (1), e00286 (2015).
  34. Vianello, C., et al. High-throughput microscopy analysis of mitochondrial membrane potential in 2D and 3D models. Cells. 12 (7), (2023).
  35. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
  36. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).
  37. Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
  38. Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. J Clin Invest. 123 (10), 4479-4488 (2013).
  39. Gerriets, V. A., et al. Foxp3 and Toll-like receptor signaling balance T. Nat Immunol. 17 (12), 1459-1466 (2016).
  40. MacIver, N. J., Michalek, R. D., Rathmell, J. C. Metabolic regulation of T lymphocytes. Annu Rev Immunol. 31, 259-283 (2013).
  41. Desdín-Micó, G., et al. T cells with dysfunctional mitochondria induce multimorbidity and premature senescence. Science. 368 (6497), 1371-1376 (2020).
  42. Yang, R., et al. Mitochondrial Ca2+ and membrane potential, an alternative pathway for Interleukin 6 to regulate CD4 cell effector function. Elife. 4, e06376 (2015).
  43. Straub, R. H., Cutolo, M., Buttgereit, F., Pongratz, G. Energy regulation and neuroendocrine-immune control in chronic inflammatory diseases. J Intern Med. 267 (6), 543-560 (2010).

Tags

Nøgleord: Højopløselig fluorespirometri mitokondriemembranpotentiale mononukleære celler i perifert blod T-celler monocytter metabolisk sygdom aldring energibehov
Højopløselig fluorespirometri til vurdering af dynamiske ændringer i mitokondriemembranpotentiale i humane immunceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Valencia, A. P., Pharaoh, G.,… More

Valencia, A. P., Pharaoh, G., Brandao, A. F., Marcinek, D. J. High-Resolution Fluorespirometry to Assess Dynamic Changes in Mitochondrial Membrane Potential in Human Immune Cells. J. Vis. Exp. (207), e66863, doi:10.3791/66863 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter