Unterstützte Planar-Membranen für die Bildung von Study of immunologischen Synapsen und Kinapse

Summary

Unterstützte planaren Doppelschichten sind leistungsfähige Werkzeuge, die verwendet werden, um die molekularen Wechselwirkungen in einer immunologischen Synapse Modell werden können. Hier zeigen wir Methoden zur Verankerung Zelladhäsionsproteine ​​bekannt zu modulieren Synapsenbildung an der oberen Flugblatt der Lipid bilyer und visualisieren Synapsenbildung mit TIRF-Mikroskopie.

Abstract

Unterstützte planaren Doppelschichten sind leistungsfähige Werkzeuge, die verwendet werden, um die molekularen Wechselwirkungen in einer immunologischen Synapse Modell werden können. Zur Simulation der Wechselwirkungen zwischen Lymphozyten und Antigen-präsentierende Zellen, verwenden wir Ni2 +-Chelat-Lipide zur rekombinanten Zell-Adhäsion und MHC-Proteine ​​an der oberen Flugblatt einer Doppelschicht mit Poly-Histidin-tags zu verankern. Planar-Doppelschichten sind durch die Vorbereitung Lipid, die Behandlung der Glasflächen, wo der Doppelschicht bilden, und dann bildet der Doppelschicht in einer spezialisierten Kammer mit einem Flow-Zelle, wo die Lymphozyten hinzugefügt werden generiert. Dann Doppelschichten sind mit Ni-und His-markierten rekombinanten Proteinen berechnet werden hinzugefügt. Schließlich Lymphozyten sind in die Messzelle und TIRF-Mikroskopie injiziert werden, um Bild Synapsenbildung und die Mechanismen genutzt werden, dass die Kontrolle T-Zell-Lokomotion, Websites von Rezeptor-Sortierung und Websites von Rezeptor-Abbau.

Protocol

1. Vorbereitung der Lipide Um Proteine ​​an die obere Flugblatt einer Doppelschicht Link verwenden wir Ni 2 + Komplexbildner Lipide, die rekombinante Proteine ​​mit Poly-Histidin-tags zu verankern. Bestimmte Zelltypen können nicht speziell an Ni 2 +-beschichtete Doppelschichten, aber T-Zellen in der Regel nicht, so dass diese Methode optimal für das Studium T-Zell-Aktivierung. Die Lipid-Doppelschicht-Lösung wird durch Herstellen einer Lösung von 20% Ni 2 +…