Isolering och odling av postnatal Mouse Cerebellar stamceller Granule Neuron celler och neuroner

Summary

Här presenterar vi en metod för att isolera och kultur cerebellär granulat neuron progenitorceller och cerebellär nervceller granulat från födsel mus.

Abstract

Den cerebellär cortex är en väl beskriven struktur som ger unika möjligheter att studera neuronala egenskaper och utveckling ^1,2. Av de cerebellär neuronala typer (granulat celler, Purkinje celler och inhibitoriska interneuron), granulat nervceller är den i särklass mest talrika och är den vanligaste typen av nervceller i däggdjur hjärnan. Hos gnagare är cerebellär granulat nervceller genereras under de två första postnatala veckor från stamceller i det yttersta lagret av cerebellar hjärnbarken, den externa granulat lagret (EGL). Protokollet presenteras här beskriver tekniker för att berika och kultur nervceller granulat och progenitorceller från postnatal musen lillhjärnan. Vi kommer att beskriva procedurer för att få olika kulturer att öka renhet ^3,4, som kan användas för att studera differentiering av förökar stamceller till granulat neuroner ^5,6. När progenitorceller differentiera, kulturer också ge en homogen population av granulat nervceller för experimentell manipulation och karakterisering av fenomen som synaptogenesis, glutamat receptor funktion ^7, samverkan med andra renade cerebellär celler ^8,9 eller celldöd ^7.

Protocol

Del 1: Ställa in (1-2 dagar innan dissekering) (Visas inte på video)

1. FÖRBEREDA KULTUR LÖSNINGAR OCH MEDIER:
   • 4X CMF-PBS-EDTA (kalcium och magnesium fritt fosfatbuffrad salt-EDTA för Percoll spädningar) per liter, tillsätt 32 g NaCl, 1,2 g KCl, 8 g glukos, 2 g NaH ₂ PO _4, 1 g KH ₂ PO _4, 8 ml 2% NaHCO ₃ lager, 10 ml 1M EDTA (pH 8,0) med destillerat / avjoniserat vatten. Justera volymen till 1 liter och pH-värdet till 7,4. Filter sterilisera.
   • HBSS-glukos: Lägg till glukos (6 gram / liter) på kalcium och magnesium gratis Hanks Balance Salt Solution (HBSS) och sterila filter. 500 ml kan förvaras vid 4 ° C i upp till en månad.
   • ODLINGSSUBSTRAT: serumfritt medium (SFM) och 10% FBS medium. Till 48 ml av Neurobasal A-Medium lägga 500 l 100X GlutaMAX I, 500 l 100X Penicillin-streptomycin (sista 100 enheter penicillin och 100 mikrogram streptomycin), 6,25 l 2 M KCl (slutlig 250 M). Split i två portioner av 9 ml och 40 ml. För att förbereda 10% FBS medium Tillsätt 1 mL värmeinaktiveras FBS till 9 ml delmängd. För att förbereda SFM, tillsätt 800 ìl av serumfritt tillägg B-27 till 40 ml delmängd. Filtrera sterilisera och förvara vid 4 ° C i högst 2 veckor. För bästa resultat göra nya medier för varje experiment.
2. FÖRBEREDELSER Percoll spädningar:
   • Percoll levereras som en vätska och det måste vara försurade före användning. För att förbereda beståndet, lägg 1N HCl lite i taget till Percoll lösning under en 1-2 timmar tills pH 7,4 har uppnåtts. Lägga till HCl alltför snabbt kommer att orsaka Percoll att aggregera. Cirka 6.5ml av 1N HCl behövs för varje liter Percoll. Filtrera sterilisera och förvara vid 4 ° C.
   • En 35% och en 60% (vol: vol) Percoll utspädning kommer att användas i Percoll lutning steg. Bereda 100 ml Percoll lösningar innehållande 35 eller 60 ml Percoll lager, 25 ml 4X CMF-PBS-EDTA och destillerat / avjoniserat H2O till den slutliga volymen. Tillsätt några droppar toluidinblått till 60% lösning, det kommer att hjälpa visualisera gränssnittet och cellerna. Filtrera sterilisera och förvara vid 4 ° C.
   • 4X CMF-PBS-EDTA bör inte vara äldre än 3 månader, som otillräckliga buffrande kommer att orsaka ökad celldöd under förfarandet.
3. FÖRBEREDELSER täckglas: Glas täckglas (bäst om från Carolina Biological Supply Company) tvättas med 10% HCl över natten vid rumstemperatur med lätt oro, sköljas grundligt med destillerat / deonized vatten och lagras i 70% etanol. Före användning, enkel täckglas är eld-steriliseras genom att kort hålla dem med pincett över öppen eld (Bunsenbrännare) tills etanolen avdunstar. 12-mm glas täckglas kan placeras i 4-väl odlingsplattor och 25-mm täckglas i 6-väl odlingsplattor.
4. BELÄGGNING odlingskärl med substrat: För immunofluorescens färgning eller läkemedelsbehandlingar glas täckglas är mer lämpliga eftersom de lätt kan monteras på objektglas för visualisering i mikroskop. När ett stort antal celler som behövs för att samla protein eller RNA-prover, kan celler odlas på plast kultur dishes.The kvällen före dissekering, måste glas täckglas eller plast rätter för kulturen vara belagd med poly-D-lysin (500 mikrogram / ml; 800 l / brunn för 6-brunnars plattor eller 350 l / brunn för 4-brunnars plattor). 5 mg / ml stamlösning av poly-D-lysin lagras vid -20 ° C, därefter spädas med sterilt destillerat / deonized vatten och sterilt filtreras höger före användning. Odlingskärl inkuberas vid 37 ° C över natten (eller åtminstone 2 timmar före plating) och tvättas två gånger med sterilt destillerat / deonized vatten precis innan plätering.
5. FÖRBEREDELSER PREPLATING rätter: Dessa rätter kommer att användas för pre-plating de isolerade lillhjärnan celler innan kulturen för att ta bort gliaceller föroreningar, som följer lättare till en lägre koncentration av substrat. Coat två 60-mm plast kultur rätter med 4 ml per fat av poly-D-lysin (100 mikrogram / ml, Obs detta är 1 / 5 av den koncentration som används för odling). Inkubera vid 37 ° C över natten (eller åtminstone 2 timmar före dissekering). Strax före dissekering, ta bort poly-D-lysin lösning, diska två gånger med sterilt vatten och låt torka i huven.
6. Sterilisera dissektion verktyg i autoklaven eller på dagen för dissektion, sänk de verktyg som i 70% etanol i 20 minuter. Nödvändiga verktyg: Permaset saxar, microdissecting saxar, fyra Dumont # 5 dissekera pincett.

Del 2: Förberedelser inför Dissection (dagen för dissektion) - (vilket visats i video)

Samtliga av följande procedurer utförs i en vävnadsodling huva inte noteras.

1. Torka av dissekera området med 70% etanol. Varma media till 37 ° C i ett vattenbad eller i en 5% CO ₂ 37 ° C inkubator.
2. När du startar en ny Papain Dissociation System Kit (Worthington), förbereda en lösning av albumin-ovomucoid hämmare. Tillsätt 32 mlav EBSS (Earles Balanced Salt Solution, som ingår i kitet) till albumin-ovomucoid hämmare blandningen och låt innehållet att lösa vid utarbetandet av andra komponenter. Rekonstituera för den första användningen, då lagra överbliven lösning vid 2-8 ° C och använd tills fem isoleringar tillåts av varje kit är klara.
3. Tillsätt 5 ml EBSS till en papain injektionsflaskan från Dissociation Kit (varje flaska räcker för dissociation av 4 till 15 cerebella från postnatal dag 5 möss). Placera papain flaskan i en 5% CO ₂ 37 ° C inkubator eller 37 ° C vattenbad i 5 till 10 minuter tills papain helt upplöst och lösningen verkar klar. Underhålla lösningen i rumstemperatur under dissektion.
4. Tillsätt 500 ìl EBSS till en DNas injektionsflaskan från Dissociation Kit. Blanda försiktigt genom att trycka på flaskan sedan DNas är känslig för skjuvning denaturering. Tillsätt 250 l av denna lösning till injektionsflaskan som innehåller papain (slutlig koncentration är 20 enheter / ml papain och 0,005% DNas). Spara den återstående DNas flaskan för användning i steg 5,1 eller 6,1.

Del 3: Dissection och hjärnhinnorna borttagning

1. Den optimala åldern för granulat cellodling från C57BL/6J möss är postnatal dag 4-6, när antalet stamceller granule cell i EGL peaks1, 10. Dissekera valpar en i taget och när du blivit mer bekant med lillhjärnan dissekering försöka minska dissekering tid till inte mer än 6 minuter per valp. Hastighet är det väsentliga.
   Om Percoll lutning steget inte passeras kan åtta efter födsel-dag-5 musen valpar ge tillräckligt med celler för en 6-samt kultur platta (eller sex 25 mm täckglas) eller för sex 4-väl odlingsplattor (eller twenty-fyra 12 - mm täckglas). Ungefärlig avkastningen är 4 till 5x106 celler per valp och plätering täthet kan variera mellan 1 och 5X105 cells/cm2. Eftersom 15-20% cellerna försvinner under Percoll Steg 4 är fler djur behövs för att få samma önskade celltäthet.
2. Pipettera 15 ml HBSS-glukos i en 60-mm plast vävnadsodling skålen och 10 ml i en steril Falcon 15 ml koniska plastslang. Sätt på is.
3. Utanför huven, torka chefen för valp med 70% etanol. Använd Permaset sax för att halshugga valpen. (Halshuggning kommer inte att visas i videon.)
4. I huven, håll huvudet med Dumont pincett så att du tydligt kan se baksidan av skallen. Gå till hjärnan genom att sätta microdissecting sax in i foramen magnum och skära rakt mot ögonen. Använd pincett, skala bort huden och lyfta upp skallen att exponera hjärnan. Använda Dumont pincett, nypa bort lillhjärnan och den omgivande mitthjärnan och överför den till skålen med HBSS-glukos. (Det är lättare att manipulera lillhjärnan och ta bort meningerna om lillhjärnan är fortfarande fäst vid omgivande vävnad).
5. Enligt dissekera mikroskop Dra försiktigt meningerna från lillhjärnan och även mellan loberna med en fin Dumont # 5 pincett när du använder andra pincett för att förankra ner lillhjärnan till plattan. Du kommer att märka blodkärl på ytan av lillhjärnan. Dessa blodkärl är ett bra sätt att identifiera hjärnhinnorna. Ta meningerna tills lillhjärnan tar på ett tovigt vitt utseende. Separera lillhjärnan från resten av mellanhjärnan. Vrid den till dess ventrala sida och ta bort koroidea plexus, som ser ut som ett rödaktigt band mellan ventrala lillhjärnan och angränsande mitthjärnan. Placera varje lillhjärnan i kalla HBSS-glukos i ett 15 ml koniska rör på is så fort som dissekeras. Ändra dissecting lösningen till frisk HBSS-glukos efter dissekera 3 hjärnor.

Del 4: cellsuspensionen

1. När alla dissektioner är klar tar du bort HBSS-glukos från röret och ersätta den med papain lösning i steg 2,4. Även om kit rekommenderar skära vävnaden i små bitar, finner vi att det inte är nödvändigt att skära eller finhacka cerebella i denna ålder. Placera vävnaden + papain lösning (i en 15 ml konisk tub) i ett 37 ° C vattenbad eller 5% CO ₂ 37 ° C inkubator i 15 till 20 minuter. 4 till 8 cerebella, 15 minuter vid 37 ° C är tillräcklig, för ett större antal cerebella 20 till 30 minuter är bättre. Skaka försiktigt röret var 3 till 4 minuter.
2. Mal sönder blandningen med en steril P1000 aerosol pipettspetsen som varit belagda med FBS. Gör detta steg försiktigt för att förhindra bildning luftbubbla. Fire Polished glaspipetter kan användas, men vi anser att serum belagda sterila P1000 aerosol tips fungerar lika bra. Att belägga pipettspetsen med FBS, pipett FBS upp och ner två gånger strax före användning. Cirka 10 upp och ner rörelser med pipetten är tillräckligt för att skilja vävnaden. Lösningen blir grumlig. Tillåta att upphävandet sitta i 30-60 sekunder så att alla stora bitar av odissocierad vävnad kommer att avgöra till botten av röret.
3. Ta bort suspenderade celler (noga med att inte ta bort odissocierad vävnaden bitarna på Bottom) i en ny 15 ml koniska rör med ett serum belagda pipettspetsen. Centrifugera vid cirka 200xg i 5 minuter i rumstemperatur. Förbered resuspension medium. För att göra detta, blanda 2,7 ml EBSS med 300 l rekonstituerad albumin-ovomucoid hämmare lösning i ett sterilt rör. Tillsätt 150 ìl av DNas-lösning från steg 2,4.
4. Efter centrifugering, kassera supernatanten och omedelbart resuspendera cellpelleten i de utspädda DNas / albumin hämmare lösning som bereddes i steg 4,3 med ett serum belagd P1000 aerosol pipettspetsen.
5. Förbered en diskontinuerlig densitetsgradient enligt följande. Tillsätt 5 ml av albumin-ovomucoid hämmare lösning till en 15 ml koniska rör. Försiktigt lager cellsuspensionen ovanpå. Centrifugera vid cirka 70xg i 6 minuter i rumstemperatur. Dissocierade celler pellets i botten av röret, membranet fragment kvar på gränssnittet.
6. Om du vill få kulturer som anrikas i granulat celler, förbi Percoll steget lutning separation (vilket ger renare kulturer av cerebellär granulat celler), och fortsätt till del 6. Om du vill ytterligare isolera granulat celler från Glia och stora interneuronen av Percoll gradient separation, fortsätt till del 5. Användning av Percoll lutning steget kommer att minska avkastningen av celler. I våra händer är att avkastningen sjunker cirka 20-35%. Det finns dock en ökad anrikning av granulat nervceller och progenitorceller från cirka 90% till 95-99%.

Del 5: Percoll Gradient Separation

1. Kasta bort vätskefasen och omedelbart suspendera pelleten i 2 ml HBSS-glukos med 50 ìl DNase från steg 2,4. Filtrera cellsuspension om en nylon mesh (porstorlek 70 mikrometer) av tyngdkraften. Detta steg kommer att ta bort stora icke-neuronala celler och ger en bättre enskild cell suspension.
2. Förbered två brand-polerat glas Pasteur pipetter. För att göra detta, försiktigt låga spetsen på en glaspipett tills kanten är smidigare och pipetten bar är 40-50% av den ursprungliga storleken. Var noga med att inte göra öppningen för liten.
3. Förbered Percoll lutning. Häll 10 ml 35% Percoll lösning i en 50 ml steril koniska rör. 60% Percoll (10 ml) är laddad i en 10 ml steril spruta med en steril bifogade spinal nål. Försiktigt skikt på 60% Percoll lösning under 35% lösning, genom att lägga till 60% lösning i botten av röret med spinal nål. Var noga med att hålla en skarp gränssnitt mellan de två lagren. Lägg till celler till toppen av övertoning med en brand-polerat pipett försiktigt lägga dem längs sidan av röret utan att störa gränssnittet.
4. Försiktigt placera röret i centrifugen och centrifugera vid 1800xg. Ramp upp hastigheten ett steg var 20 sekunder (i steg om hastigheten är följande: cirka 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg) så att det tar ca 2 minuter att nå önskad hastighet. Starta timern till 10 minuter när 1800xg nås. När du är klar, minska hastigheten gradvis ett steg var 20 sekund.
5. Ta bort den övre gränssnittet för lutning (som innehåller stora Glia, Purkinje celler och interneuron) och kassera.
6. Ta försiktigt bort de celler i gränssnittet mellan 35% och 60% Percoll med en brand-polerad pipett och överför till en 50 ml koniska rör. Resuspendera i 3 volymer HBSS-glukos och blanda genom att vända flera gånger. Centrifugera i 5 minuter vid 1100xg.
7. Avlägsna supernatanten och tillsätt 4 ml 10% FBS medium med 50 ìl DNas. Suspendera pelleten försiktigt med en brand-polerat pipett till en enda cellsuspension. Gå vidare till steg 6,2.

Del 6: Pre-plating och plätering

1. Kasta bort vätskefasen och omedelbart suspendera pelleten i 4 ml 10% FBS medium med 50 ìl DNase från steg 2,4. Filtrera cellsuspension om en nylon mesh (porstorlek 70 mikrometer) av tyngdkraften. Detta steg kommer att ta bort stora icke-neuronala celler och ger en bättre enskild cell suspension.
2. Tavla insamlade celler i ett poly-D-lysin belagda före plätering skålen för 20 minuter i 5% CO ₂ 37 ° C inkubator. Upprepa med en ny maträtt. Den astroglia och tyngre celler lugnar ner sig och följer disken och lämna små granulat neuron och neuron progenitorceller flytande. Efter inkubation är löst följs granulat neuron och neuron progenitorceller lätt rubbas och lossade som försiktigt packas av plattan.
3. Samla granulat neuron och neuron progenitorceller i ett 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 200xg i 5 minuter. Suspendera pelleten i 1 ml serumfritt medium och räkna en alikvot av 10 l med hjälp av en hemocytometer.
4. Lägg serumfritt medium att nå den önskade cellen densitet. Grova riktlinjer att antalet celler till tallrik för medium densitet: för 6-brunnars plattor, från 3,5 till 4.000.000 celler; för 4-brunnars plattor, 650.000 celler. För 6-väl odlingsplattor, jag plåt 1,5 ml / brunn och 4 väl PLATES, jag tallrik 0,5 ml / brunn. Cellerna hålls i en 5% CO ₂ 37 ° C inkubator. Ändra på medellång helt 24 timmar senare med senare ändringar var två till tre dagar.

Discussion

Detta protokoll är baserad på modifieringar av förfaranden som har beskrivits tidigare ^3,7,11. Det finns flera viktiga punkter att notera som diskuteras nedan.

Den granulat neuron och progenitorceller följa inom 2 timmar bordläggningen. Friska celler har en rund morfologi under faskontrastmikroskop ^4. Inom 24 timmar efter plätering kommer friska celler jämnt runt täckglasen eller plast väl och kommer att ligga processer. Vid tidpunkten för det första mediet förändras, efter 24 timmar kommer det att finnas ett fåtal döda flytande celler. Detta är normalt, eftersom ett fåtal celler kommer att dö eller bli sjuka under dissociation processen. Men om efter 48 timmar cellerna är hopklumpade tillsammans med varicosities på sina processer, antingen cellerna är ohälsosamma eller poly-D-lysin substrat är giftigt. Som med de flesta substrat, är effekten av poly-D-lysin mycket beroende och varje nytt parti måste testas. Bilder av friska kulturer finns i referenserna ^4,11, och ^20. Friska celler kan upprätthållas i kultur för upp till två veckor ^8.

Granule neuron stamfäder börja skilja på bordläggningen ^8,12,13,14. När den optimala plätering densitet är etablerad för dina studier, bör den upprätthållas, eftersom spridning främjas av faktorer som Notch signalering ^15, och celler kommer att föröka sig mer på högre densitet. Spridningen av stamceller granulat neuron kan bli betydligt längre genom att lägga till Sonic Hedgehog (Shh) till mediet ^12,13,14. Laminin kan också läggas som substrat i tillägg till poly-D-lysin för att främja neurite utväxt ^16,17. Dessa funktioner i granulat cellodling erbjuda ett system för att studera antingen biologi granulat nervceller eller reglering av differentiering av progenitorceller i neuron ^6,18,19.

Isolerade cerebellär celler från födseln möss är initialt består av en blandning av granulat nervceller och granulat stamceller neuron i olika skeden av cellcykeln ^8. Det finns också astroglia och interneuronen finns i isolering / kultur och ytterligare rening av granulat nervceller och stamceller korn (95% -99%) uppnås är genom Percoll gradient separation ^4. Berikad granule celler erhållas utan användning av Percoll gradienten separation steg har använts för att studera regleringen av proliferation och differentiering av stamceller granulat neuron, ^18,19,20. I bekräftelse av detta finner vi att celler i befolkningen isolerade genom att kringgå Percoll gradienten separation steg reagerar kraftigt på Shh genom att förbli i cellcykeln i flera dagar, och det utan Shh Dessutom finns det väldigt lite spridning i kulturer som anges genom färgning med cellproliferation maker, Ki67. Men om de kulturer som ska användas efter flera dagar in vitro, rekommenderas att Percoll gradienten steg tas för att minska förorening av granulat nervceller som sprider icke-neuronala celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell strainer with 70μm mesh pore	BD Biosciences	352350
Spinal Needle	BD Biosciences	405182	20G x 3-1/2 inches
Poly-D-Lysine mol wt>300,000	Sigma-Aldrich	P1024	Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested.
Percoll	Sigma-Aldrich	P-1644
Penicillin-Streptomycin (100X)	Sigma-Aldrich	P4333
HBSS	Invitrogen	14175-103	Must be calcium and magnesium free.
Neurobasal A-Medium	Invitrogen	10888-022
Glutamax I supplement	Invitrogen	35050-061
B-27 Serum Free Supplement (50x)	Invitrogen	17504-044
12-mm circle coverslips	Carolina Biological	63-3029	These are made in Germany by Deckgluder.
25-mm circle coverslips	Carolina Biological	63-3037	These are made in Germany by Deckgluder.
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical	LK 003150	Kit is good for five isolations.
Permaset scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS6782
Dumont #5 (Dumostar)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS4978
4-well culture dish	Nalge Nunc international	176740
6-well culture dish	Nalge Nunc international	140685