Serielle Verdünnungen und Ausplattieren: Auszählung von Mikrobiom

English

Overview

Quelle: Jonathan F. Blaize¹, Elizabeth Suter¹, und Christopher P. Corbo¹
¹ Department of Biological Sciences, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301

Die quantitative Bewertung von Prokaryoten kann angesichts ihres Überflusses, ihrer Neigung zur exponentiellen Proliferation, der Artenvielfalt innerhalb einer Population und der spezifischen physiologischen Bedürfnisse belastend sein. Diese Herausforderung verschlimmert sich in der vierphasigen Natur, in der sich Bakterien vermehren (Lag, Log, stationär und Tod). Die Fähigkeit, die Konzentration von Mikroorganismen genau abzuschätzen, ist für eine erfolgreiche Identifizierung, Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung erforderlich (6). Daher haben Mikrobiologen seit über einem Jahrhundert serielle Verdünnungs- und verschiedene Beschichtungstechniken eingesetzt, um die bakterielle und virale Belastung in klinischen, industriellen, pharmazeutischen und akademischen Laborumgebungen zuverlässig zu quantifizieren (2,4,6). Beschreibungen dieser Methode erschienen erstmals 1883, als der deutsche Wissenschaftler und Arzt Robert Koch seine Arbeit über infektionserregende Erreger veröffentlichte (2). Kochs vorgenannte Techniken, die oft als Vater der modernen Bakteriologie bezeichnet werden, sind weltweit zum Goldstandard für die Aufzählung von Mikroorganismen geworden, die kultivierbar oder nicht mehr sind.

Serielle Verdünnung ist eine systematische Reduktion einer bekannten oder unbekannten Einheit (ein Gelöster, Organismus usw.) durch sukzessive Wiedersuspension einer Ausgangslösung (Lösung₀) in feste Volumina eines flüssigen Verdünnungsmittels (Rohlinge). Diese Rohlinge bestehen in der Regel aus 0,45% Saline, obwohl die Zusammensetzung variiert werden kann (7). Während ein Experimentator ein beliebiges Volumen für jedes Verdünnungsmittel auswählen kann, ist es meistens ein Vielfaches von 10, was eine logarithmische Reduktion der Probe erleichtert. Beispielsweise enthält Lösung₀ insgesamt 100 E. coli-Zellen, die in 10 ml Nährstoffbrühe suspendiert sind. Wenn 1 ml Lösung₀ entfernt und zu 9 ml Saline (Verdünnungsstoff₁₎hinzugefügt wird, würde die neue Lösung (Lösung₁) 1/10^der Anfangskonzentration von E. colienthalten. In diesem Beispiel würde die neue Lösung (Lösung₁) 10 E. coli-Zellen enthalten. Eine Wiederholung dieses Prozesses durch Entfernen von 1 ml Lösung₁ und Hinzufügen zu weiteren 9 ml Saline (Verdünnungsmittel₂) würde Lösung₂ergeben, die nur eine einzelne E. coli-Zelle enthält. Da jede neue Lösung (9 ml Verdünnungsstoff + 1 ml Lösung) insgesamt 10 ml enthält, können wir schlussfolgern, dass der Verdünnungsfaktor für diese Reduktion 10 beträgt oder dass es sich um eine 10-fache serielle Verdünnung handelte (Abbildung 1). Da wir in diesem Beispiel erst mit 100 Zellen begonnen haben und wir um den Faktor 10 verdünnen, sind nur zwei Schritte erforderlich, um die absolute Mindestkonzentration von 1 Zelle zu erreichen.

Abbildung 1: Serielle Verdünnung einer Lagerlösung. Ein 1 ml Aliquot der Stammlösung (Lösung₀) wird zu Tube 1 hinzugefügt, die 9 ml mit 0,45% Salzsalze (dilent₁₎enthält; das Produkt dieser Mischung ist Lösung₁. Wiederholen Sie dies, indem Sie 1 ml der neu erstellten Lösung₁ aliquotieren und zu Tube 2 hinzufügen. Die Aliquotierung und Resuspension setzt sich auf diese Weise fort, bis die endgültige Röhre erreicht ist, wodurch die Lagerkonzentration mit jedem Schritt um den Faktor 10 verwässert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Serielle Verdünnung ist die einfachste Technik zur Erzielung überschaubarer Konzentrationen eines gewünschten Organismus und wird durch Petrischalenstreifen und -streuungen ergänzt, nur zwei von vielen Beschichtungstechniken, die von Mikrobiologen verwendet werden. Dieser Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass der Experimentator reine Stämme einer einzelnen Art oder separate Stämme von einer gemischten Population ernten kann (7). Streaking wird durch die Einführung eines Organismus in ein festes Medium (in der Regel bestehend aus Agarose) erreicht, auf dem er wachsen wird, wenn die entsprechenden Nährstoffe verfügbar sind. Das sanfte Schwenken einer sterilen Impfschleife über das Medium (so dass ein subtiler Streifen bleibt) in einem starren sinusförmigen Muster verteilt den Organismus proportional zur Frequenz der Wellenform des Experimentators. Die Aufteilung der Petrischale in Drittel oder Viertel (Quadrantstreifen) und die Verringerung der Häufigkeit jedes Streifens, wenn eine neue Region der Schale eingegeben wird, wird die Anzahl der Mikroorganismen, die diese Region besetzen können, allmählich reduzieren und einzelne Kolonien anstelle einer nicht quantifizierbaren bakteriellen Rasen. Die Streubeschichtung verdünnt die Proben nicht zusätzlich; ein steriler Glasstreuer wird verwendet, um ein Aliquot von Suspensionsmedien über eine ganze Petrischale zu verteilen (Abbildung 2). Die Kolonien, die auf der Streuplatte wachsen, entstehen aus einer einzigen Zelle und jede Kolonie auf der Schale kann gezählt werden, um die Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE) in einer gegebenen Suspension zu schätzen, dargestellt als KBE/ml (6) (Abbildung 3) Weicher Agar und Nachbau Beschichtungen sind Variationen der oben genannten Techniken und ermöglichen die Isolierung von Bakteriophagen bzw. Mutantenscreening (1,7).

Abbildung 2: Plattenstreifen für bakterielle Aufzählung und Dehnungsisolierung. Beschriften Sie den Boden einer Petrischale mit Identifikationsinformationen (Bakterienname, Datum, Medien) und teilen Sie sie in Drittel auf. Nach der Auswahl einer geeigneten Verdünnung der Stammprobe eine sterile (Einweg- oder Flammen)-Impfschleife nehmen und das Reagenzglas untertauchen (hier, T3). Die Petrischalenabdeckung auf einer Seite leicht anheben, so dass nur die Impfschlaufe auf den Agar zugreifen kann. Gleiten Sie die Impfschleife über die Oberseite der Medien in einer Zick-Zack-Manier, um darauf zu achten, den Agar nicht zu kompromittieren. Drehen Sie die Platte um etwa 1/3^rd (ca. 118°) und reduzieren Sie die Frequenz der Zick-Zack-Bewegung. Drehen Sie ein letztes Mal und reduzieren Sie die Zick-Zack-Frequenz noch einmal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Streubeschichtung. 1 g der Aerobic-Zone wurde in T1 resuspendiert und dann seriell verdünnt. Ein steriler Glas- oder Kunststoff-Einweg-Streustab wird verwendet, um Inoculum in jeder Schale zu verteilen. Dies wurde mit 1 g der anaeroben Zone wiederholt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Wie bei seriellen Verdünnungen wird eine logarithmische Skala verwendet, um die Konzentration des Organismus auszudrücken. Die Anzahl der Kolonien, die in Standard-Petrischalen mit einer Größe von 100 mm x 15 mm angebaut werden, kann manuell (oder automatisiert mit Hilfe der Computerverarbeitung) aufgezählt werden, indem isolierte Wachstumscluster identifiziert werden. Zählt, die insgesamt weniger als 30 oder mehr als 300 wert sind, sollten als zu wenig zum Zählen (TFTC) oder zu zahlreich für die Anzahl (TNTC) definiert werden. Im letzteren Fall sollte eine serielle Verdünnung durchgeführt werden, um die Konzentration zu reduzieren, bevor eine neue Petrischale wieder aufgelegt wird. Die Mittelung der Anzahl der in sich geschlossenen Kolonien, die aus drei getrennten Petrischalen identifiziert wurden, und multiplizierte den Mittelwert mit dem Verdünnungsfaktor ergibt CFU/ml; Das Zeichnen des Protokolls₁₀ von KFU/ml gegen die Zeit wird die mittlere Erzeugungszeit des Organismus offenbaren (7).

Procedure

1. Einrichtung Ein Flussdiagramm mit allen Materialien, einem schrittweisen Versuchsprotokoll und einer Methode zum Entsorgen von Verbrauchsmaterialien sollte in ein Labornotizbuch geschrieben und in der Nähe des experimentellen Arbeitsbereichs aufbewahrt werden. Arbeitsbereiche sollten mit einem geeigneten Antiseptikum (70% Ethanol) sterilisiert werden, und der Experimentator sollte das Kontaminationsrisiko durch das Tragen sauberer Laborkleidung verringern, die sie auch vor Expositionsanomalien schützt. Geeignete Kleidungsstücke umfassen, sind aber nicht beschränkt auf laborkleidung, Latex- oder Nitrilhandschuhe, Googles, Atemschutzgeräte und geschlossene Schuhe. Es ist wichtig, die aseptische Technik jederzeit aufrechtzuerhalten. Bereiten Sie 90 ml mit 0,45% Saline vor. Mit einem sauberen abgestuften Zylinder 90 ml steriles Wasser messen und in einen sauberen Erlenmeyerkolben mit der Bezeichnung 0,45% Salzwassergeben. Wiegen Sie .405 g Natriumchlorid (Sigma-Aldrich NaCl S9888) und fügen Sie es dem Kolben mit der Bezeichnung 0,45% Saline hinzu. Immer wieder wirbeln, bis keine Lösung sichtbar bleibt. Nach Abschluss sollte der Experimentator alle Oberflächen neu sterilisieren und unerwünschte Organismen, Verdünnungsvorräte, Petrischalen oder Einweg-Impfschleifen gemäß den OSHA-Richtlinien entsorgen. Laborkleidung kann vor dem Händewaschen entfernt werden. 2. Medienvorbereitung Wählen Sie Medien aus, die für die Kultivierung eines gewünschten Organismus geeignet sind. In den meisten Szenarien würde eine Brühe ein ausreichendes Bakterienwachstum ermöglichen. Da hier Organismen aus einem Winogradsky-Protokoll gewünscht werden, wurde eine Kolonne aus Calciumcarbonat, Schwefel, Zellulose und Schlamm zusammengebaut und 7 Tage lang ungestört gelassen. Die vorgenannte Säule ist in aerobe, mikroaerophile und anaerobe Abschnitte unterteilt. Wählen Sie ein Medium, das für die Beschichtung des Organismus von Interesse geeignet ist. Die Supplementierung von flüssigen Medien mit mikrobiologischen Agar wird in der Regel als Erstarrungsmittel verwendet. LB Medium/Agar ist ausreichend, wenn Proben aus aeroben, mikroaerophilen und anaeroben Regionen der vorgenannten Säule geerntet werden. Hinweis: Proben aus der mikroaerophilen Region wurden für dieses Verfahren nicht geerntet. Diese Organismen sollten jedoch in Kerzengläsern angebaut werden. Die Einführung einer Kerze in diese Kultivierungskammer vor dem Versiegeln schafft eine sauerstoffarme Umgebung, die für die mikroaerophile Proliferation geeignet ist. Da wir 250 ml vorbereiten möchten, verwenden Sie 500 ml (oder größere) Erlenmeyerkolben, um ein Überkochen beim Autoklavieren zu verhindern. Beschriften Sie eine “Broth” und die andere “Agar”. Bestimmen Sie die Menge an Medien, die zum Erstellen jeder Lösung erforderlich sind, indem Sie den Konzentrationsempfehlungen des Herstellers folgen. LB Agar, hier verwendet, wird durch die Kombination von 25g/L mit Reinstwasser hergestellt. Unser Volumen von 250 ml erfordert eine Lösung von 6,25 LB Agar/250 ml Wasser. In ähnlicher Weise wird LB Broth durch die Kombination des gleichen Verhältnisses von LB Broth und Wasser hergestellt. Da es nicht mit einem Erstarrungsmittel ergänzt wird, wird es nicht verhärten, wenn es gekühlt wird. Wiegen Sie die Medien und mischen Sie es mit Wasser in Proportionen, die den Herstellerempfehlungen entsprechen. Fügen Sie 6,25 g LB Agar zu einem Kolben mit der Bezeichnung “Agar” und 6,25 g LB Broth zu einem Kolben mit der Bezeichnung “Broth” hinzu. Fügen Sie 250 ml Reinstwasser in jeden Kolben. Aluminiumfolie über jeden Kolben wickeln und mit einem Autoklaven Medien mindestens 15 Minuten bei 121°C, 15 psi sterilisieren. Mit einem hitzebeständigen Handschuh oder Pad entfernen Sie die Kolben aus dem Autoklaven, wenn der Zyklus abgeschlossen ist, und legen Sie sie in ein 40-50°C Wasserbad. Sobald die entsprechende Temperatur erreicht ist, gießen Sie den Inhalt des Kolbens mit der Aufschrift “Broth” in einen 250 ml Erlenmeyer oder Rundbodenkolben. Beschriften Sie den 250 ml Kolben als “Lösung0”. Erhalten Sie 10, 100mm x 15 mm sterile Petrischalen und kennzeichnen Sie sie mit dem Datum, dem Namen, der Art der verwendeten Medien und der Winogradsky-Säulenzone, aus der Organismen geerntet werden. Entfernen Sie den Kolben mit der Aufschrift “Agar” aus dem Wasserbad und beginnen Sie, in jede der 10 Petrischalen zu gießen. Jedes Gericht sollte nicht mehr als 15 ml zugesetzt werden. Dies kann auch mit einem Pipettentor und einer 25 ml serologischen Pipette durchgeführt werden, um die Genauigkeit zu verbessern. Verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze, um vorhandene Blasen zu entfernen, und decken Sie dann mit den Plattendeckeln ab und lassen Sie sie über Nacht erstarren. 3. Verdünnende Zubereitung Bereiten Sie zehn Reagenzgläser vor, die 20 ml oder mehr in einem Rack lagern können, und beschriften Sie sie T1-T10. Jede Rohrnummer entspricht dem Verdünnungsfaktor, dem sie entspricht (d. h. T4 = 1×10-4 oder 0,0001 oder 1/10.000der der Lagerkonzentration). Pipetten 9 ml von 0,45% Saline in jedes der 10 Reagenzgläser. Saline-Rohlinge sind nun bereit, durch Autoklaven sterilisiert zu werden. Verwenden Sie Aluminiumfolie, um jedes der 10 Reagenzgläser zu bedecken und dann in ein autoklavkompatibles Reagenzglasregal zu übertragen. Mindestens 15 Minuten bei 121°C, 15 psi sterilisieren. Entfernen Sie Die Rohlinge mit hitzebeständigen Handschuhen und lassen Sie sie abkühlen. Bedecken und lagern Sie bei 4°C, bis sie benötigt werden, wenn die Rohre Raumtemperatur erreicht haben, oder wenn sie zum Anfassen abkühlen. 4. Kultivierung des Zielorganismus “Lösung0” mit einer einzigen Kolonie aus einer zuvor gestreiften Platte oder 50 l eines gefrorenen Bestands impfen. Erlauben Sie dem Zielorganismus Zeit, sich zu replizieren, indem Sie geimpfte “Lösung0″über Nacht mit Schütteln (falls erforderlich) in einen 37°C-Inkubator legen. (Hinweis: Der Kolben sollte abgedeckt werden, um eine Kontamination zu verhindern. Wenn der Zielorganismus aerob ist, verwenden Sie sterile Gaze und Baumwollstecker, um eine Kontamination zu verhindern. Wenn Sie Regionen der Winogradsky-Säule bewerten, entfernen Sie einfach 1 Gramm aus jeder gewünschten Zone (aerobe und anaerobe für die Zwecke dieser Studie) und setzen Sie in T1 erneut ab, bevor Sie mit Schritt 5.3 fortfahren. 5. Serielle Verdünnung Den Kolben mit der Aufschrift “Nährstoffbrühe” aus dem Inkubator beziehen und kräftig schütteln. Pipetten 1 ml “Lösung0″in das Reagenzglas mit der Bezeichnung T1. Vortex T1. Bei der Bewertung von Winogradsky-Explants 1 Gramm der gewünschten Zone wiegen und vor dem Wirbeln zu T1 hinzufügen. (Hinweis: Hier wird aus Gründen der Einfachheit 1 ml verwendet – es können auch kleinere oder größere Verdünnungsvolumina verwendet werden). Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T1 und fügen Sie es dem Reagenzglas T2 hinzu. Vortex T2. Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T2 und fügen Sie es dem Reagenzglas T3 hinzu. Vortex T3. Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T3 und fügen Sie es dem Reagenzglas T4 hinzu. Vortex T4. Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T4 und fügen Sie es dem Reagenzglas T5 hinzu. Vortex T5. Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T5 und fügen Sie es dem Reagenzglas T6 hinzu. Vortex T6. Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T6 und fügen Sie es dem Reagenzglas T7 hinzu. Vortex T7. Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T7 und fügen Sie es dem Reagenzglas T8 hinzu. Vortex T8. Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T8 und fügen Sie es dem Reagenzglas T9 hinzu. Vortex T9. Entfernen Sie 1 ml aus dem Reagenzglas T9 und fügen Sie es dem Reagenzglas T10 hinzu. 6. Verbreitung Plating 100 l einer verdünnten Probe aus T1 direkt auf eine Petrischale. Dieser Schritt kann, muss aber nicht für jedes Rohr wiederholt werden. Erhalten Sie einen sterilen Einweg-Streustab oder Flamme sterilisieren eine Glasstreustange. Gleiten Sie in einer Bewegung im Uhrzeigersinn/gegen den Uhrzeigersinn den horizontalen Teil der Streustange, um die Probe gleichmäßig innerhalb der Petrischale zu verteilen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Zone der Winogradsky-Spalte, die ausgewertet werden soll. Inkubieren Sie Platten in einem 37°C Inkubator für 24 Stunden. Verwenden Sie für anaerobe Organismen eine anaerobe Kammer. 7. Streaking Wählen Sie eine geeignete Verdünnung Ihres Zielorganismus aus. Beispielsweise ergibt Lösung4 eine 1/10.000. Verdünnung Ihrer Anfangskonzentration. Typischerweise werden Verdünnungen von 1/1.000th (T3/Lösung), 1/1.000.000th (T6/Lösung6) und 1/1,000,000,000th (T9/Lösung9) ausgewertet, um Mikroben aufzuzählen. Mit einer sterilen Einweg-Impfschleife aus Kunststoff oder einer wiederverwendbaren Metall-Impfschleife, die seit nicht weniger als 10 Sekunden unter Beschuss steht, tauchen Sie ab Schritt 5 in die gewünschte Lösung ein. Kalibrierte Impfschleifen sollten 0,01 ml übertragen. (Achtung: Lassen Sie nicht zulassen, dass geflammte Schleife Bakterien sofort nach dem Entfernen von der Hitze kontaktieren) Die Petrischalenabdeckung auf einer Seite leicht anheben, so dass nur die Impfschlaufe auf den Agar zugreifen kann. Gleiten Sie die Impfschleife über die Oberseite der Medien in einer Zick-Zack-Manier, um darauf zu achten, den Agar nicht zu kompromittieren. Senken Sie den Petrischalendeckel. Verwenden Sie eine neue Einweg-Impfschleife oder sterilisieren Sie Ihre wiederverwendbare Schleife erneut. Drehen Sie die Platte um etwa 1/3rd (ca. 118°) und reduzieren Sie die Frequenz der Zick-Zack-Bewegung. Verwenden Sie erneut eine neue Einwegschleife oder sterilisieren Sie eine Metallschleife, bevor Sie sich ein letztes Mal drehen, und reduzieren Sie die Zick-Zack-Frequenz erneut. Senken Sie den Petrischalendeckel. Wiederholen Sie die Schritte 7.2 – 7.6, bis mindestens drei Petrischalen für drei verschiedene Verdünnungen gestreift wurden, indem sie eine neue Einwegschleife verwenden oder eine wiederverwendbare Schleife erneut entzünden (Abbildung 2). Die gestreiften Petrischalen über Nacht in einen 37°C-Inkubator geben. Für anaerobe Organismen verwenden Sie eine anerobische Kammer. 8. Datenanalyse und Ergebnisse Kulturen wurden aus den oxischen und anoxischen Zonen einer 7-tägigen Winogradsky-Säule geerntet. Diese Zonen eignen sich für heterotrophe bzw. eisenoxidierende Anaeraare. Säulenexplants wurden vor dem Streichen oder Ausbreiten auf LB Agar-Platten seriell verdünnt. Streaking ergab eine gemischte Population aus jeder der bewerteten Winogradsky-Zonen. Streuplatten führten zu ähnlichen Ergebnissen. Um KBE/ml oder KBE/g zu berechnen, durchschnittlich die Anzahl der gezählten Kolonien aus drei Platten. Multiplizieren Sie die durchschnittliche Anzahl der Kolonien mit dem Verdünnungsfaktor und dividieren Sie durch den Betrag aliquoted. Wenn beispielsweise durchschnittlich 65 Kolonien auf Platten gezählt würden, die mit 0,1 ml Lösung6 (T6) geimpft wurden, würde die zuvor beschriebene Formel 650.000.000 KBE/ml entsprechen. Isolierte Kolonien können nun aus jeder Platte ausgewählt werden, um sie in Anreicherungstests zu verwenden, um die Artenidentität zu bestimmen.

Applications and Summary

Bacterial enumeration and strain isolation by plating requires manageable concentrations of target organisms. Successful plating is therefore contingent upon serial dilution. As such, the aforementioned techniques remain the cornerstone of microbiological examination and experimentation. Though simple by design, dilution factors and plating technique can be modified to by the experimenter to bolster outcomes without compromising the integrity of each method. Plotting the four phases of bacterial growth can be helpful when characterizing desired microbes. These phases, lag, log, stationary, and death, are marked by changes in bacterial replication. The lag phase features slow growth due to physiological adaptation, the log phase is the period of maximum proliferation featuring an exponential rise in viable cells, stationary phase is then reached due to environmental limitations and accumulations of toxins, before the death phase where cell counts begin to fall. This can be accomplished by serially diluting (or 1-step diluting to avoid confusion) Solution₀ every hour for a total of 8 hours, beginning at Time₀ (Solution₀ should be returned to a shaking incubator after each dilution). Calculate the log₁₀ of CFU/ml for a single diluent of Time₀ and plot on the Y-axis. Repeat this calculation for the sample Time₁ (make sure calculate CFU/mL using the same dilution factor as Time₀). Repeat until each time (Time₁-Time₈) are plotted on the X-axis.

References

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Sanders., E.R. (2012) Aseptic Laboratory Technique: Plating Methods. JoVE 63:e3063.

Transcript

Sometimes, in order to identify and study bacteria we first need to isolate and enrich them from a sample. For example, samples obtained from a Winogradsky Column are mixed, meaning they contain multiple species or strains of bacteria, so studying an individual bacterium or enumerating the different kinds present can be challenging. To this end, serial dilution and plating techniques are typically employed to reliably quantify bacterial load and isolate individual colonies.

Serial dilution is a process through which the concentration of an organism, bacteria in this example, is systematically reduced through successive resuspension in fixed volumes of liquid diluent. Usually the volume of the diluent is a multiple of 10 to facilitate logarithmic reduction of the sample organism. For example, one gram of sediment is first removed from the Winogradsky zone of interest and added to 10 milliliters of an appropriate liquid medium. Then, one milliliter of this first dilution is added to another tube containing nine milliliters of medium. The process can be repeated until several different concentrations of bacteria have been prepared. Serial dilution is the key to enumeration of bacteria in this example, since mixed samples from a Winogradsky Column contain an unknown, often large, number of bacteria.

Next, streak plating and spread plating enable the isolation and enumeration of bacteria within a sample, respectively. Streaking is accomplished by introducing a diluted sample to one section of the solid medium supplemented with nutrient, which is divided into thirds. This inoculum is then spread over each third of the plate in a zig-zag pattern. As different sections of the plate are streaked, crossing from the previous sample only once, the sample is spread more thinly. This means that you may only need to streak from one dilution to achieve individual colonies in the later sections. After incubation, the streaked plates allow for observations of colony morphology, information that can help differentiate between different bacterial species.

Alternatively, if the main goal is the enumeration of the bacteria in the sample spread plating may be used. In spread plating, an aliquot of a single sample is spread evenly over the entire surface of solid medium. Typically, because we don’t know the bacterial numbers in the mixed sample, a spread plate is made for each of the dilutions or a representative sample of them. After incubation, enumeration can be performed using these spread plates. Any plates with colony counts fewer than 30 should be discarded, since small counts are subject to greater error. Similarly, any counts over 300 should be discarded because colony crowding and overlapping can lead to underestimation of colony count. If the colony counts of each of these remaining dishes is recorded and multiplied by the dilution factor, and then divided by the volume plated, this yields the colony forming units, or CFUs, per milliliter of suspension. In this video, you will learn how to qualitatively and quantitatively evaluate a sample containing a known bacterium, and the microbial communities contained in various regions of a Winogradsky Column via serial dilution, spread plating, and streak plating.

First, put on any appropriate personal protective equipment including a lab coat, gloves, and goggles. Next, sterilize the workspace with 70% ethanol and wipe down the surface. Next, gather two 500 milliliter Erlenmeyer flasks and label one broth and the other agar. To prepare LB agar solution, mix approximately 6.25 grams of LB agar, three grams of technical agar, and 250 milliliters of distilled water in the flask labeled agar.

Then, prepare LB broth by combining 2. 5 grams of LB media and 100 milliliters of distilled water in the flask labeled broth. After autoclaving the flasks, use a heat resistant glove to remove the flasks from the autoclave and place them in a 40 to 50 degree Celsius water bath. Once the flasks are 50 degrees Celsius, carefully prepare three 100 milliliter aliquots of the broth solution and label each aliquot solution zero. Next, gather 10 sterile petri dishes and label them with the date, name, type of media used, and the Winogradsky Column zone that the organisms will be harvested from. Pipette 15 milliliters of agar from the agar flask into each petri dish. Then, use the pipette tip to remove any bubbles, replace the plate lids, and allow them to solidify on the bench top overnight.

The next day, wipe down the bench top with 70% ethanol. Next, label 10 20 milliliter test tubes T1 through T10 and place them in a rack. Pipette nine milliliters of .45% saline into each tube. Now, cover each of the 10 test tubes loosely with their caps and transfer them to an autoclave-compatible test tube rack. After the cycle is complete, remove the saline blanks using heat resistant gloves and allow them to cool. Store the tubes at room temperature until they have reached approximately 22 degrees Celsius.

To cultivate a known target organism, E. coli in this example, inoculate 100 milliliters of solution zero with a single colony from a previously streaked plate. Then, cover the tube and incubate it over night at 37 degrees Celsius. To evaluate the regions of a Winogradsky Column, add approximately one gram of material from the aerobic zone to T1 and resuspend by vortexing. Then, repeat this process with one gram of material from the anaerobic zone.

Remove the tube containing solution zero inoculated with E. coli from the incubator and shake it. Then, pipette one milliliter of the solution into a T1 test tube and vortex to mix. Remove one milliliter of solution from T1 and transfer it to T2, vortexing to mix. Repeat this process through tube T10. To evaluate the aerobic and anaerobic zones of the Winogradsky Column, remove one milliliter of solution from each of the previously prepared T1 tubes and transfer it to the appropriate T2 tubes. Then, continue the serial dilutions through the T10 tubes as previously demonstrated.

To spread plate, pipette 100 microliters of the diluted sample from each T3 tube on to the corresponding petri dish. Then, use a sterile spreading rod to gently distribute the sample on to the petri dish and replace the plate lid. Repeat this process for the T6 and T9 dilutions, as previously demonstrated. Incubate the plates containing aerobic organisms in a 37 degree Celsius incubator for 24 hours. Incubate the plates containing anaerobic organisms in an anaerobic chamber set to 37 degrees Celsius for 24 hours. The next day remove the T3, T6, and T9 dilution plates from the incubator and the anaerobic chamber and transfer them to the bench top. Working with one plate at a time, glide a sterile inoculating loop across the top of the media in a zig-zag pattern. Then, replace the petri dish lid. Next, rotate the plate by 1/3 and sterilize the loop to reduce the frequency of the previously made zig-zag pattern. Again, after sterilizing the loop, rotate the plate by 1/3, reduce the frequency of the zig-zag pattern one last time, and replace the lid. Repeat this streaking method for the remaining plates, as previously shown. Then, place the streaked plates containing aerobic organisms in a 37 degree Celsius incubator overnight and the streaked plates containing anaerobic organisms in an anaerobic chamber set to 37 degrees Celsius overnight.

Cultures were harvested from the aerobic and anaerobic zones of a seven day Winogradsky Column. Then, the cultures were serially diluted prior to streaking and spreading on LB agar plates. Streaking revealed a mixed population from each of the evaluated Winogradsky zones, and the spread plates produced similar results. A plate streaked from a mixed population will result in bacterial colonies of different shapes, sizes, textures, and colors. In contrast, the streaked and spread plates containing the known organism, E. coli, demonstrated a homologous population. Generally, it is best to calculate CFUs per milliliter using the average colony count of three plates spread with the same sample and dilution factor. Multiply the average number of colonies by the dilution factor and divide by the amount aliquoted. Finally, isolated colonies chosen from each plate can be used in further enrichment assays to determine species identity.