Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Start prosedyren med å plassere en bedøvet voksenfisk på en stabel med absorberende papir. Bruk nå et sterilt barberblad til å kutte halefinnen og raskt overføre fisken til en tank som inneholder ferskvann for utvinning. Overfør haleklemmen til et rent rør som inneholder en lysisbuffer. Lysisbufferen inneholder ikke-ioniske vaskemidler, som løser plasmamembranen og atommembranen til en celle. Bufferen inneholder også et enzym kalt proteinase K som bryter ned proteiner og muliggjør frigjøring av DNA i lysatet. Det forringer også nukleaser, og beskytter DNA fra nuklease fordøyelsen.
La nå rørene med haleklemmer i en inkubator over natten bryte ned vevet helt ved 55 grader Celsius med kontinuerlig rotasjon. Deretter varmer du røret ved 95 grader Celsius i 15 minutter for å inaktivere proteinase K. Sentrifugerer røret til pellets ufordøyd materiale og overfør det supernatante som inneholder DNA til et annet rør. Legg til alkohol for å utfelle DNA og sentrifuge igjen for å samle DNA i en pellets. I følgende protokoll vil vi isolere DNA fra haleklippet til en voksen sebrafisk og fra et helt embryo.
- På dagen for DNA-preparatet, tilsett fersk proteinase K til lysisbufferen i en konsentrasjon på 1 milligram per milliliter. Vev kan samles fra en voksen fisk ved hjelp av et finklipp eller fra en embryonal fisk.
Først bedøv fisken i trikainoppløsning. Vent til gjellebevegelsene går sakte. Legg deretter fisken på en bunke vev og, med et sterilt barberblad, kutt av et lite stykke halefinne ca 2 til 3 millimeter lang. Legg fisken raskt i en merket tank med ferskvann for utvinning.
Plukk opp finklemmen med en steril pipettespiss og overfør den til et rør fylt med hundre mikroliter DNA-lysisbuffer. Pass på å merke både dyrets tank og røret. Inkuber alle de oppsamlede vevene i minst fire timer og opp til natten ved 55 grader Celsius.
Etter inkubasjonen inaktiverer du proteinase K ved å varme opp rørene ved 95 grader Celsius i 15 minutter. Disse prøvene skal brukes til PCR umiddelbart, men kan også lagres ved minus 20 grader Celsius i opptil tre måneder.
