Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Emici kağıt yığınına uyuşturulmış bir yetişkin balık yerleştirerek işleme başlayın. Şimdi kuyruk yüzgecini kesmek için steril bir jilet kullanın ve balığı geri kazanım için tatlı su içeren bir tanka hızlı bir şekilde aktarın. Kuyruk klipsini lizis tamponu içeren temiz bir tüpe aktarın. Lizis tamponu, plazma zarını ve bir hücrenin nükleer zarını çözünen noyonik deterjanlar içerir. Tampon ayrıca proteinleri parçalayan ve DNA'nın lizete salınmasını sağlayan proteinaz K adı verilen bir enzim içerir. sindirim.
Şimdi, sürekli dönme ile 55 santigrat derecede dokuyu tamamen parçalamak için tüpleri bir gece boyunca bir inkübatörde kuyruk klipsleri ile bırakın. tüpü 95 santigrat derecede 15 dakika ısıtın proteinaz K. Santrifüjü devre dışı bırakmak için tüpü sindirilmemiş malzemeye saçmaya bırakın ve DNA içeren süpernatantı başka bir tüpe aktarın. DNA'yı çökeltmek için alkol ekleyin ve DNA'yı bir pelet içinde toplamak için santrifüj ekleyin. Aşağıdaki protokolde, DNA'yı yetişkin bir zebra balığının kuyruk klibinden ve bütün bir embriyodan izole edeceğiz.
- DNA'nın hazırlandığı gün, mililitre başına 1 miligram konsantrasyonda lizis tamponuna taze proteinaz K ekleyin. Doku, yüzgeç klipsi kullanılarak yetişkin bir balıktan veya embriyonik bir balıktan toplanabilir.
İlk olarak, balığı trikain çözeltisinde uyuşturun. Solungaç hareketleri yavaşlayana kadar bekleyin. Sonra, balığı bir doku yığınına koyun ve steril bir jiletle kuyruk yüzgecinin küçük bir parçasını yaklaşık 2 ila 3 milimetre uzunluğunda kesin. Balıkları geri kazanım için hızlı bir şekilde tatlı su ile etiketlenmiş bir tanka yerleştirin.
Yüz mikrolitre DNA liziz tamponu ile dolu bir tüpe aktarın. Hem hayvanın tankını hem de tüpü etiketleyin. Toplanan tüm dokuları en az dört saat boyunca ve 55 santigrat derecede bir geceye kadar kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, tüpleri 95 santigrat derecede 15 dakika ısıtarak proteinaz K'yi devre dışı bırakın. Bu numuneler hemen PCR için kullanılmalıdır, ancak üç aya kadar eksi 20 santigrat derecede de saklanabilir.
