Kuyruk Klipsinden DNA Ekstraksiyonu: Zebra Balığı Genotiplemesinde Kullanılan Bir Yöntem

Overview

Bu makalede zebra balığı kuyruk klipsinden DNA ekstraksiyonu açıklanmaktadır. Protokol, zebra balığı genotiplerini analiz etmek için hızlı ve verimli bir yöntem göstermektedir.

Protocol

1. DNA Hazırlama

1. DNA lizis tamponu hazırlayın: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.3, %0.3 Ara 20, %0.3 NP40. Kullanım gününde 1 mg/ml'lik son konsantrasyona taze Proteinaz K ekleyin.
2. Doku koleksiyonu:
   1. Yetişkin balık yüzgeci klipsi için:
      1. Balıkları uyuşturun: Balığı% 0.004 MS-222 (trikain) çözeltisine yerleştirin. Solungaç hareketi yavaşlayana kadar bekleyin.
      2. Balıkları 5-10 Kimwipes yığınına koyun ve kuyruk yüzgecinin yaklaşık 2-3 mm'lik küçük bir parçasını steril bir jiletle kesin.
      3. Balıkları geri kazanım için tatlı su ile etiketlenmiş bir tanka hızlı bir şekilde yerleştirin; hem tankı hem de yüzgeç klipsini içerecek ilgili tüpü dikkatlice etiketle. Suyu değiştirin ve balıkları iki günde bir besleyin.
      4. Yüzgeç klipsini steril bir pipet ucuyla alın ve 100 μl DNA liziz tamponu ile dolu bir tüpe aktarın.
      5. Pipet ucunu atın ve jiletleri keskin bir kaba atın.
   2. Embriyo kuyruk klipsi için:
      1. Embriyoları% 0.004 MS-222 (trikain) çözeltisine yerleştirin. 2 dakika bekleyin.
      2. Bir parça kuyruğu, diseksiyon mikroskobu altında kümes uçlarıyla kesin.
      3. Kuyruğu 30 μl DNA liziz tamponu ile dolu etiketli bir tüpe koyun.
      4. Embriyoyu hızla% 100 μl 4 paraformaldehit içeren bir tüpe koyun.
      5. Etiket tüpleri embriyolar ve ilgili kuyruk tüpleri ile.
      6. Sabitleme için tüpleri embriyolarla birlikte gece boyunca 4 °C'de saklayın.
      7. Kontaminasyonu en aza indirmek için her embriyo arasında Milli-Q suyu ve Kimwipes kullanarak tokmakları temizleyin.
   3. Tüm embriyolar için:
      1. Embriyoları% 0.004 MS-222 (trikain) çözeltisine yerleştirin. 2 dakika bekleyin.
      2. 100 μl DNA liziz tamponu ile dolu bir tüpe 1-5 embriyo koyun. İtikame gerek yok.
3. DNA sindirimi
   Tüpleri 55 °C'de bir gecede 4 saat boyunca doku (yüzgeç veya kuyruk klipsleri veya embriyolar) ile kuluçkaya yatırın.
4. Proteinaz K'yi devre dışı bırakma
   15 dakika boyunca 95 °C'ye kadar ısı tüpleri, PCR için hemen kullanılmalı veya 3 aya kadar -20 °C'de saklanmalıdır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Reaction LightScanner Master Mix	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Tricaine
Paraformaldehyde