Extraction de l’ADN à partir du clip tail: Une méthode utilisée dans le génotypage zebrafish

Overview

Cet article décrit l’extraction de l’ADN à partir du clip de queue de poisson zèbre. Le protocole démontre une méthode rapide et efficace pour analyser les génotypes de poisson zèbre.

Protocol

1. Préparation de l’ADN

1. Préparer tampon de lyse d’ADN: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Ajouter la proteinase K fraîche à une concentration finale de 1 mg/ml le jour de l’utilisation.
2. Collection de tissus :
   1. Pour le clip adulte d’aileron de poisson :
      1. Anesthésier les poissons : Placer le poisson dans la solution 0,004 % MS-222 (tricaine). Attendez que le mouvement des branchies ralentit.
      2. Mettez le poisson sur une pile de 5-10 Kimwipes et coupez un petit morceau de l’aileron arrière, environ 2-3 mm, avec une lame stérile de rasoir.
      3. Placer rapidement le poisson dans un réservoir étiqueté avec de l’eau douce pour la récupération; Étiquetez soigneusement le réservoir et le tube correspondant qui contiendra le clip de l’aileron. Changer l’eau et nourrir le poisson tous les deux jours.
      4. Ramasser le clip de l’aileron avec une pointe stérile pipette et le transférer dans un tube rempli de tampon de lyse d’ADN de 100 μl.
      5. Jetez la pointe pipette, et jeter la lame de rasoir dans un récipient sharps.
   2. Pour le clip de queue d’embryon :
      1. Placer les embryons dans la solution 0,004 % MS-222 (tricaine). Attends 2 min.
      2. Couper un morceau de queue avec des forceps sous un microscope disséquant.
      3. Mettez la queue dans un tube étiqueté rempli d’un tampon de lyse d’ADN de 30 μl.
      4. Mettez rapidement l’embryon dans un tube contenant 100 μl 4% de paraformaldéhyde.
      5. Étiquetez les tubes avec des embryons et leurs tubes de queue correspondants.
      6. Conserver les tubes avec des embryons à 4 °C pendant la nuit pour la fixation.
      7. Nettoyez les forceps à l’aide de l’eau Milli-Q et des kimwipes entre chaque embryon afin de minimiser la contamination.
   3. Pour les embryons entiers :
      1. Placer les embryons dans la solution 0,004 % MS-222 (tricaine). Attends 2 min.
      2. Mettez 1-5 embryons dans un tube rempli de tampon de lyse d’ADN de 100 μl. La déchorionation n’est pas nécessaire.
3. Digestion de l’ADN
   Incuber les tubes avec des tissus (nageoires ou pinces de queue ou embryons) à 55 °C pendant 4 heures jusqu’à la nuit.
4. Inactiver la Proteinase K
   Les tubes thermiques à 95 °C pendant 15 min. L’ADN doit être utilisé immédiatement pour la PCR, ou stocké à -20 °C jusqu’à 3 mois.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Reaction LightScanner Master Mix	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Tricaine
Paraformaldehyde