DNA Ekstraktion fra Tail Clip: En metode, der anvendes i Zebrafish Genotyping

Overview

Denne artikel beskriver DNA-ekstraktion fra zebrafisk hale klip. Protokollen demonstrerer en hurtig og effektiv metode til at analysere zebrafisk genotyper.

Protocol

1. DNA-forberedelse

1. Forbered DNA lysis buffer: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Der tilsættes frisk Proteinase K til en endelig koncentration på 1 mg/ml på brugsdagen.
2. Vævsindsamling:
   1. For voksne fisk fin klip:
      1. Bedøve fisk: Placer fisken i 0,004% MS-222 (tricain) opløsning. Vent til gill bevægelse bremser.
      2. Sæt fisk på en stak på 5-10 Kimwipes og skær et lille stykke halefinne, ca. 2-3 mm, med et sterilt barberblad.
      3. Placer hurtigt fisken i en mærket tank med ferskvand til genopretning; forsigtigt mærke både tanken og tilsvarende rør, der vil indeholde fin klip. Skift vandet og fodre fisken hver anden dag.
      4. Finclipsen op med en steril pipettespids, og overfør den til et rør fyldt med 100 μl DNA lysis buffer.
      5. Kassér pipettespidsen, og kassér barberbladet i en skarp beholder.
   2. For embryo hale klip:
      1. Placer embryoner i 0,004% MS-222 (tricain) opløsning. Vent 2 minutter.
      2. Skær et stykke hale med pincet under et dissekerende mikroskop.
      3. Sæt halen i et mærket rør fyldt med 30 μl DNA lysis buffer.
      4. Sæt hurtigt embryoet i et rør, der indeholder 100 μl 4% paraformaldehyd.
      5. Label rør med embryoner og deres tilsvarende hale rør.
      6. Rørene opbevares med embryoner ved 4 °C natten over til fiksering.
      7. Rengør tangen ved hjælp af Milli-Q vand og Kimwipes mellem hvert foster for at minimere forurening.
   3. For hele embryoner:
      1. Placer embryoner i 0,004% MS-222 (tricain) opløsning. Vent 2 minutter.
      2. Sæt 1-5 embryoner i et rør fyldt med 100 μl DNA lysis buffer. Dechorionation er ikke nødvendig.
3. DNA-fordøjelse
   Inkuber rør med væv (finne- eller haleklemmer eller embryoner) ved 55 °C i 4 timer i op til natten over.
4. Inaktiver Proteinase K
   Varmerør til 95 °C i 15 min. DNA skal straks anvendes til PCR eller opbevares ved -20 °C i op til 3 måneder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Reaction LightScanner Master Mix	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Tricaine
Paraformaldehyde