Overview
Denne artikkelen beskriver DNA-ekstraksjon fra sebrafiskhaleklipp. Protokollen viser en rask og effektiv metode for å analysere sebrafiskgenotyper.
Protocol
1. DNA-forberedelse
- Klargjør DNA lysis buffer: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Tilsett fersk Proteinase K i en endelig konsentrasjon på 1 mg/ml på bruksdagen.
- Vev samling:
- For voksen fisk fin klipp:
- Bedøv fisk: Legg fisken i 0,004% MS-222 (trikain) løsning. Vent til gillbevegelsen bremser.
- Sett fisk på en stabel med 5-10 Kimwipes og kutt et lite stykke halefinne, ca 2-3 mm, med et sterilt barberblad.
- Plasser fisken raskt i en merket tank med ferskvann for utvinning; merk forsiktig både tanken og det tilsvarende røret som vil inneholde finklemmen. Bytt vann og mate fisken annenhver dag.
- Plukk opp finklemmen med en steril pipettespiss og overfør den til et rør fylt med 100 μl DNA lysis buffer.
- Kast pipettespissen, og kast barberbladet i en beholder med skarpe gjenstander.
- For embryo hale klipp:
- Plasser embryoer i 0,004% MS-222 (trikain) løsning. Vent 2 min.
- Klipp et stykke hale med tang under et dissekerende mikroskop.
- Sett halen i et merket rør fylt med 30 μl DNA lysis buffer.
- Legg raskt embryoet i et rør som inneholder 100 μl 4% paraformaldehyd.
- Etikettrør med embryoer og deres tilsvarende halerør.
- Oppbevar rørene med embryoer ved 4 °C over natten for fiksering.
- Rengjør tangene ved hjelp av Milli-Q vann og Kimwipes mellom hvert embryo for å minimere forurensning.
- For hele embryoer:
- Plasser embryoer i 0,004% MS-222 (trikain) løsning. Vent 2 min.
- Sett 1-5 embryoer i et rør fylt med 100 μl DNA lysis buffer. Dechorionation er ikke nødvendig.
- For voksen fisk fin klipp:
- DNA-fordøyelse
Inkuber rør med vev (fin eller hale klips eller embryoer) ved 55 °C i 4 timer opp til natten. - Inaktiver Proteinase K
Varmerør til 95 °C i 15 min. DNA skal brukes til PCR umiddelbart, eller oppbevares ved -20 °C i opptil 3 måneder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
Tricaine | |||
Paraformaldehyde |