DNA-ekstraksjon fra haleklipp: En metode som brukes i sebrafiskgenotyping

Abstract

Kilde: Xing L., et al. Rask og effektiv sebrafiskgenotyping ved hjelp av PCR med høyoppløselig smelteanalyse. J. Vis. Utt. (2014).

Denne artikkelen beskriver DNA-ekstraksjon fra sebrafiskhaleklipp. Protokollen viser en rask og effektiv metode for å analysere sebrafiskgenotyper.

Protocol

1. DNA-forberedelse

1. Klargjør DNA lysis buffer: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Tilsett fersk Proteinase K i en endelig konsentrasjon på 1 mg/ml på bruksdagen.
2. Vev samling:
   1. For voksen fisk fin klipp:
      1. Bedøv fisk: Legg fisken i 0,004% MS-222 (trikain) løsning. Vent til gillbevegelsen bremser.
      2. Sett fisk på en stabel med 5-10 Kimwipes og kutt et lite stykke halefinne, ca 2-3 mm, med et sterilt barberblad.
      3. Plasser fisken raskt i en merket tank med ferskvann for utvinning; merk forsiktig både tanken og det tilsvarende røret som vil inneholde finklemmen. Bytt vann og mate fisken annenhver dag.
      4. Plukk opp finklemmen med en steril pipettespiss og overfør den til et rør fylt med 100 μl DNA lysis buffer.
      5. Kast pipettespissen, og kast barberbladet i en beholder med skarpe gjenstander.
   2. For embryo hale klipp:
      1. Plasser embryoer i 0,004% MS-222 (trikain) løsning. Vent 2 min.
      2. Klipp et stykke hale med tang under et dissekerende mikroskop.
      3. Sett halen i et merket rør fylt med 30 μl DNA lysis buffer.
      4. Legg raskt embryoet i et rør som inneholder 100 μl 4% paraformaldehyd.
      5. Etikettrør med embryoer og deres tilsvarende halerør.
      6. Oppbevar rørene med embryoer ved 4 °C over natten for fiksering.
      7. Rengjør tangene ved hjelp av Milli-Q vann og Kimwipes mellom hvert embryo for å minimere forurensning.
   3. For hele embryoer:
      1. Plasser embryoer i 0,004% MS-222 (trikain) løsning. Vent 2 min.
      2. Sett 1-5 embryoer i et rør fylt med 100 μl DNA lysis buffer. Dechorionation er ikke nødvendig.
3. DNA-fordøyelse
   Inkuber rør med vev (fin eller hale klips eller embryoer) ved 55 °C i 4 timer opp til natten.
4. Inaktiver Proteinase K
   Varmerør til 95 °C i 15 min. DNA skal brukes til PCR umiddelbart, eller oppbevares ved -20 °C i opptil 3 måneder.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Reaction LightScanner Master Mix	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Tricaine
Paraformaldehyde