DNA-extraktion från svansklämma: En metod som används vid zebrafisk genotypning

Abstract

Källa: Xing L., et al. Snabb och effektiv zebrafisk genotypning med PCR med högupplöst smältanalys. J. Vis. Exp. (2014).

Denna artikel beskriver DNA-extraktion från zebrafisk svansklämma. Protokollet visar en snabb och effektiv metod för att analysera zebrafisk genotyper.

Protocol

1. DNA-preparat

1. Förbered DNA-lysbuffert: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Interpolering 20, 0,3% NP40. Tillsätt färskt Proteinase K till en slutlig koncentration på 1 mg/ml på användningsdagen.
2. Vävnadsinsamling:
   1. För vuxen fiskfena klipp:
      1. Bedöva fisk: Placera fisken i 0,004% MS-222 (trikain) lösning. Vänta tills gillrörelsen saktar ner.
      2. Lägg fisk på en stapel med 5-10 Kimwipes och skär en liten bit av svansfenan, ca 2-3 mm, med ett sterilt rakblad.
      3. Placera snabbt fisken i en märkt tank med färskt vatten för återhämtning; märk noggrant både tanken och motsvarande rör som innehåller fenklämman. Byt vatten och mata fisken varannan dag.
      4. Plocka upp fenklämman med en steril pipettspets och överför den till ett rör fyllt med 100 μl DNA-lysbuffert.
      5. Kassera pipettspetsen och kasta rakbladet i en behållare med vassa föremål.
   2. För embryostjärtklämma:
      1. Placera embryon i 0,004% MS-222 (trikain) lösning. Vänta två minuter.
      2. Skär en bit svans med tång under ett dissekerande mikroskop.
      3. Lägg svansen i ett märkt rör fyllt med 30 μl DNA-lysbuffert.
      4. Lägg snabbt embryot i ett rör som innehåller 100 μl 4% paraformaldehyd.
      5. Märka rör med embryon och motsvarande svansrör.
      6. Förvara rören med embryon vid 4 °C över natten för fixering.
      7. Rengör tången med Milli-Q-vatten och Kimwipes mellan varje embryo för att minimera kontaminering.
   3. För hela embryon:
      1. Placera embryon i 0,004% MS-222 (trikain) lösning. Vänta två minuter.
      2. Lägg 1-5 embryon i ett rör fyllt med 100 μl DNA-lysbuffert. Dechorionation är inte nödvändigt.
3. DNA-matsmältning
   Inkubera rör med vävnad (fen- eller svansklämmor eller embryon) vid 55 °C i 4 timmar fram till över natten.
4. Inaktivera Proteinas K
   Värmerör upp till 95 °C i 15 min. DNA ska omedelbart användas för PCR eller förvaras vid -20 °C i upp till 3 månader.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Reaction LightScanner Master Mix	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Tricaine
Paraformaldehyde