Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Начните процедуру с размещения обезболивающей взрослой рыбы на стопку абсорбющей бумаги. Теперь используйте стерильное лезвие бритвы, чтобы сократить хвостовой плавник и быстро передать рыбу в бак с пресной водой для восстановления. Передача хвостового зажима в чистую трубку, содержащую буфер лиза. Буфер лиза содержит неионные моющие средства, которые solubilize плазменной мембраны и ядерной мембраны клетки. Буфер также содержит фермент под названием протеиназа K, который расщепляет белки и позволяет выпуск ДНК в лизате. пищеварения.
Теперь оставьте трубки с хвостовыми зажимами в инкубаторе на ночь, чтобы полностью сломать ткань при 55 градусах Цельсия с непрерывным вращением. Далее нагреть трубку при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 15 минут, чтобы инактивировать протеиназу K. Центрифуга трубки гранулировать непереваренный материал и передать супернатант, содержащий ДНК в другую трубку.Добавить алкоголь, чтобы осаждать ДНК и центрифугу снова собирать ДНК в гранулы.
- В день приготовления ДНК добавьте свежий протеиназу K в буфер лиза при концентрации 1 миллиграмм на миллилитр. Ткань может быть собрана у взрослой рыбы с помощью плавника или из эмбриональной рыбы.
Во-первых, обезболивать рыбу в растворе tricaine. Подождите, пока жаберные движения замедляются. Затем положите рыбу на стопку тканей и, с помощью стерильного лезвия бритвы, отрежьте небольшой кусочек хвостового плавника длиной от 2 до 3 миллиметров. Быстро поместите рыбу в помеченный бак с пресной водой для восстановления.
Возьмите плавник клип с стерильной пипетки отзыв и передать его в трубку заполнены сто микролитров буфера лиза ДНК. Не забудьте обозначить как бак животного и трубки. Incubate все собранные ткани, по крайней мере четыре часа и до ночи при 55 градусов по Цельсию.
После инкубации инактивировать протеиназу K путем нагрева труб при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 15 минут. Эти образцы следует использовать для ПЦР немедленно, но также могут храниться при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение трех месяцев.
