Overview
В этой статье описывается извлечение ДНК из клипа хвоста зебры. Протокол демонстрирует быстрый и эффективный метод анализа генотипов зебры.
Protocol
1. Подготовка ДНК
- Подготовка буфера ДНК-лиза: 50 мМ ККл, 10 мм Трис-HCl рН 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Добавьте свежий протеиназы K к окончательной концентрации 1 мг/мл в день использования.
- Коллекция тканей:
- Для взрослых рыбий плавник клип:
- Анестезия рыбы: Поместите рыбу в 0,004% MS-222 (трикаин) раствор. Подождите, пока движение жабры замедлится.
- Положите рыбу на стопку из 5-10 кимвипов и вырежьте небольшой кусочек хвостового плавника, около 2-3 мм, стерильным лезвием бритвы.
- Быстро поместите рыбу в помеченный бак с пресной водой для восстановления; тщательно обозначить как бак и соответствующую трубку, которая будет содержать плавник клип. Изменение воды и кормить рыбу через день.
- Возьмите плавник клип с стерильной наконечником пипетки и передать его в трубку, наполненную 100 йл ДНК лиза буфера.
- Отбросьте наконечник пипетки и выбросьте лезвие бритвы в контейнер с острыми.
- Для зажима хвоста эмбриона:
- Поместите эмбрионы в 0,004% раствор MS-222 (трикаин). Подождите 2 мин.
- Вырезать кусок хвоста с типсами под рассечением микроскопа.
- Положите хвост в помеченную трубку, наполненную буфером лиза ДНК 30 мл.
- Быстро поместите эмбрион в трубку, содержащую 100 мкл 4% параформальдегида.
- Этикетка труб с эмбрионами и их соответствующие хвостовые трубки.
- Храните трубки с эмбрионами при 4 градусов по Цельсию на ночь для фиксации.
- Очистите типсы, используя воду Милли-Зи и Кимвипес между каждым эмбрионом, чтобы свести к минимуму загрязнение.
- Для целых эмбрионов:
- Поместите эмбрионы в 0,004% раствор MS-222 (трикаин). Подождите 2 мин.
- Положите 1-5 эмбрионов в трубку, наполненную буфером лиза ДНК 100 мкл. Дехорионация не нужна.
- Для взрослых рыбий плавник клип:
- Пищеварение ДНК
Инкубировать трубки с тканью (плавник или хвост клипы или эмбрионы) при 55 градусов по Цельсию в течение 4 часов до ночи. - Инактивировать протеиназу K
Нагрейте трубки до 95 градусов по Цельсию в течение 15 мин. ДНК следует использовать для ПЦР немедленно, или хранить при температуре -20 градусов по Цельсию в течение 3 месяцев.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
Tricaine | |||
Paraformaldehyde |