Summary
ووضعت جزيرة perifusion ميكروفلويديك الجهاز لتقييم افراز الانسولين من الجزر الحيوية متعددة ومضان التصوير المتزامن لتدفق الكالسيوم والتغيرات المحتملة الميتوكوندريا.
Abstract
ووضعت جزيرة perifusion ميكروفلويديك الجهاز لتقييم افراز الانسولين من الجزر الحيوية متعددة ومضان التصوير المتزامن لتدفق الكالسيوم والتغيرات المحتملة الميتوكوندريا. الجهاز يتكون من ثلاث طبقات : الطبقة الأولى تحتوي على مجموعة من الآبار الميكروسكيل (500 و 150 ميكرومتر قطرها ميكرون العمق) التي تساعد على شل الجزر في حين تتعرض لتدفق وزيادة المساحة المكشوفة من الجزر ، والثاني يحتوي على طبقة دائرية perifusion غرفة (3 ملم العميق ، 7 مم) ، وطبقة ثالثة تحتوي على مدخل القناة لخلط أن المشجعين من قبل حقنها في غرفة perifusion (2 ملم في العرض ، 19 ملم في الطول ، و 500 ميكرومتر في الطول) لتحسين كفاءة خلط قبل دخول غرفة perifusion. إنشاء تدرجات مختلفة بما في ذلك الجلوكوز على شكل جرس الخطية ، والأشكال المربعة ويمكن أيضا أن تنشأ في شبكة perifusion ميكروفلويديك وتظاهر هو.
Protocol
ألف التصنيع الدقيق من 3 طبقات الجهاز perifusion ميكروفلويديك
حسنا أسفل ماجستير البروتوكول (150 ميكرون الآبار العميقة)
- تنظيف الرقاقة باستخدام شفرة حلاقة اذا لزم الامر. نظيفة مع الأسيتون والميثانول ، ومعهد الإدارة العامة. تنفيذ المعاملة البلازما في 50 واط لمدة 30 ثانية.
- تدور SU8 - 100 @ 2000 دورة في الدقيقة. [الخطوة 1 : 500 دورة في الدقيقة ، 10 ثانية و 100 دورة في الدقيقة / ثانية ، الخطوة 2 : 2000 دورة في الدقيقة ، 30 ثانية ، و 300 دورة في الدقيقة / ق].
[ملاحظة : لا تحمل الرقاقة مع ملاقط بعد الغزل SU8] - خبز لينة الرقاقة عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وعند 95 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة.
- يتعرض الرقاقة للأشعة فوق البنفسجية من خلال قناع المطلوب. الجرعة عن 150 ميكرومتر ارتفاع 650 ميغا جول / سم 2.
- بعد التعرض خبز الرقاقة عند 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وعلى 95 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة.
- تطوير رقاقة في SU8 المطور لمدة 15 دقيقة.
بروتوكول متناهية ماجستير (500 ميكرون الآبار العميقة)
- تنظيف الرقاقة باستخدام شفرة حلاقة اذا لزم الامر. نظيفة مع الأسيتون والميثانول ، ومعهد الإدارة العامة. تنفيذ المعاملة البلازما في 50 واط لمدة 30 ثانية.
- تدور SU8 - 2150 @ 1000 دورة في الدقيقة. [الخطوة 1 : 500 دورة في الدقيقة ، 10 ثانية و 100 دورة في الدقيقة / ثانية ، الخطوة 2 : 1000 دورة في الدقيقة ، 30 ثانية ، و 300 دورة في الدقيقة / ق].
- لينة خبز الرقاقة عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وعند 95 درجة. مئوية لمدة 2 ساعة ودقيقة و 30
- يتعرض الرقاقة للأشعة فوق البنفسجية من خلال قناع المطلوب. جرعة التعرض لارتفاع 650 ميكرون هو 685 ميغا جول / سم 2.
- بعد التعرض خبز الرقاقة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وعلى 95 درجة مئوية لمدة 35 دقيقة.
- تطوير رقاقة في SU8 المطور لمدة 20-30 دقيقة.
PDMS حل إعداد
- مستعدة Polydimethylsiloxane (PDMS) حل عن طريق خلط دقيق 10 أجزاء من المطاط الصناعي السيليكون مع 1 جزء من وكيل علاج لعدة Sylgard القياسية 184.
- تتم إزالة فقاعات ولدت في حل PDMS أثناء عملية الخلط باستخدام مجفف فراغ.
- هو الاستغناء ببطء فقاعة خالية حل PDMS على وسادة SU8 طبق بيتري فارغة للطبقة ثالثة.
- يتم تعيين درجة حرارة لوحة الساخن الى 75 درجة مئوية غير مملح وPDMS وعند هذه الدرجة لمدة 2 ساعة
- واللكم مداخل ومنافذ الصرف والآبار خارج باستخدام ثقب الناخس الحجم المناسب.
- مستعبدين طبقات معا على شريحة زجاجية (حجم 0.1 ملم) باستخدام جهاز البلازما المحمولة.
باء الإعداد التجريبي
- تدفق الايثانول 70 ٪ من خلال الجهاز الصغير لتعقيم. DI تدفق المياه لغسل والايثانول. يروي BSA 50 مل من 0.5 ٪ من خلال جهاز لمنع امتصاص الأنسولين غير محددة على الجدران متناهية.
- التدرج المنحدر الجلوكوز والتدرجات الأخرى ذات الصلة التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج LABVIEW الذي يتصل مع المحقنة يتم اختبار المضخات للتأكد من التدرجات مستقرة.
- وحضنت 25-30 الفئران الجزر مع Fura-2/AM ميكرومتر 5 (مؤشر الكالسيوم وتحقيقات الجزيئية ، كاليفورنيا) ، و 2.5 ميكرومتر رودامين 123 (Rh123 ، وهو مؤشر إمكانات الميتوكوندريا ، سيغما ، MO) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في كريبس ، رينغر العازلة (KRB) التي تحتوي على السكر في 2 ملي
- وpipetted بعناية الجزر الفئران في الجهاز perifusion ميكروفلويديك من خلال مدخل الميناء.
- شبكة ميكروفلويديك ثم يتم الإعداد من خلال ربط مدخل إلى مضخات الحقن باستخدام أنابيب Tygon وY - موصل ومنفذا لجمع الكسور. الجهاز يجلس على مرحلة التسخين (37 درجة مئوية) على المجهر ويتم تسخين الأنابيب مدخل على موقد للحفاظ على درجة حرارة الغرفة والحل عند 37 درجة مئوية.
- مباشرة بعد الإعداد ، وperifused الجزر تحتوي على الفئران مع KRB 2 ملي الجلوكوز لمدة 10 دقيقة ثم منحدر الجلوكوز (2mm و25mM) لمدة 25 دقيقة.
- يتم جمع الوقت الفاصل بين الصور وحلل كل ليالي 15 بواسطة برنامج SimplePCI. وتجمع أيضا perifusate كل دقيقة باستخدام جزء من هواة جمع وتحليل افراز الانسولين باستخدام ELISA عدة.
ممثل النتائج
وكانت الجزر perifused الفأر مع الانحدار الخطي للجلوكوز ملي 25/02. كما هو مبين في الشكل 1 ، وأثار تدفق الكالسيوم وإفراز الأنسولين بعد حوالي 13 دقيقة من perifusion الموافق الجلوكوز 6 ملم. وتعتبر التغيرات في إمكانات الميتوكوندريا في وقت سابق كما هو متوقع ، في حوالي 11 دقيقة. هذه البيانات يدل على الاستفادة من استخدام هذه الشبكة لتوصيف ميكروفلويديك جزيرة الفيزيولوجيا.
الشكل 1. الاستجابات الفسيولوجية للجزيرة تحفيز الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النظم التقليدية perifusion جزيرة (macroscale والميكروسكيل) بعض القيود المعقدة بما في ذلك الإعداد والتصميم ، والمتطلبات التقنية العالية ، وصعوبة إنشاء المستخدم التدرجات الكيميائية المنصوص عليها في النظام. نظام perifusion ميكروفلويديك الموصوفة هنا يتغلب على هذه القيود مع هندسة بسيطة للتصميم والتصنيع. أكثر أهمية ، ويمكن أن تكون متكاملة مع نهج هذا النظام التصوير مضان التي توفر أداة فريدة لدراسة جزيرة الفيزيولوجيا. تظاهر النظام مع نسبة الإشارة ضوضاء عالية والمكانية والزمانية القرار من هذه الإشارات مضان. النموذج الأولي للجهاز الحالي كما يمكن أن تعقد الاجهزة perifusion متعددة في رقاقة واحدة ، وتقديم أنواع مختلفة من microenvironments لأغراض تطبيق على نطاق واسع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل الجمعية الأميركية للجامعيات الزمالة الدولية لAdewola اديولا ، NIH / NCRR (U42RR023245) لخوسيه أوبرهولزر ، ومشروع السكري شيكاغو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60ml Syringes | BD Biosciences | ||
| Fura-2 fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine123 Fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30" Silicone tubings | Cole-Parmer | 1/16 x 1/8in | |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16” & 4mm | |
| Syringe connectors | Cole-Parmer | female luer plug 1/16” | |
| Straight connectors | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Elbow connector | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Havard syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Perifusion device | |||
| Hot plate | PMC | ||
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Fraction collector | Gibson | ||
| Pippettor | Fisher Scientific | ||
| Inverted epiflorescence microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Charge-coupled device | QImaging | Retiga-SRV, Fast 1394 |
References
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
