Summary
一个微流体胰岛perifusion装置，开发了多个小岛和钙离子内流和线粒体的潜在变化的同步荧光成像的动态胰岛素分泌的评估。
Abstract
一个微流体胰岛perifusion装置，开发了多个小岛和钙离子内流和线粒体的潜在变化的同步荧光成像的动态胰岛素分泌的评估。该装置由三个层次：第一层包含一个微型井（直径为500微米和150微米的深度），帮助固定的小岛，而暴露流量和胰岛暴露的表面积最大化的数组，第二层包含循环perifusion室（3毫米深，直径7毫米）;和第三层包含一个入口，混合通道，球迷前注入perifusion室（2毫米宽，19毫米的长度，高度在500微米）优化混合效率之前进入perifusion室。创造各种糖梯度，包括线性，钟形，方形，也可以在微流体perifusion网络，是证明。
Protocol
A. 3层的微流体perifusion装置微细
底部井主协议（150微米深水井）
- 如果需要使用刀片清洁晶圆。与丙酮，甲醇，异丙醇清洁。执行为30秒50瓦的血浆治疗
- 自旋SU8 - 100 @ 2000转。 [步骤1：500 RPM，10秒，100转/秒，第2步：2000转，30秒，300转/ S]。
[注：不与晶圆镊子后纺SU8] - 软烤晶圆在65 ° C为20分钟和95 ° C为50分钟。
- 晶圆被暴露在紫外线下，通过所需的面具。剂量为150微米的高度是650兆焦耳/ 厘米 2 。
- 暴露后烤晶圆65 ° C为1分，在95 ° C为12分钟。
- 发展在15分钟的SU8开发晶圆。
微通道主协议（500微米深井）
- 如果需要使用刀片清洁晶圆。与丙酮，甲醇，异丙醇清洁。执行为30秒50瓦的血浆治疗
- 自旋SU8 - 2150 @ 1000转。 [步骤1：500 RPM，10秒，100转/秒，第2步：1000转，30秒，300转/ S]。
- 软烤晶圆在65℃，15分钟和95 ° C时2小时30分钟。
- 晶圆被暴露在紫外线下，通过所需的面具。曝光剂量为650微米的高度是685兆焦耳/厘米2。
- 暴露后烤晶圆65 ° C为5分钟，在95 ° C为35分钟。
- 发展在20-30分钟的SU8开发晶圆。
PDMS的解决方案的准备
- 聚二甲基硅氧烷（PDMS）的解决方案是准备彻底搅拌10部分有机硅弹性体与1固化剂的标准Sylgard 184套件的一部分。
- 使用真空干燥器，在PDMS的解决方案，在搅拌过程中产生的气泡被删除。
- 无气泡的PDMS的解决方案是慢慢地配发到SU8船长和一个空的第三层的Petri菜。
- 热板的温度设定到75 ° C，2小时，在此温度下固化的PDMS
- 入口，出口和汇率井出使用适当大小的打孔器打孔。
- 这些层粘合在一起，在玻片上，用一个手持血浆设备（尺寸0.1毫米）。
B.实验装置
- 通过微设备的流量70％乙醇消毒。流量DI水，洗出的乙醇。灌注50毫升0.5％BSA，通过设备，以防止胰岛素的非特异性吸附微墙壁。
- 葡萄糖坡道梯度和LabVIEW软件，通信用的注射器泵测试，以确保梯度稳定所产生的其他相关梯度。
- 25-30小鼠胰岛共孵育5微米Fura-2/AM（钙指标，分子探针，CA），在37℃30分钟的2.5微米罗丹明123（Rh123的，线粒体的潜力指标，Sigma公司，MO）克雷布斯的林格氏缓冲液（KRB）含有2毫米葡萄糖
- 小鼠胰岛仔细吸管到微流体perifusion装置，通过进气口。
- 微流体网络，然后通过注射泵使用聚乙烯管和一个Y型连接器和馏分收集器的电源插座连接的入口设置。该设备坐落在加热阶段（37℃），在显微镜的进油管上烤盘加热室和解决方案的温度保持在37 ° C。
- 安装后，立即小鼠胰岛perifused KRB包含10分钟，然后葡萄糖坡道为25分钟（2MM 25MM）2毫米葡萄糖。
- 定时图像收集和分析SimplePCI软件每15秒。 perifusate是收集每分钟使用馏分收集，分析胰岛素的分泌，使用试剂盒。
代表性的成果
小鼠胰岛perifused 2-25葡萄糖的线性渐变。正如图1所示，钙离子内流和胰岛素分泌被触发后约13分钟的perifusion，对应到6毫米葡萄糖。线粒体电位的变化早些时候预计，在约11分钟。这一数据表明，使用这种微流体网络的优势，胰岛生理特征。
图1。胰岛细胞刺激的生理反应。
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Discussion
传统的胰岛perifusion系统（宏观和微观）有一定的限制设置和设计，技术要求高，难度在系统中创建的用户指定的化学梯度的复杂。这里描述的微流体perifusion系统克服了这些限制，简单的几何设计和制造。更重要的是，这个系统可以集成与荧光成像方法，提供一个独特的工具来研究胰岛生理。证明该系统具有高信噪比和这些荧光信号的时空分辨率。目前的原型设备，也可以在一个芯片上容纳多个perifusion设置，并提供广泛应用的目的不同类型的微环境。
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Acknowledgments
这项工作得到了国际奖学金AAUW Adeola Adewola，美国国立卫生研究院/何塞Oberholzer NCRR（U42RR023245），和芝加哥糖尿病项目。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60ml Syringes | BD Biosciences | ||
| Fura-2 fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine123 Fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30" Silicone tubings | Cole-Parmer | 1/16 x 1/8in | |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16” & 4mm | |
| Syringe connectors | Cole-Parmer | female luer plug 1/16” | |
| Straight connectors | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Elbow connector | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Havard syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Perifusion device | |||
| Hot plate | PMC | ||
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Fraction collector | Gibson | ||
| Pippettor | Fisher Scientific | ||
| Inverted epiflorescence microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Charge-coupled device | QImaging | Retiga-SRV, Fast 1394 |
References
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
