Summary
Ein mikrofluidischen Insel perifusion Gerät wurde für die Beurteilung der Dynamik der Insulinsekretion von mehreren Inselchen und gleichzeitige Fluoreszenz-Imaging von Calcium-Einstrom und die mitochondriale möglichen Veränderungen entwickelt.
Abstract
Ein mikrofluidischen Insel perifusion Gerät wurde für die Beurteilung der Dynamik der Insulinsekretion von mehreren Inselchen und gleichzeitige Fluoreszenz-Imaging von Calcium-Einstrom und die mitochondriale möglichen Veränderungen entwickelt. Das Gerät besteht aus drei Schichten: erste Schicht enthält eine Reihe von mikro-Brunnen (500 Mikrometer Durchmesser und 150 um Tiefe), die zu den Inseln zu immobilisieren, während ausgesetzt zu fließen und maximieren die exponierte Fläche der Inseln zu helfen, die zweite Schicht enthält eine kreisförmige perifusion Kammer (3 mm tief, 7 mm Durchmesser), und die dritte Schicht enthält einen Einlass-Mischkanal, dass die Fans vor der Injektion in die perifusion Kammer (2 mm in der Breite, 19 mm in der Länge und 500 pm in der Höhe) zur Optimierung der die Mischwirkung vor dem Eintritt in die perifusion Kammer. Die Schaffung verschiedener Glukose Gradienten mit einem linear, Glockenform, und quadratischen Formen können auch in der mikrofluidischen perifusion Netzwerk geschaffen werden, und demonstriert.
Protocol
A. Microfabrication der 3-Schicht-mikrofluidischen perifusion Gerät
Bottom Well-Master Protokoll (150 um Tiefbrunnen)
- Reinigen Sie die Scheibe mit einer Rasierklinge, wenn nötig. Reinigung mit Aceton, Methanol und IPA. Führen Plasmabehandlung bei 50 Watt für 30 s.
- Spin SU8-100 @ 2000 rpm. [Schritt 1: 500 min, 10 s, 100 rpm / s, Schritt 2: 2000 rpm, 30 s, 300 rpm / s].
[Hinweis: Halten Sie nicht die Wafer mit einer Pinzette nach dem Schleudern SU8] - Softbake der Wafer bei 65 ° C für 20 min und bei 95 ° C für 50 min.
- Der Wafer wird mit UV-Licht durch eine gewünschte Maske belichtet. Dose für 150 pm beträgt 650 mJ / cm 2.
- Post Exposure Bake der Wafer bei 65 ° C für 1 min und bei 95 ° C für 12 min.
- Entwickeln Sie die Wafer in SU8 Entwickler für 15 min.
Microchannel Master Protokoll (500 um Tiefbrunnen)
- Reinigen Sie die Scheibe mit einer Rasierklinge, wenn nötig. Reinigung mit Aceton, Methanol und IPA. Führen Plasmabehandlung bei 50 Watt für 30 s.
- Spin SU8-2150 @ 1000 Umdrehungen pro Minute. [Schritt 1: 500 min, 10 s, 100 rpm / s, Schritt 2: 1000 rpm, 30 s, 300 rpm / s].
- Softbake der Wafer bei 65 ° C für 15 min und bei 95 ° C für 2 Stunden und 30 min.
- Der Wafer wird mit UV-Licht durch eine gewünschte Maske belichtet. Belichtungsdosis für 650 um Höhe beträgt 685 mJ / cm 2.
- Post Exposure Bake der Wafer bei 65 ° C für 5 min und bei 95 ° C für 35 min.
- Entwickeln Sie die Wafer in SU8 Entwickler für 20-30 min.
PDMS-Aufbereitung
- Polydimethylsiloxan (PDMS)-Lösung wird durch gründliches Mischen 10 Teile aus Silikon-Elastomer mit 1 Teil Härter eines Standard Sylgard 184 Kit vorbereitet.
- Die Blasen in der PDMS-Lösung beim Mischen erzeugt werden entfernt mit einem Vakuum-Exsikkator.
- Die blasenfreie PDMS Lösung wird langsam auf die SU8 Meister und eine leere Petrischale für die dritte Schicht verzichtet.
- Die Temperatur der Heizplatte auf 75 ° C eingestellt ist und der PDMS ist bei dieser Temperatur für 2 Stunden ausgehärtet
- Ein-und Auslässen und den Austausch Brunnen werden mit der entsprechenden Größe Locher gestanzt.
- Die Schichten werden auf einem Glasträger (Größe 0,1 mm) mit einem Handheld-Plasma-Gerät verbunden.
B. Versuchsaufbau
- Durchfluss 70% igem Ethanol durch die Mikro-Gerät zu sterilisieren. Flow-DI-Wasser zum Auswaschen der Ethanol. Perfundieren 50 ml von 0,5% BSA durch das Gerät, um unspezifische Adsorption von Insulin an den Mikrokanal Wänden zu verhindern.
- Die Glucose Rampensteilheit und andere damit zusammenhängende Gradienten von LabView-Software, mit der Spritze Pumpen getestet, um sicherzustellen, dass die Gradienten sind stabil sind kommuniziert.
- 25-30 Mäusen Inseln wurden mit 5 uM Fura-2/AM (ein Kalzium-Indikator, Molecular Probes, CA) und 2,5 uM Rhodamin 123 (Rh123, eine mitochondriale Potenziale Indikator, Sigma, MO) für 30 min bei 37 ° C in inkubiert Krebs-Ringer-Puffer (KRB), enthaltend 2 mM Glucose
- Die Mäuse Inseln sind sorgfältig in mikrofluidischen perifusion Gerät durch die Einlassöffnung pipettiert.
- Die Mikrofluidik-Netzwerk wird dann durch Anschließen der Einmündung in den Spritzenpumpen mit Tygon-Schlauch und ein Y-Stecker und die Steckdose zu Fraktionssammler. Das Gerät sitzt auf einem Heiztisch (37 ° C) auf dem Mikroskop und den Zulaufschlauch ist auf einer Heizplatte erhitzt, um die Temperatur der Kammer und die Lösung bei 37 ° C zu halten
- Unmittelbar nach der Installation werden die Mäuse Inselchen mit KRB mit 2 mM Glukose für 10 min und dann eine Glucose-Rampe (2mm 25mm) für 25 min perifused.
- Zeitraffer-Bilder werden gesammelt und alle 15 s analysiert SimplePCI Software. Die perifusate ist auch jede Minute mit einem Fraktionssammler der Insulin-Sekretion mittels ELISA-Kit analysieren gesammelt.
Repräsentative Ergebnisse
Maus Inseln wurden mit einem linearen Gradienten von 2-25 mM Glucose perifused. Wie in Abbildung 1 gezeigt, sind Calcium-Einstrom und die Insulinsekretion nach etwa 13 Minuten von perifusion, entsprechend 6 mM Glukose ausgelöst. Änderungen in der mitochondrialen Potentiale sind früher als erwartet, etwa 11 Minuten gesehen. Diese Daten zeigen, der Vorteil der Verwendung dieser mikrofluidischen Netzwerk Insel Physiologie zu charakterisieren.
Abbildung 1. Physiologische Reaktionen auf Zell-Stimulation Insel.
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Discussion
Traditionelle Insel perifusion Systeme (makroskopischen und mikro-) einige Einschränkungen, einschließlich komplexer der Einrichtung und Design, hohe technische Anforderungen und Schwierigkeiten, benutzerdefinierte vorgeschriebenen chemischen Gradienten in das System zu erstellen. Die mikrofluidischen perifusion hier beschriebene System überwindet diese Einschränkungen mit einfachen Geometrie der Konstruktion und Fertigung. Noch wichtiger ist, kann dieses System mit Fluoreszenz-Imaging-Ansatz, die als ein einzigartiges Tool zur Insel Physiologie Studie liefern integriert werden. Das System mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis und räumlich-zeitliche Auflösung dieser Fluoreszenz-Signale nachgewiesen. Der aktuelle Prototyp Gerät können auch mehrere perifusion Setups in einem Chip zu halten und verschiedene Arten von Mikroumgebungen für eine breite Anwendung Zwecke.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von AAUW internationalen Gemeinschaft zu Adeola Adewola, NIH / NCRR (U42RR023245) zu Jose Oberholzer, und die Chicago Diabetes-Projekt unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60ml Syringes | BD Biosciences | ||
| Fura-2 fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine123 Fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30" Silicone tubings | Cole-Parmer | 1/16 x 1/8in | |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16” & 4mm | |
| Syringe connectors | Cole-Parmer | female luer plug 1/16” | |
| Straight connectors | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Elbow connector | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Havard syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Perifusion device | |||
| Hot plate | PMC | ||
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Fraction collector | Gibson | ||
| Pippettor | Fisher Scientific | ||
| Inverted epiflorescence microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Charge-coupled device | QImaging | Retiga-SRV, Fast 1394 |
References
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
