Summary
Een microfluïdische eilandje perifusion apparaat werd ontwikkeld voor de beoordeling van dynamische insuline secretie van verschillende eilandjes en gelijktijdige fluorescentie beeldvorming van calcium influx en mitochondriale potentiële veranderingen.
Abstract
Een microfluïdische eilandje perifusion apparaat werd ontwikkeld voor de beoordeling van dynamische insuline secretie van verschillende eilandjes en gelijktijdige fluorescentie beeldvorming van calcium influx en mitochondriale potentiële veranderingen. Het apparaat bestaat uit drie lagen: eerste laag bevat een array van microschaal putten (500 micrometer diameter en 150 micrometer diepte) die helpen om de eilandjes te immobiliseren, terwijl blootgesteld te stromen en het maximaliseren van het blootgestelde oppervlak van de eilandjes, de tweede laag bevat een cirkelvormige perifusion kamer (3 mm diep, 7 mm diameter), en de derde laag bevat een inlaat-mixing kanaal dat fans voor injectie in de perifusion kamer (2 mm in de breedte, 19 mm in lengte en 500 micrometer lengte) voor het optimaliseren van het mengen efficiency voorafgaand aan het invoeren van de perifusion kamer. De oprichting van verschillende glucose gradiënten waaronder een lineaire, klokvorm, en vierkante vormen kunnen ook worden gecreëerd in de microfluïdische perifusion netwerk en is aangetoond.
Protocol
A. microfabricage van 3-laags microfluïdische perifusion apparaat
Bottom Well Master Protocol (150 um diepe putten)
- Reinig de wafer met behulp van een scheermesje, indien nodig. Reinigen met aceton, methanol, en het IPA. Voer plasma behandeling bij 50 Watt voor 30 s.
- Spin SU8-100 @ 2000 tpm. [Stap 1: 500 rpm, 10 s, 100 rpm / s, Stap 2: 2000 rpm, 30 s, 300 rpm / s].
[NB: doen de wafer niet vast met een pincet na het spinnen SU8] - Zachte bak de wafer bij 65 ° C gedurende 20 min en bij 95 ° C gedurende 50 minuten.
- De wafer wordt blootgesteld aan UV-licht door middel van een gewenste masker. Dosis voor 150 micrometer lengte is 650 mJ / cm 2.
- Na blootstelling bak de wafer bij 65 ° C gedurende 1 minuut en bij 95 ° C gedurende 12 minuten.
- Ontwikkel de wafer in SU8 ontwikkelaar gedurende 15 minuten.
Microkanaal Master Protocol (500 micrometer diepe putten)
- Reinig de wafer met behulp van een scheermesje, indien nodig. Reinigen met aceton, methanol, en het IPA. Voer plasma behandeling bij 50 Watt voor 30 s.
- Spin SU8-2150 @ 1000 tpm. [Stap 1: 500 rpm, 10 s, 100 rpm / s, Stap 2: 1000 rpm, 30 s, 300 rpm / s].
- Zachte bak de wafer bij 65 ° C gedurende 15 min en bij 95 ° C gedurende 2 uur en 30 minuten.
- De wafer wordt blootgesteld aan UV-licht door middel van een gewenste masker. Blootstelling dosis voor 650 micrometer lengte is 685 mJ / cm 2.
- Na blootstelling bak de wafer bij 65 ° C gedurende 5 minuten en bij 95 ° C gedurende 35 minuten.
- Ontwikkel de wafer in SU8 ontwikkelaar gedurende 20-30 minuten.
PDMS-oplossing voorbereiding
- Polydimethylsiloxaan (PDMS) oplossing wordt bereid door grondig te mengen 10 delen van silicone elastomeer met 1 deel verharder van een standaard Sylgard 184 kit.
- De belletjes gegenereerd in de PDMS oplossing tijdens het mengproces worden verwijderd met behulp van een vacuümexsiccator.
- De bel-vrije PDMS oplossing wordt langzaam afgegeven op de SU8 meesters en een lege petrischaal voor de derde laag.
- De temperatuur van de hete plaat is ingesteld op 75 ° C en de PDMS is uitgehard bij deze temperatuur gedurende 2 uur
- Inlaten, stopcontacten en uitwisseling putten worden geslagen met behulp van de juiste maat perforator.
- De lagen worden met elkaar verbonden op een glasplaatje (grootte 0,1 mm) met behulp van een handheld plasma-apparaat.
B. Experimentele opstelling
- Flow 70% ethanol door middel van de micro-apparaat te steriliseren. Flow DI-water te wassen uit de ethanol. Perfuseren 50 ml van 0,5% BSA door het apparaat aan op niet-specifieke adsorptie van insuline te voorkomen dat de microkanaal muren.
- De glucose ramp gradiënt en andere gradiënten gegenereerd door LabView software die communiceert met de spuit pompen zijn getest om te controleren of de hellingen stabiel zijn.
- 25-30 muizen eilandjes werden geïncubeerd met 5 uM Fura-2/AM (een calcium-indicator, Molecular Probes, CA) en 2,5 uM Rhodamine 123 (Rh123, een mitochondriale potentials indicator, Sigma, MO) gedurende 30 minuten bij 37 ° C in Krebs-Ringer buffer (KRB) dat 2 mM glucose
- De muizen eilandjes zijn zorgvuldig gepipetteerd in microfluïdische perifusion apparaat via de inlaat-poort.
- De microfluïdische netwerk wordt dan ingesteld door het aansluiten van de inlaat naar de spuit pompen met behulp van Tygon slang en een Y-connector en het stopcontact om fractie verzamelaar. Het apparaat zit op een verwarmings-fase (37 ° C) op de microscoop en de inlaat buis wordt verwarmd op een kookplaat om de temperatuur van de kamer en de oplossing te houden bij 37 ° C.
- Onmiddellijk na de installatie, zijn de muizen eilandjes perifused met KRB met 2 mM glucose gedurende 10 minuten en daarna een glucose-ramp (2 mm 25 mm) voor 25 minuten.
- Time-lapse beelden worden verzameld en geanalyseerd om de 15 s door SimplePCI software. Het perifusate is ook verzameld elke minuut met behulp van een fractie collector aan de insuline secretie met behulp van ELISA kit te analyseren.
Representatieve resultaten
Muis eilandjes werden perifused met een lineaire gradiënt van 2-25 mM glucose. Zoals weergegeven in figuur 1, zijn calcium influx en afgifte van insuline die ontstonden na ongeveer 13 minuten van perifusion, wat overeenkomt met 6 mM glucose. Veranderingen in Mitochondriale mogelijkheden zijn eerder als verwacht gezien, op ongeveer 11 minuten. Deze data toont het voordeel van het gebruik van deze microfluïdische netwerk eilandje fysiologie karakteriseren.
Figuur 1. Fysiologische reacties op cel stimulatie eilandje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Traditionele eilandje perifusion systemen (macroschaal en microschaal) hebben een aantal beperkingen, met inbegrip complex van opzet en ontwerp, een hoge technische eisen, en de moeite om door de gebruiker voorgeschreven chemische gradiënten te creëren in het systeem. De microfluïdische perifusion systeem hier beschreven overwint deze beperkingen met eenvoudige geometrie van ontwerp en fabricage. Nog belangrijker, kan dit systeem worden geïntegreerd met fluorescentie imaging benadering bepalen dat als een uniek instrument om eilandje fysiologie te bestuderen. Het systeem gedemonstreerd met een hoge signaal-ruisverhouding en ruimtelijk-temporele resolutie van deze fluorescentie-signalen. Het huidige prototype toestel ook kan vasthouden meerdere perifusion opstellingen in een chip en bieden verschillende soorten micro-omgevingen voor grootschalige toepassing doeleinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door AAUW internationale gemeenschap om Adeola Adewola, NIH / NCRR (U42RR023245) naar Jose Oberholzer, en The Chicago Diabetes Project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60ml Syringes | BD Biosciences | ||
| Fura-2 fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine123 Fluorescence dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30" Silicone tubings | Cole-Parmer | 1/16 x 1/8in | |
| 1.5ml Eppendorf tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16” & 4mm | |
| Syringe connectors | Cole-Parmer | female luer plug 1/16” | |
| Straight connectors | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Elbow connector | Cole-Parmer | 1/16” | |
| Havard syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Perifusion device | |||
| Hot plate | PMC | ||
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Fraction collector | Gibson | ||
| Pippettor | Fisher Scientific | ||
| Inverted epiflorescence microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Charge-coupled device | QImaging | Retiga-SRV, Fast 1394 |
References
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
