在干细胞移植在体外模拟缺血/再灌注模型

Summary

我们演示了如何建立一个

Abstract

干细胞移植协议是^1,2,3到临床实践发现他们的方式。获得更好的效果，使协议更强大，并寻找新植入的细胞来源，是在最近的^研究 4,5的重点。调查的细胞疗法的有效性是不是一件容易的事，需要新的工具，以探讨在治疗过程中所涉及^的机制6。我们设计了一个缺血/再灌注损伤的实验协议，以便在缺血/再灌注损伤，干细胞移植后的细胞连接，甚至亚细胞机制的观察和评估细胞疗法的疗效。 H9C2 cardiomyoblast细胞被放置到细胞培养板^7,8。缺血葡萄糖与氧气低于0.5％的水平的培养基中150分钟的模拟。然后，正常的媒体和氧含量重新模拟再灌注。氧糖剥夺后，加入他们的文化派生的标记的人骨间质干细胞骨髓移植治疗受损的细胞。在临床试验中的首选，因为它们是方便，微创手术，易于扩展和自体骨髓间质干细胞。共培养24小时后，细胞染色与钙黄绿素和乙锭-二聚体区分活细胞和死细胞。此设置允许我们调查的使用共焦荧光显微镜间的连接和量化缺血细胞流式细胞仪的存活率。共聚焦显微镜显示，如细胞融合和间碳纳米管形成的两个细胞群的相互作用。流式细胞仪分析显示，3受损的细胞，可以绘制在图表上，并进行统计学分析集群。这些人群可以单独进行调查，并根据这些数据得出的结论可以在模拟的有效性的治疗方法。

Protocol

1。准备H9C2细胞cardiomyoblast

H9C2大鼠cardiomyoblasts取自ATCC（德国Wesel的，）和扩展的DMEM含10％胎牛血清，4毫米L -谷氨酰胺，100 U / ml青霉素和100μg/ mL链霉素的高糖（4.5克/升）。 H9C2成肌细胞线是从胚胎大鼠心脏产生的，它是用来作为一个^在 8,9两个骨骼肌和心肌的体外模型。

准备H9C2细胞的12孔板：

1. 删除的Petri菜H9C2细胞培养液中。
2. 两次2-3毫升0.05％胰蛋白酶/ EDTA清洗用5 ml PBS和消化细胞。
3. 将培养皿在37℃培养箱中培养5分钟。
4. 用10 ml DMEM培养液抑制胰蛋白酶。
5. 在8分钟1200转离心细胞。
6. 取出后在1毫升的DMEM培养液和使用台盼蓝染色血球计数细胞上清，重悬细胞。
7. 种子30000 H9C2细胞在DMEM培养液2毫升，每孔在12孔板。
8. 24小时，放入_37℃二氧化碳培养箱板。

2。模拟缺血/再灌注

缺血/再灌注是在体外模拟执行H9C2细胞培养氧糖剥夺（OGD）。此过程是PeCon细胞的孵化体系，使观察细胞在OGD（德国Erbach，）蔡司共聚焦显微镜的阶段。

1. 卸下H9C2细胞的12孔板的愿望语言。
2. 用PBS洗涤细胞两次。
3. 加入3毫升葡萄糖培养基，每孔。
4. 将进入细胞孵育系统板。
5. 启动氮气吹扫孵化体系的氧气。
6. 等待，直到氧气水平达到0.5％，然后开始计时。 0.5％的氧气是指局部紧张约3毫米汞柱。除细胞为1模拟缺血50分钟。
7. 模拟缺血结束，从细胞中移除的葡萄糖培养基。
8. 加入2毫升正常培养基井。
9. 放置30分钟，在_37℃二氧化碳培养箱12孔板，这是“再灌注期” 。

3。准备抢救间质干细胞

人类起源的骨髓是采取到T75烧瓶和贝科的修改鹰的中等（DMEM）文化介质含10％胎牛血清（FCS），100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素，4 mM的大号-谷氨酰胺和稀释1 g / L葡萄糖。在37 ° C孵育烧瓶，在充分湿润的5％的_CO 2，连续3天的气氛。用PBS洗涤后的潜伏期坚持瓶和骨髓其余的组件表面的骨髓基质干细胞被淘汰。用骨髓基质干细胞在实验1和5之间的通道。该IDENtity细胞被证实存在系特异性的细胞表面标志物，用流式细胞仪。造血行数的特异性表面标志（CD34，CD45）和间质的表面标志物（CD73，CD90，C​​D105和CD166）进行了调查。

在模拟缺血，准备抢救间质干细胞移植。

1. Vybrant在1:200比例的DMEM培养液稀释荧光染料。
2. 吸救援细胞的培养基，添加300μL的DMEM与Vybrant。
3. 将培养皿在37℃ _二氧化碳培养箱30分钟。
4. 删除的Petri盘间质干细胞的培养基中。
5. 两次2-3毫升0.05％胰蛋白酶/ EDTA清洗用5 ml PBS和消化细胞。
6. 将培养皿在37℃培养箱中培养5分钟。
7. 用10 ml DMEM培养液抑制胰蛋白酶。
8. 在8分钟1200转离心细胞。
9. 取出后的SUPErnatant 1毫升的DMEM培养液和使用台盼蓝染色血球计数细胞，悬浮细胞。
10. 30分钟，再灌注结束后增加20000间质干细胞，每孔缺血心脏肌细胞H9C2。
11. 共培养的细胞放入37℃ _二氧化碳培养箱24小时。

4。共聚焦显微镜分析

模拟缺血/再灌注损伤后，细胞在24小时正常培养基培养。

1. 24小时后，用PBS洗涤细胞两次。
2. 500μL活/死30分钟（5纳米钙黄绿素和400 nm乙锭- 2 -二聚体在PBS）的染料溶液^（5X10 4细胞/毫升）染色细胞。

评价选定的生活和死亡的细胞形态和荧光共聚焦图像可以执行与ImageJ软件（国立卫生研究院，美国）。在CO型文化，MSCS可区别于H9C2细胞，由于其Vybrant细胞标记。评估的死细胞比例可在4个独立的领域的观点（客观10X）为每一种文化在盲目的^时尚 10 。

42毫米的盖玻片培养的H9C2 cardiomyoblasts也可以与时间的推移视频显微镜进行调查期间和之后，缺血/再灌注损伤，使用共聚焦显微镜观察细胞孵化体系。随着时间的推移，可以研究细胞与细胞之间的相互作用，如细胞融合，形成间碳纳米管。

5。用流式细胞仪分析

模拟缺血/再灌注损伤后，细胞在24小时正常培养基培养。

1. 24小时后，收获的培养基。这是收集培养液中也非常重要，因为一些死细胞可以从培养皿表面分离，在24小时incubaTION。
2. 两次洗净，用PBS和消化细胞，用0.05％胰酶EDTA。
3. 抑制胰蛋白酶，DMEM培养液。
4. 降速1200 RPM（约150 - 200G）的细胞和收获的培养基为8分钟。
5. 弃上清。
6. 暂停500μL的活/死30分钟（5纳米钙黄绿素和400 nm乙锭- 2 -二聚体在PBS）的染料溶液^（5X10 4细胞/毫升）细胞。
7. 转移细胞，流式细胞仪检测管。
8. 启动CellQuest Pro软件。
9. 要成立流式细胞仪进行测量，准备控制活细胞和死细胞样本。
   1. 在第1点所述板H9C2细胞在12孔板密度3x10 ^4。
   2. 准备生活与单trypsinisation细胞控制，如第1点所述。
   3. 1小时10微米H _{2 O 2}处理准备死细胞控制。
   4. 后trypsinisation，resuspenð活的和死细胞控制在500μL活/死染料溶液（5纳米钙黄绿素- AM和400 nm乙锭-二聚体在PBS - 2）。
10. 使活细胞钙黄绿素的积极和乙锭二聚体负，而死亡细胞钙黄绿素负和乙锭二聚体积极的，应调整仪器设置。
11. 图表和统计分析的酒吧可以在这些值可表示这些人口的百分比。
12. 测量不同的实验组。

6。代表性的成果：

我们的研究结果表明，添加间质干细胞能改善缺血心肌细胞的生存。共聚焦显微镜图像显示，直接的细胞与细胞之间的相互作用，如部分膜连接或间碳纳米管，这可能发挥了重要作用^，在观察的保护10。这些纳米管跨越几个细胞D的距离iameters，其直径是200至500纳米（白色箭头）。

图1。碳纳米管形成细胞之间。Vybrant DIO标记cardiomyoblasts Vybrant没有标记的骨髓基质干细胞之间的碳纳米管形成（白色箭头）。

流式细胞仪分析表明尚存的人口和坏死cardiomyoblasts和间质干细胞。有趣的是，我们也观察到了第三，“受伤”cardiomyoblast的细胞群，其中包含钙黄绿素，但也包含指标的死细胞，乙锭二聚体（图2）。

图2。代表点情节模拟缺血后不同的细胞群 。

SHO多次实验的评价周三，除了间质干细胞缺血H9C2 cardiomyoblast增加显著的活细胞的比例相比，单独培养缺血后心脏肌细胞（图3）。

图3。相比，控制（控制与红外模型：90.36 ± 2.60比10.52 ± 0.48，*** P> 0.001）模拟缺血后，除了增加后，干细胞治疗缺血cardiomyoblasts对活细胞的百分比显着减少间质干细胞（红外模型与红外+骨髓基质细胞：10.52 ± 0.48与25.21 ± 2.13，*** P> 0.001）。数据代表平均值± SEM。统计数据进行了分析，Tukey多重比较事后检验采用单向方差分析。

Discussion

证明协议是在体外培养的方法干细胞治疗心肌梗死，这种模式的优点和缺点，更复杂的问题。显然，这不能反映复杂的（如免疫）期间和之后，心肌梗死发生的事件，但可以集中精力对缺血细胞的补充细胞的直接影响。 H9C2 cardiomyoblasts模拟缺血的影响，高度依赖OGD时间，通过对所使用的细胞_数量和O 2浓度。一是必须准确地调整这些参数，并发现某些细胞类型的最佳条件，才能有一个标准化的协议。此后，该协议可以用在许多方面（肾，肝或脑缺血/再灌注^{11,12,13,14），}以探讨不同类型的细胞，如胚胎干细胞，诱导多能干细胞或成体干细胞的影响^15，电子ffectiveness的条件培养基¹⁶或各种预处理^17,18或任何利益的重点参数。