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Medicine

एक में स्टेम सेल प्रत्यारोपण इन विट्रो में नकली मॉडल / Ischemia reperfusion

Published: November 5, 2011 doi: 10.3791/3575
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Human Physiology and Clinical Experimental Research, Semmelweis University

Summary

हम कैसे एक सेट करने के लिए प्रदर्शित

Abstract

स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल नैदानिक ​​अभ्यास 1,2,3 में उनके रास्ते खोज रहे हैं . हाल ही में 4,5 अनुसंधान के बेहतर परिणाम हो रही है, प्रोटोकॉल और अधिक मजबूत बनाने, और implantable कोशिकाओं के लिए नए स्रोत खोजने ध्यान केंद्रित कर रहे हैं. सेल उपचार की प्रभावशीलता की जांच के लिए एक आसान काम नहीं है और नए उपकरणों उपचार प्रक्रिया 6 में शामिल तंत्र की जांच की जरूरत है. हम ischemia / reperfusion की एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल डिजाइन क्रम में ischemia / reperfusion की चोट के दौरान स्टेम सेल प्रत्यारोपण के बाद सेलुलर और कनेक्शन भी subcellular तंत्र का अवलोकन और सेल थेरेपी की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने की अनुमति है. H9c2 cardiomyoblast कोशिकाओं सेल संस्कृति प्लेटों 7,8 पर रखा गया. Ischemia ऑक्सीजन का स्तर 0.5% से नीचे के साथ एक ग्लूकोज मुक्त माध्यम में 150 मिनट के साथ सिम्युलेटेड था. फिर, सामान्य मीडिया और ऑक्सीजन के स्तर reperfusion के अनुकरण के लिए पुनः शुरू किया गया. ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव के बाद,क्षतिग्रस्त कोशिकाओं लेबल उन्हें संस्कृति को जोड़ने के द्वारा mesenchymal स्टेम सेल व्युत्पन्न मानव अस्थि मज्जा का प्रत्यारोपण के साथ इलाज किया गया. Mesenchymal स्टेम कोशिकाओं नैदानिक ​​परीक्षणों में पसंद कर रहे हैं क्योंकि वे न्यूनतम इनवेसिव सर्जरी के साथ आसानी से सुलभ, आसानी से विस्तार योग्य और ऑटोलॉगस हैं. सह खेती के 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं calcein और ethidium-homodimer रहते हैं और मृत कोशिकाओं के बीच अंतर के साथ दाग थे. इस सेटअप हमें कहनेवाला confocal माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट का उपयोग कनेक्शन की जांच करने के लिए और प्रवाह cytometry द्वारा postischemic कोशिकाओं के अस्तित्व की दर यों की अनुमति दी. Confocal माइक्रोस्कोपी जैसे सेल संलयन और कहनेवाला नैनोट्यूब के गठन के दो सेल आबादी की बातचीत से पता चला. प्रवाह cytometry विश्लेषण क्षतिग्रस्त कोशिकाओं जो एक ग्राफ पर प्लॉट किया जा सकता है और सांख्यिकीय विश्लेषण के 3 समूहों का पता चला. ये आबादी के अलग - अलग जांच की जा सकता है और निष्कर्ष नकली की प्रभावशीलता पर इन आंकड़ों पर खींचा जा सकता हैtherapeutical दृष्टिकोण.

Protocol

1. H9c2 cardiomyoblast कोशिकाओं की तैयारी

H9c2 चूहे cardiomyoblasts ATCC (Wesel, जर्मनी) से प्राप्त किया गया और उच्च ग्लूकोज (4.5 छ / एल) DMEM 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 4 मिमी एल glutamine, 100 यू / मिलीलीटर पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 / μg मिलीलीटर युक्त में विस्तार. H9c2 myoblast सेल लाइन भ्रूण चूहे दिल से ली गई है, यह दोनों कंकाल और हृदय 8,9 मांसपेशियों के लिए इन विट्रो मॉडल में एक के रूप में प्रयोग किया जाता है .

12 H9c2 कोशिकाओं की अच्छी तरह से थाली तैयार:

  1. H9c2 कोशिकाओं के पेट्री डिश संस्कृति के माध्यम से निकालें.
  2. कोशिकाओं को दो बार 2-3 मिलीलीटर 0.05% trypsin / EDTA के साथ 5 मिलीलीटर पीबीएस और पचाने में के साथ धोएं.
  3. प्लेस 37 ° सी इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए पेट्री डिश.
  4. 10 मिलीलीटर DMEM मध्यम संस्कृति के साथ trypsin रोकते हैं.
  5. 8 मिनट के लिए 1200 RPM में स्पिन कोशिकाओं.
  6. 1 मिलीलीटर DMEM संस्कृति और Trypan ब्लू धुंधला का उपयोग कर hemocytometer के साथ मध्यम गिनती कोशिकाओं में सतह पर तैरनेवाला, resuspend कोशिकाओं को हटाने के बाद.
  7. बीज 2 मिलीलीटर DMEM में प्रति अच्छी तरह से एक 12 अच्छी तरह से थाली में 30,000 H9c2 कोशिकाओं.
  8. 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए थाली प्लेस .

2. नकली ischemia / reperfusion

Ischemia / reperfusion की H9c2 सेल संस्कृतियों पर ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव (OGD) के प्रदर्शन से इन विट्रो में नकली था. इस प्रक्रिया PeCon सेल ऊष्मायन (Erbach जर्मनी) प्रणाली OGD के दौरान कोशिकाओं का अवलोकन की अनुमति के साथ Zeiss confocal खुर्दबीन के मंच पर प्रदर्शन किया गया था.

  1. 12 H9c2 कोशिकाओं की एक अच्छी तरह से थाली से आकांक्षा से मध्यम निकालें.
  2. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो.
  3. 3 प्रति मिलीलीटर में अच्छी तरह से ग्लूकोज मुक्त मध्यम जोड़ें.
  4. सेल ऊष्मायन प्रणाली में थाली प्लेस.
  5. नाइट्रोजन गैस प्रारंभ ऊष्मायन प्रणाली के बाहर ऑक्सीजन शुद्ध.
  6. जब तक ऑक्सीजन का स्तर 0.5% तक पहुँचता है तब टाइमर शुरू रुको. 0.5% ऑक्सीजन लगभग 3 mmHg आंशिक तनाव का मतलब है. 1 करने के लिए विषय कोशिकाओंनकली ischemia के 50 मिनट.
  7. नकली ischemia के अंत में, कोशिकाओं से ग्लूकोज मुक्त मध्यम हटा दें.
  8. पिपेट 2 मिलीलीटर सामान्य संस्कृति कुओं के माध्यम.
  9. 12 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए अच्छी तरह से थाली प्लेस, यह "reperfusion की अवधि" है.

3. तैयारी बचाव mesenchymal स्टेम सेल

मानव मूल के अस्थि मज्जा T75 बोतल में ले लिया था और है Dulbecco संशोधित है ईगल (DMEM) मध्यम संस्कृति 10% भ्रूण बछड़ा (FCS) सीरम, 100 / यू मिलीलीटर पेनिसिलिन और 100 स्ट्रेप्टोमाइसिन / μg मिलीलीटर युक्त मध्यम, 4 मिमी एल - glutamine और के साथ पतला 1 जी / एल ग्लूकोज. बोतल 37 ° C पर 3 दिनों के लिए एक 5% सीओ 2 का पूरी तरह से humidified माहौल में incubated रहे थे. ऊष्मायन अवधि के बाद बोतल और अस्थि मज्जा की शेष घटकों की सतह का पालन BMSCs पीबीएस के साथ धोने से सफाया कर रहे थे. इस्तेमाल किया BMSCs प्रयोगों में 1 और 5 अंश के बीच थे. पहचानकक्षों की tity प्रवाह cytometry के साथ वंश विशेष सेल सतह मार्कर की उपस्थिति द्वारा पुष्टि की गई. Hematopoietic विशिष्ट सतह - वंशावली (CD45 CD34,) मार्करों और mesenchymal सतह मार्करों (CD73, CD105 CD90, और CD166) जांच की गई.

नकली ischemia के दौरान, mesenchymal स्टेम सेल प्रत्यारोपण के लिए बचाव तैयार करते हैं.

  1. फ्लोरोसेंट रंजक Vybrant DMEM संस्कृति माध्यम में 1:200 अनुपात में किया पतला.
  2. बचाव कोशिकाओं से मध्यम महाप्राण (व्यंजन) और 300 μl DMEM जोड़ने के साथ Vybrant था.
  3. जगह 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में पेट्री डिश.
  4. Mesenchymal स्टेम सेल के पेट्री डिश से संस्कृति के माध्यम से निकालें.
  5. कोशिकाओं को दो बार 2-3 मिलीलीटर 0.05% trypsin / EDTA के साथ 5 मिलीलीटर पीबीएस और पचाने में के साथ धोएं.
  6. प्लेस 37 ° सी इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए पेट्री डिश.
  7. 10 मिलीलीटर DMEM मध्यम संस्कृति के साथ trypsin रोकते हैं.
  8. 8 मिनट के लिए 1200 RPM में स्पिन कोशिकाओं.
  9. Supe हटाने के बाद1 मिलीलीटर DMEM संस्कृति मध्यम और Trypan ब्लू धुंधला का उपयोग कर hemocytometer के साथ गिनती कोशिकाओं में rnatant, resuspend कोशिकाओं.
  10. Reperfusion के अंत में 30 मिनट के बाद 20,000 mesenchymal स्टेम कोशिकाओं को जोड़ने postischemic H9c2 हृदय myoblasts प्रति अच्छी तरह से.
  11. 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं के सह संस्कृति प्लेस .

4. Confocal माइक्रोस्कोपी के साथ विश्लेषण

नकली / ischemia reperfusion की चोट के बाद, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए सामान्य संस्कृति के माध्यम में incubated हैं.

  1. 24 घंटे के बाद कोशिकाओं को दो बार धोने पीबीएस के साथ.
  2. 500 μl / रहते मृत 30 मिनट (5 एनएम calcein और 400 एनएम पीबीएस में Ethidium homodimer-2) (5x10 4 / सेल मिलीलीटर) के लिए डाई समाधान में कोशिकाओं का दाग .

ImageJ सॉफ्टवेयर (स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, संयुक्त राज्य अमेरिका) के साथ रहते हैं और मर morphology और प्रतिदीप्ति द्वारा चयनित कक्षों के लिए confocal छवियों के मूल्यांकन किया जा सकता है है. ग के मामले मेंओ संस्कृतियों, MSCs H9c2 उनके Vybrant क्या सेल लेबलिंग के कारण कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. मृत कोशिकाओं के अनुपात में देखने के 4 स्वतंत्र फ़ील्ड्स (उद्देश्य 10x) प्रत्येक संस्कृति के लिए एक अंधे 10 फैशन में मूल्यांकन किया जा सकता है .

H9c2 42 मिमी कांच coverslips पर सुसंस्कृत cardiomyoblasts / ischemia reperfusion की चोट confocal सूक्ष्मदर्शी की सेल ऊष्मायन प्रणाली का उपयोग के दौरान और बाद में भी समय व्यतीत हो वीडियो माइक्रोस्कोपी के साथ जांच की जा सकता है. सेल संलयन और कहनेवाला नैनोट्यूब के गठन जैसे सेल सेल बातचीत को समय पर अध्ययन किया जा सकता है.

5. प्रवाह cytometry के साथ विश्लेषण

नकली / ischemia reperfusion की चोट के बाद, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए सामान्य संस्कृति के माध्यम में incubated हैं.

  1. 24 घंटे के बाद, संस्कृति मीडिया फसल. यह बहुत महत्वपूर्ण है मध्यम संस्कृति भी इकट्ठा क्योंकि कुछ मृत कोशिकाओं को 24 घंटे incuba के दौरान संस्कृति डिश सतह से अलग हो सकताtion.
  2. कोशिकाओं को 0.05% trypsin - EDTA के साथ दो बार पीबीएस और पचाने में साथ धोएं.
  3. DMEM मध्यम संस्कृति के साथ trypsin रोकते हैं.
  4. नीचे कोशिकाओं और 8 मिनट के लिए काटा संस्कृति के माध्यम 1200 RPM को (लगभग 150 - 200g) पर स्पिन.
  5. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  6. ΜL 500 / रहते मृत 30 मिनट (5 एनएम calcein और 400 एनएम पीबीएस में Ethidium homodimer-2) (5x10 4 / सेल मिलीलीटर) के लिए डाई समाधान में निलंबित कोशिकाओं.
  7. कोशिकाओं स्थानांतरण cytometry ट्यूबों प्रवाह.
  8. CellQuest प्रो सॉफ्टवेयर प्रारंभ.
  9. माप के लिए प्रवाह कोशिकामापी सेट करने के लिए तैयार रहते हैं और मृत कोशिकाओं के नमूने नियंत्रण.
    1. प्लेट 12-अच्छी तरह प्लेटें में H9c2 4 3x10 के घनत्व पर कोशिकाओं के रूप में 1 बिंदु में वर्णित है.
    2. तैयार एकल trypsinisation सेल नियंत्रण के साथ जीने के रूप में 1 बिंदु में वर्णित है.
    3. 1 घंटे के लिए 10 एच 2 हे 2 सुक्ष्ममापी के साथ इलाज से मृत सेल नियंत्रण की तैयारी .
    4. Trypsinisation बाद resuspenघ 500 μl / जी मृत डाई समाधान (5 एनएम calcein AM और 400 एनएम पीबीएस में Ethidium homodimer-2) में रहते हैं और मृत सेल नियंत्रण.
  10. साधन सेटिंग्स तो जीवित कोशिकाओं calcein सकारात्मक और ethidium homodimer नकारात्मक रहे हैं, जबकि मृत कोशिकाओं calcein नकारात्मक और ethidium homodimer सकारात्मक हैं समायोजित किया जाना चाहिए.
  11. इन आबादियों के प्रतिशत के रूप में एक ग्राफ और सांख्यिकीय विश्लेषण पर सलाखों के इन मूल्यों पर प्रदर्शन किया जा सकता है है व्यक्त किया जा सकता है.
  12. विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों उपाय.

6. प्रतिनिधि परिणाम:

हमारे नतीजे बताते हैं कि जोड़ा mesenchymal स्टेम कोशिकाओं postischemic हृदय कोशिकाओं के अस्तित्व में सुधार सकता है. Confocal माइक्रोस्कोपी छवियों आंशिक झिल्ली कनेक्शन या कहनेवाला नैनोट्यूब के रूप में प्रत्यक्ष सेल सेल करने के लिए बातचीत है, जो शायद मनाया 10 संरक्षण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा पता चला. इन नैनोट्यूब कई सेल घ की दूरी से अधिक अवधिiameters, और उनके व्यास 200 और 500 एनएम (सफेद तीर) के बीच थे.

चित्रा 1
चित्रा 1. कोशिकाओं के बीच नैनोट्यूब गठन नैनोट्यूब गठन (सफेद तीर) Vybrant डियो लेबल cardiomyoblasts और Vybrant क्या लेबल mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के बीच मनाया गया .

प्रवाह cytometry विश्लेषण जीवित और परिगलित cardiomyoblasts की आबादी और mesenchymal स्टेम सेल से पता चला. दिलचस्प है, हम भी एक तीसरे 'घायल' cardiomyoblast सेल जनसंख्या जो calcein निहित मनाया है लेकिन यह भी मृत कोशिकाओं, ethidium homodimer (चित्रा 2) के सूचक निहित है.

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रतिनिधि नकली ischemia के बाद अलग अलग सेल आबादी के डॉट - साजिश .

कई प्रयोगों थानेदार का मूल्यांकनशादी कि postischemic H9c2 cardiomyoblast mesenchymal स्टेम सेल के अलावा काफी वृद्धि हुई है हृदय ischemia के बाद अकेले सुसंस्कृत myoblasts (चित्रा 3) की तुलना में जीवित कोशिकाओं का प्रतिशत.

चित्रा 3
चित्रा 3. है, जो बाद इसके अलावा में वृद्धि हुई: जीवित कोशिकाओं के postischemic cardiomyoblasts पर स्टेम सेल उपचार के प्रभाव प्रतिशत काफी नकली (90.36 ± 2.60 बनाम 10.52 ± 0.48, *** 0.001> पी नियंत्रण बनाम आईआर मॉडल) को नियंत्रित करने के लिए की तुलना में ischemia के बाद कम हो गया था mesenchymal स्टेम सेल (आईआर मॉडल बनाम आईआर BMSC +: 10.52 ± 0.48 बनाम 25.21 ± 2.13, *** 0.001 पी). डेटा मतलब ± SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं. डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण Tukey एकाधिक तुलना पोस्ट अस्थायी परीक्षण के साथ एक तरह से विचरण के विश्लेषण का उपयोग कर बाहर किया गया था.

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Discussion

प्रदर्शन प्रोटोकॉल स्टेम सेल दौरे रोधगलितांश में इस तरह के एक मॉडल के सभी फायदे और नुकसान के साथ, चिकित्सा के और अधिक जटिल मुद्दे को इन विट्रो दृष्टिकोण में एक है. जाहिर है यह जटिल (जैसे प्रतिरक्षाविज्ञानी) दौरे रोधगलितांश दौरान और बाद में हो रही घटनाओं को प्रतिबिंबित नहीं लेकिन postischemic कोशिकाओं को जोडी कोशिकाओं के प्रत्यक्ष प्रभाव पर ध्यान केंद्रित कर सकते हैं कर सकते हैं. H9c2 cardiomyoblasts पर नकली ischemia के प्रभाव अत्यधिक OGD के समय पर इस्तेमाल किया कोशिकाओं के पारित होने के नंबर पर और हे 2 एकाग्रता पर निर्भर करते हैं. एक इन मानकों को सही समायोजित करना चाहिए और एक निश्चित सेल प्रकार के लिए इष्टतम स्थितियों को खोजने के क्रम में करने के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल है. बाद में, प्रोटोकॉल कई मायनों में इस्तेमाल किया जा सकता है (गुर्दे, यकृत या मस्तिष्क ischemia / reperfusion की 11,12,13,14) अलग जोडी भ्रूण स्टेम कोशिकाओं, प्रेरित pluripotent स्टेम सेल या वयस्क स्टेम सेल जैसे सेल प्रकार के प्रभाव की जांच 15, ई16 वातानुकूलित मध्यम या विभिन्न pretreatments 17,18 या हित के ध्यान में किसी भी पैरामीटर के ffectiveness.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम OTKA (हंगेरी साइंटिफिक रिसर्च फंड) D45933, T049621, TET (हंगेरी विज्ञान और प्रौद्योगिकी फाउंडेशन) A4/04, Arg-17/2006 और पाप, Bolyai, Öveges फैलोशिप और TÁMOP द्वारा समर्थित किया गया 4.2.2-08 / / 1 KMR-2008-०००४ और 4.2.1 / 09/1/KMR-2010-0001 बी. 83803 OTKA. हम से अधिक आवाज प्रदान करने के लिए विलियम Gesztes को धन्यवाद देना चाहूंगा.

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मेडिसिन 57 अंक ischemia / reperfusion मॉडल स्टेम सेल प्रत्यारोपण confocal माइक्रोस्कोपी प्रवाह cytometry
एक में स्टेम सेल प्रत्यारोपण<em> इन विट्रो में</em> नकली मॉडल / Ischemia reperfusion
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Cselenyák, A., Benko, Z.,… More

Cselenyák, A., Benko, Z., Szepes, M., Kiss, L., Lacza, Z. Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model. J. Vis. Exp. (57), e3575, doi:10.3791/3575 (2011).

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