Stamceltransplantatie in een In vitro Gesimuleerde ischemie / reperfusie model

Summary

Laten we zien hoe het opzetten van een

Abstract

Stamceltransplantatie protocollen vinden hun weg naar de klinische praktijk ^1,2,3. Beter resultaat, waardoor de protocollen robuuster, en het vinden van nieuwe bronnen voor de implanteerbare cellen zijn de focus van recent onderzoek ^4,5. Onderzoek naar de effectiviteit van de cel therapieën is niet een gemakkelijke taak en zijn nieuwe instrumenten nodig om de mechanismen betrokken bij het ​​behandelingsproces ^zes onderzoeken. We ontwierpen een experimenteel protocol van ischemie / reperfusie in om het observeren van cellulaire verbindingen en zelfs subcellulaire mechanismen tijdens ischemie / reperfusie schade en na stamceltransplantatie mogelijk te maken en de effectiviteit van celtherapie te evalueren. H9c2 cardiomyoblast cellen werden geplaatst op celcultuur platen ^7,8. Ischemie werd gesimuleerd met 150 minuten in een glucose-vrij medium met zuurstof niveau lager dan 0,5%. Daarna werden de normale media en zuurstof niveaus opnieuw naar reperfusie te simuleren. Na zuurstof glucose ontbering,de beschadigde cellen werden behandeld met de transplantatie van gelabelde menselijke beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen toe te voegen aan de cultuur. Mesenchymale stamcellen de voorkeur in klinische studies, omdat ze gemakkelijk te bereiken met minimaal invasieve chirurgie, gemakkelijk uitbreidbaar en autologe. Na 24 uur co-teelt, werden cellen gekleurd met calceïne en ethidium-homodimeer onderscheid te maken tussen levende en dode cellen. Deze opzet liet ons toe om de intercellulaire verbindingen met behulp van confocale fluorescentie microscopie te onderzoeken en om de overleving van postischemic cellen door flowcytometrie kwantificeren. Confocale microscopie toonde de interacties van de twee celpopulaties zoals celfusie en de vorming van intercellulaire nanobuisjes. Flowcytometrie analyse bleek drie clusters van beschadigde cellen die kunnen worden uitgezet in een grafiek en statistisch geanalyseerd. Deze populatie kunnen afzonderlijk worden onderzocht en conclusies kunnen worden getrokken over deze gegevens over de effectiviteit van de gesimuleerdetherapeutische aanpak.

Protocol

1. Voorbereiden H9c2 cardiomyoblast cellen

H9c2 rat cardiomyoblasts werden verkregen van ATCC (Wesel, Duitsland) en uitgebreid in hoge glucose (4,5 g / L) DMEM dat 10% foetaal runderserum, 4 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine. De H9c2 myoblast cellijn is afkomstig van embryonale rat hart, wordt het gebruikt als een in vitro model voor zowel de skelet-en hartspier ^8,9.

Bereid 12 well plaat van H9c2 cellen:

1. Verwijder kweekmedium uit petrischaal van H9c2 cellen.
2. Twee keer wassen cellen met 5 ml PBS en verteren met 2-3 ml 0,05% trypsine / EDTA.
3. Plaats Petri schaal 5 minuten in het 37 ° C incubator.
4. Remmen trypsine met 10 ml DMEM kweekmedium.
5. Spin down van de cellen bij 1200 tpm gedurende 8 minuten.
6. Na het verwijderen van het supernatant, resuspendeer cellen in 1 ml DMEM kweekmedium en tellen cellen met behulp van hemocytometer trypan blauw kleuring.
7. Seed 30.000 H9c2 cellen in 2 ml DMEM per putje in een 12 wells plaat.
8. Plaats de plaat in de 37 ° C CO ₂ incubator voor 24 uur.

2. Gesimuleerde ischemie / reperfusie

Ischemie / reperfusie werd gesimuleerd in vitro door het uitvoeren van zuurstof glucose deprivatie (OGD) op H9c2 celculturen. Deze procedure werd uitgevoerd op het podium van de Zeiss confocale microscoop met de Pecon cel incubatie-systeem (Erbach, Duitsland), zodat de controle van de cellen tijdens de OGD.

1. Verwijder medium door aspiratie van 12 wells plaat van H9c2 cellen.
2. Twee keer wassen cellen met PBS.
3. Voeg 3 ml glucose-vrij medium per well.
4. Plaats de plaat in de cel incubatie-systeem.
5. Start stikstofgas om de zuurstof te zuiveren uit het incubatie-systeem.
6. Wacht tot het niveau van zuurstof bereikt 0,5%, dan start de timer. 0,5% zuurstof betekent ongeveer 3 mmHg gedeeltelijke spanning. Onder voorbehoud van cellen om een50 minuten van gesimuleerde ischemie.
7. Aan het einde van gesimuleerde ischemie, verwijder dan de glucose-vrij medium van de cellen.
8. Pipetteer 2 ml normaal kweekmedium aan de wells.
9. Plaats de 12 wells plaat gedurende 30 minuten in de 37 ° C CO ₂ incubator, dit is de "reperfusie periode".

3. Voorbereiden rescue mesenchymale stamcellen

Beenmerg van menselijke oorsprong is rekening T75 kolven en verdund met Medium Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) kweekmedium dat 10% foetaal kalf serum (FCS), 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine, 4 mM L-glutamine en 1 g / l glucose. De flessen werden geïncubeerd bij 37 ° C in een volledig vochtige atmosfeer van 5% CO ₂ gedurende 3 dagen. Na de incubatietijd van de BMSCs gehandeld op grond van het oppervlak van de kolven en de resterende onderdelen van het beenmerg werden geëlimineerd door wassen met PBS. De gebruikte BMSCs waren tussen 1 en 5 passages in de experimenten. De Idenheid van de cellen werd bevestigd door de aanwezigheid van lijn-specifieke celoppervlaktemerkers met flowcytometrie. Hematopoietische aantal regels-specifieke oppervlakte merkers (CD34, CD45) en mesenchymale oppervlakte merkers (CD73, CD90, CD105 en CD166) werden onderzocht.

Tijdens de gesimuleerde ischemie, voorbereiden rescue mesenchymale stamcellen voor transplantatie.

1. Verdun de fluorescente kleurstof Vybrant DiD in verhouding 1:200 in DMEM kweekmedium.
2. Aspireren medium van de reddings-cellen en voeg 300 ul DMEM met Vybrant DiD.
3. Plaats Petri schaal gedurende 30 minuten in de 37 ° C CO ₂ incubator.
4. Verwijder kweekmedium uit petrischaal van mesenchymale stamcellen.
5. Twee keer wassen cellen met 5 ml PBS en verteren met 2-3 ml 0,05% trypsine / EDTA.
6. Plaats Petri schaal 5 minuten in het 37 ° C incubator.
7. Remmen trypsine met 10 ml DMEM kweekmedium.
8. Spin down van de cellen bij 1200 tpm gedurende 8 minuten.
9. Na het verwijderen van de Supernatant, hersuspenderen cellen in 1 ml DMEM kweekmedium en tellen cellen met behulp van hemocytometer trypan blauw kleuring.
10. Na 30 minuten aan het einde van de reperfusie toe te voegen 20.000 mesenchymale stamcellen per goed aan de postischemic H9c2 cardiale myoblasten.
11. Plaats co-cultuur van cellen in de 37 ° C CO ₂ incubator voor 24 uur.

4. Analyse met confocale microscopie

Na de gesimuleerde ischemie / reperfusie schade worden cellen geïncubeerd in een normale kweekmedium voor 24 uur.

1. Na 24 uur spoelen cellen tweemaal met PBS.
2. Vlekken op de cellen in 500 pi live / dood kleurstof oplossing gedurende 30 minuten (5 nM en 400 nM calceïne Ethidium-homodimeer-2 in PBS) (5x10 ⁴ cellen / ml).

De evaluatie van de confocale beelden voor levende en dode cellen geselecteerd door morfologie en fluorescentie kunnen worden uitgevoerd met de ImageJ software (National Institutes of Health, USA). In het geval van co-culturen, kan MSC's worden onderscheiden van H9c2 cellen als gevolg van hun Vybrant DiD cel etikettering. De verhouding van dode cellen kan worden geëvalueerd in vier onafhankelijke gezichtsveld (objectieve 10x) voor elke cultuur in een blinde manier ^10.

H9c2 cardiomyoblasts gekweekt op 42 mm glas dekglaasjes kan ook worden onderzocht met time lapse video-microscopie tijdens en na ischemie / reperfusie schade met behulp van de cel incubatie systeem van de confocale microscoop. Cel-cel interacties zoals celfusie en de vorming van intercellulaire nanobuisjes kunnen worden bestudeerd in de tijd.

5. Analyse met flowcytometrie

Na de gesimuleerde ischemie / reperfusie schade worden cellen geïncubeerd in een normale kweekmedium voor 24 uur.

1. Na 24 uur, de oogst van de cultuur media. Het is erg belangrijk aan het kweekmedium verzamelen ook omdat sommige dode cellen zou kunnen hebben losgemaakt van de cultuur schotel oppervlak tijdens de 24 uur incubatieTIE.
2. Twee keer wassen cellen met PBS en verteren met 0,05% trypsine-EDTA.
3. Remmen trypsine met DMEM kweekmedium.
4. Spin down van de cellen en de geoogste kweekmedium op 1200 RPM (ongeveer 150-200g) gedurende 8 minuten.
5. Verwijder het supernatant.
6. Hang de cellen in 500 pi live / dood kleurstof oplossing gedurende 30 minuten (5 nM en 400 nM calceïne Ethidium-homodimeer-2 in PBS) (5x10 ⁴ cellen / ml).
7. Overdracht cellen om cytometrie buizen stromen.
8. Start de CellQuest Pro software.
9. Voor het instellen van de flowcytometer voor metingen, voorbereiden controlemonsters van levende en dode cellen.
   1. Plaat H9c2 cellen bij een dichtheid van 3x10 ⁴ in 12-well platen, zoals beschreven in punt 1.
   2. Bereid levende cellen controles met enkele trypsinisation zoals beschreven in punt 1.
   3. Bereid dode cel controles door de behandeling met 10 uM H ₂ O ₂ voor 1 uur.
   4. Na trypsinisation, resuspend levende en dode cellen controles in 500 pi live / dead kleurstof oplossing (5 nM calceïne-AM en 400 nM Ethidium-homodimeer-2 in PBS).
10. De instrumentele instellingen moeten worden aangepast, zodat de levende cellen calceïne positieve en ethidium homodimeer negatief, terwijl de dode cellen worden calceïne negatief en ethidium homodimeer positief.
11. Het percentage van deze populaties kan worden uitgedrukt als bars op een grafiek en statistische analyse kan worden uitgevoerd op deze waarden.
12. Het meten van de verschillende experimentele groepen.

6. Representatieve resultaten:

Onze resultaten laten zien dat toegevoegde mesenchymale stamcellen zou het overleven van postischemic hartcellen te verbeteren. Confocale microscopie beelden onthuld direct cel-cel interacties, zoals de gedeeltelijke membraan verbinding of intercellulaire nanobuisjes, die waarschijnlijk een belangrijke rol spelen in de waargenomen bescherming ^10. Deze nanobuisjes overspanning over afstanden van enkele cel diameters, en hun diameter zijn tussen de 200 en 500 nm (witte pijlen).

Figuur 1. Nanobuis formatie tussen de cellen. Nanotube vorming van (witte pijl) werd waargenomen tussen Vybrant DIO gelabeld cardiomyoblasts en Vybrant DiD gelabelde mesenchymale stamcellen.

Flowcytometrie analyse toonde de bevolking te overleven en necrotische cardiomyoblasts en mesenchymale stamcellen. Interessant is dat we ook waargenomen een derde, 'gewond' cardiomyoblast celpopulatie die calceïne bevatte, maar bevatte ook de indicator van de dode cellen, ethidium homodimeer (Figuur 2).

Figuur 2. Representatieve dot-plot van de verschillende celpopulaties na gesimuleerde ischemie.

De evaluatie van de verschillende experimenten showed dat de toevoeging van mesenchymale stamcellen te postischemic H9c2 cardiomyoblast aanzienlijk verhoogd het percentage levende cellen ten opzichte van de cardiale myoblasten alleen gekweekte na ischemie (figuur 3).

Figuur 3. . Effect van stamcel behandeling op postischemic cardiomyoblasts Percentage van levende cellen werd significant verlaagd na gesimuleerde ischemie in vergelijking met controle (controle vs IR-model: 90.36 ± 2.60 vs 10,52 ± 0,48, *** p> 0,001), die toenam na de toevoeging van mesenchymale stamcellen (IR-model versus IR + BMSC: 10.52 ± 0.48 vs 25,21 ± 2,13, *** p> 0,001). De gegevens zijn gemiddelden ± SEM. Statistische analyse van de gegevens werd uitgevoerd met behulp van one-way variantie analyse met meerdere vergelijking bericht Tukey's hoc test.

Discussion

De aangetoonde protocol is een in vitro benadering van de veel meer complexe kwestie van stamceltherapie in myocard infarct, met alle voordelen en nadelen van een dergelijk model. Uiteraard kan het geen afspiegeling van het complex (bijvoorbeeld immunologische) evenementen die plaatsvinden tijdens en na het hartinfarct, maar kan zich richten op de directe effecten van de toegevoegde cellen op het postischemic cellen. De effecten van gesimuleerde ischemie op H9c2 cardiomyoblasts sterk afhankelijk van het tijdstip van OGD, op de passage aantal van de gebruikte cellen en op de O ₂ concentratie. Men moet precies passen deze parameters en vind de optimale omstandigheden voor een bepaald celtype in om een ​​gestandaardiseerd protocol te hebben. Daarna kan het protocol worden op vele manieren gebruikt (nier-, lever-of cerebrale ischemie / reperfusie ^11,12,13,14) om de effecten van verschillende toegevoegde celtypes, zoals embryonale stamcellen, geïnduceerde pluripotente stamcellen of volwassen stamcellen te onderzoeken ^15, het effectiveness van geconditioneerde medium ¹⁶ of diverse voorbehandelingen ^17,18 of een parameter in het brandpunt van de belangstelling.