Stamcelletransplantation i en In vitro Simuleret Iskæmi / reperfusion Model

Summary

Vi viser, hvordan du opretter en

Abstract

Stamcelletransplantation protokoller er at finde deres vej ind i klinisk praksis ^1,2,3. Kom i bedre resultater, hvilket gør de protokoller mere robust, og finde nye kilder til implantable celler er i fokus i nyere forskning ^4,5. Undersøgelse af effektiviteten af celleterapier er ikke en let opgave, og nye værktøjer er nødvendige for at undersøge de mekanismer, der er involveret i behandlingsprocessen ^6. Vi har designet en forsøgsprotokol af iskæmi / reperfusion for at tillade observation af cellulære forbindelser og endda subcellulære mekanismer under iskæmi / reperfusion skade og efter stamcelletransplantation, og at evaluere effekten af ​​celleterapi. H9c2 cardiomyoblast celler blev placeret på cellekultur plader ^7,8. Iskæmi blev simuleret med 150 minutter i en glukose frit medie med ilt niveau under 0,5%. Derefter var normale medier og ilt niveauer genindført at simulere reperfusion. Efter ilt glukose afsavn,de beskadigede celler blev behandlet med transplantation af mærket menneskelige knoglemarv afledt mesenchymale stamceller ved at tilføje dem til kulturen. Mesenchymale stamceller er foretrukket i kliniske forsøg, fordi de er let tilgængelige med minimal invasiv kirurgi, nemt kan udvides og autolog. Efter 24 timers co-dyrkning, blev cellerne farvet med calcein og ethidium-homodimer at skelne mellem levende og døde celler. Denne opsætning gav os mulighed for at undersøge intercellulære forbindelser ved hjælp af konfokal fluorescens mikroskopi og at kvantificere overlevelsesraten for postischemic celler ved flowcytometri. Konfokal mikroskopi viste samspillet mellem de to cellepopulationer såsom celle fusion og dannelsen af ​​intercellulære nanorør. Flowcytometri analyse viste 3 klynger af beskadigede celler, som kan plottes på en graf og analyseret statistisk. Disse befolkninger kan undersøges separat og konklusioner, der kan trækkes på disse data om effektiviteten af ​​den simuleredeterapeutiske tilgang.

Protocol

1. Forberedelse H9c2 cardiomyoblast celler

H9c2 rotte cardiomyoblasts blev indhentet fra ATCC (Wesel, Tyskland) og udvidet i høj glukose (4,5 g / L) DMEM med 10% føtalt bovint serum, 4 mM L-glutamin, 100 E / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin. Den H9c2 myoblast cellelinje er afledt af embryonale rotte hjertet, er det brugt som en in vitro model for både skelet-og hjertemuskulaturen ^8,9.

Forbered 12 brønds plade af H9c2 celler:

1. Fjern dyrkningsmediet fra petriskål af H9c2 celler.
2. Vask celler to gange med 5 ml PBS og fordøje med 2-3 ml 0,05% trypsin / EDTA.
3. Placer petriskål i 5 minutter i 37 ° C inkubator.
4. Hæmmer trypsin med 10 ml DMEM dyrkningsmediet.
5. Spin ned cellerne ved 1200 RPM i 8 minutter.
6. Efter fjernelse af supernatanten, resuspender cellerne i 1 ml DMEM dyrkningsmedium og tælle celler med hemocytometer hjælp Trypan blå farvning.
7. Seed 30.000 H9c2 celler i 2 ml DMEM per brønd i en 12 brønds plade.
8. Pladen anbringes i 37 ° C CO ₂ inkubator i 24 timer.

2. Simuleret iskæmi / reperfusion

Iskæmi / reperfusion blev simuleret in vitro ved at udføre ilt glukose deprivation (OGD) på H9c2 cellekulturer. Denne procedure blev udført på den fase af Zeiss konfokal mikroskop med PeCon celle inkubation system (Erbach, Tyskland) tillader observation af cellerne under OGD.

1. Fjern medium ved aspiration fra 12 brønds plade af H9c2 celler.
2. Vask celler to gange med PBS.
3. Tilsæt 3 ml glukose frie medie per brønd.
4. Pladen ind i cellen inkubation systemet.
5. Start nitrogen gas til rense ilt ud af inkubationen systemet.
6. Vent, indtil iltniveauet når 0,5% derefter starte timeren. 0,5% ilt betyder cirka 3 mmHg delvise spændinger. Med forbehold af celler til 150 minutters simuleret iskæmi.
7. I slutningen af ​​simuleret iskæmi, skal du fjerne glukose fri medium fra cellerne.
8. Afpipetteres 2 ml normal kultur medium til brøndene.
9. Placer de 12 brønds plade i 30 minutter i 37 ° C CO ₂ inkubator, hvilket er "reperfusion periode".

3. Forberedelse redde mesenchymale stamceller

Knoglemarv af menneskelig oprindelse blev taget med i T75 kolber og fortyndes med Dulbecco er Modified Eagle Medium (DMEM) kultur medium, der indeholder 10% føtalt kalveserum (FCS), 100 E / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin, 4 mM L-glutamin og 1 g / l glukose. Kolberne blev inkuberet ved 37 ° C i en fuldt befugtet atmosfære af 5% CO ₂ til 3 dage. Efter inkubationstiden den BMSCs levet op til overfladen af ​​kolberne, og de resterende komponenter af knoglemarv blev elimineret ved at vaske med PBS. De anvendte BMSCs lå mellem 1 og 5 passager i forsøgene. Den identity af celler blev bekræftet ved tilstedeværelsen af ​​slægt-specifikke celle overflade markører med flowcytometri. Hæmatopoietisk linage-specifik overflade markører (CD34, CD45) og mesenchymale overflade markører (CD73, CD90, CD105 og CD166) blev undersøgt.

I løbet af simuleret iskæmi, forberede redde mesenkymale stamceller til transplantation.

1. Fortynd den fluorescerende farvestof Vybrant gjorde i 1:200 forhold i DMEM dyrkningsmediet.
2. Aspirer medium fra Rescue celler og tilsæt 300 μl DMEM med Vybrant gjorde.
3. Placer petriskål i 30 minutter i 37 ° C CO ₂ inkubator.
4. Fjern dyrkningsmediet fra petriskål af mesenchymale stamceller.
5. Vask celler to gange med 5 ml PBS og fordøje med 2-3 ml 0,05% trypsin / EDTA.
6. Placer petriskål i 5 minutter i 37 ° C inkubator.
7. Hæmmer trypsin med 10 ml DMEM dyrkningsmediet.
8. Spin ned cellerne ved 1200 RPM i 8 minutter.
9. Efter at have fjernet Supernatant, resuspender cellerne i 1 ml DMEM dyrkningsmedium og tælle celler med hemocytometer hjælp Trypan blå farvning.
10. Efter 30 minutter i slutningen af ​​reperfusion tilføje 20.000 mesenchymale stamceller per godt til postischemic H9c2 hjerte myoblasts.
11. Placer co-kultur af celler i 37 ° C CO ₂ inkubator i 24 timer.

4. Analyse med konfokal mikroskopi

Efter simuleret iskæmi / reperfusion skade, er cellerne inkuberes i normal dyrkningsmedium i 24 timer.

1. Efter 24 timer vaskes celler to gange med PBS.
2. Farv cellerne i 500 μl live / døde farveoploesning i 30 minutter (5 nM calcein og 400 nM Ethidium-homodimer-2 i PBS) (5x10 ⁴ celler / ml).

Evalueringen af ​​konfokal billeder for levende og døde celler udvalgt af morfologi og fluorescens kan udføres med ImageJ software (National Institutes of Health, USA). I tilfælde af co-kulturer, kan MSC skelnes fra H9c2 celler på grund af deres Vybrant Vidste celle mærkning. Forholdet mellem døde celler kan blive evalueret i 4 uafhængige synsfelter (mål 10x) for hver kultur i en blind måde ^10.

H9c2 cardiomyoblasts dyrkes på 42 mm glas dækglas kan også undersøges med tid bortfalder video mikroskopi under og efter iskæmi / reperfusion skade ved hjælp af cellen inkubation system i konfokal mikroskop. Cell-til-celle interaktioner såsom celle fusion og dannelsen af ​​intercellulære nanorør kan studeres over tid.

5. Analyse med flowcytometri

Efter simuleret iskæmi / reperfusion skade, er cellerne inkuberes i normal dyrkningsmedium i 24 timer.

1. Efter 24 timer, høste dyrkningsmedier. Det er meget vigtigt at indsamle dyrkningsmediet også fordi nogle døde celler kunne have løsrevet fra kulturen fadet overfladen i løbet af 24 timer INCUBAtion.
2. Vask celler to gange med PBS og fordøje med 0,05% trypsin-EDTA.
3. Hæmmer trypsin med DMEM dyrkningsmediet.
4. Spin ned celler og den høstede dyrkningsmediet ved 1200 RPM (ca. 150-200g) i 8 minutter.
5. Supernatanten fjernes.
6. Udeluk cellerne i 500 μL live / døde farveoploesning i 30 minutter (5 nM calcein og 400 nM Ethidium-homodimer-2 i PBS) (5x10 ⁴ celler / ml).
7. Overfør celler til flowcytometri rør.
8. Start CellQuest Pro software.
9. Sådan konfigureres flowcytometeret for måling, forberede kontrolprøver af levende og døde celler.
   1. Plate H9c2 celler i en tæthed på 3x10 ⁴ i 12-såvel plader som beskrevet i punkt 1.
   2. Forbered levende celler kontrol med enkelt trypsinisation som beskrevet i punkt 1.
   3. Forbered døde celle kontrol ved behandling med 10 ìm H ₂ O ₂ for 1 time.
   4. Efter trypsinisation, resuspend levende og døde celler kontrol i 500 μl live / døde farveoploesning (5 nM calcein-AM og 400 nM Ethidium-homodimer-2 i PBS).
10. Instrumentet indstillinger skal justeres, så de levende celler calcein positive og ethidium homodimer negativ, mens de døde celler calcein negative og ethidium homodimer positiv.
11. Den procentdel af disse befolkninger kan udtrykkes som barer på en graf og statistisk analyse kan udføres på disse værdier.
12. Mål forskellige eksperimentelle grupper.

6. Repræsentative resultater:

Vores resultater viste, at tilføjet mesenchymale stamceller kunne forbedre overlevelsen af ​​postischemic hjerteceller. Konfokal mikroskopi billeder afsløret direkte celle-til-celle interaktioner, såsom delvis membran forbindelse eller intercellular nanorør, hvilket formentlig spiller en vigtig rolle i den observerede beskyttelse ^10. Disse nanorør spænder over afstande på flere celle-diameters, og deres diameter var mellem 200 og 500 nm (hvide pile).

Figur 1. Nanorør dannes mellem cellerne. Nanorør formation (hvid pil) blev observeret mellem Vybrant DIO mærket cardiomyoblasts og Vybrant Vidste mærkede mesenchymale stamceller.

Flowcytometri analyse viste befolkningerne i at overleve og nekrotisk cardiomyoblasts og mesenchymale stamceller. Interessant nok har vi også observeret en tredje, 'såret' cardiomyoblast cellepopulation som indeholdt calcein, men også indeholdt indikatoren for de døde celler, ethidium homodimer (Figur 2).

Figur 2. Repræsentant dot-plot af de forskellige cellepopulationer efter simuleret iskæmi.

Evalueringen af ​​flere eksperimenter ShoWed, at tilsætning af mesenchymale stamceller til postischemic H9c2 cardiomyoblast steget markant den procentdel af levende celler i forhold til hjerte-myoblasts kulturperler alene efter iskæmi (Figur 3).

Figur 3. . Effekten af stamcellebehandling på postischemic cardiomyoblasts Procent af levende celler var signifikant reduceret efter simuleret iskæmi i forhold til kontrol (kontrol vs IR-model: 90,36 ± 2,60 vs 10,52 ± 0,48, *** p> 0,001), der steg efter tilsætning af mesenchymale stamceller (IR model vs IR + BMSC: 10,52 ± 0,48 vs 25,21 ± 2,13, *** p> 0,001). Data repræsenterer gennemsnit ± SEM. Statistisk analyse af data blev udført ved hjælp af en-vejs variansanalyse med Tukey er flere sammenligning post hoc-test.

Discussion

Det viste protokollen er en in vitro tilgang til det langt mere komplekse spørgsmål om stamcelleterapi i myokardieinfarkt, med alle de fordele og ulemper ved en sådan model. Naturligvis kan den ikke afspejler den komplekse (fx immunologiske) begivenheder, der finder sted under og efter myokardieinfarkt, men kan fokusere på de direkte effekter af den tilførte celler på postischemic celler. Virkningerne af simulerede iskæmi på H9c2 cardiomyoblasts meget afhænger af tidspunktet for OGD, om overgangen antallet af de anvendte celler og på O _{2-koncentrationen.} Man skal justere disse parametre præcist og finde de optimale betingelser for en bestemt celletype for at få en standardiseret protokol. Bagefter kan protokollen bruges på mange måder (nyre-, lever-eller cerebral iskæmi / reperfusion ^11,12,13,14) for at undersøge effekterne af forskellige tilføjet celletyper, såsom embryonale stamceller, induceret pluripotente stamceller eller voksne stamceller ^15, effectiveness af konditioneret medium ¹⁶ eller flere forbehandlinger ^17,18 eller enhver parameter i fokus for interesse.