Summary
הנויטרופילים הם תאי דם הלבנים הנפוצים ביותר בדם. נויטרופילים בעלי פונקציות מוסדרות תעתיק כגון ייצור של ציטוקינים ועיכוב של אפופטוזיס מעודדים דלקת. פונקציות אלה יכולות להיות למדו בשיטה שהוצגה כאן, המאפשרת זיהוי וכימות גורמים גרעיניים על ידי cytometry זרימה בגרעינים בודדים
Abstract
הנויטרופילים הם תאי דם הלבנים הנפוצים ביותר בדם היקפי. תאים אלה הם ראשונים שמופיעים באתרים של דלקת וזיהום, ובכך להפוך את קו ההגנה הראשון נגד פולשי מיקרואורגניזמים. נויטרופילים בעלי פונקציות מיקרוביאלית חשובות כגון phagocytosis, שחרורו של אנזימי ממוסס, וייצור של מיני חמצן תגובתי. בנוסף לפונקציות בטחוניות החשובות אלה, נויטרופילים לבצע משימות אחרות בתגובה לזיהום, כגון ייצור של ציטוקינים ועיכוב של אפופטוזיס מעודדים דלקת. ציטוקינים לגייס לויקוציטים האחר המסייעים לנקות את הזיהום, ועיכוב של אפופטוזיס מאפשר נויטרופילים לחיות זמן רב יותר באתר של זיהום. פונקציות אלה מוסדרות ברמה של שעתוק. עם זאת, משום שהנויטרופילים הם תאים קצרי חיים, המחקר של תגובות תעתיק מוסדר בתאים אלו לא ניתנים לביצוע בשיטות קונבנציונליות גן כתב מאז אין אפיםטכניקות cient עבור transfection נויטרופילים. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה המאפשרת זיהוי וכימות גורמים גרעיניים בגרעינים מבודדים וimmunolabeled ידי cytometry זרימה. אנו מתארים טכניקות לבודד נויטרופילים טהורים מדם היקפי אנושי, לעורר תאים אלו עם נוגדנים כנגד הקולטן, לבודד וגרעיני immunolabel, גרעינים ולנתח ידי cytometry זרימה. השיטה כבר משמש בהצלחה לאיתור NF-κB וElk 1-גורמים גרעיניים בגרעינים מנויטרופילים וסוגי תאים אחרים. לכן, שיטה זו מייצגת אפשרות לניתוח הפעלה של גורמי שעתוק בגרעינים בודדים מתוך מגוון של סוגי תאים.
Introduction
הנויטרופילים הם תאי דם הלבנים הנפוצים ביותר בדם היקפי 1. במהלך נויטרופילים דלקת והזיהום הם התאים הראשונים שמופיעים באתר המושפע שם הם משמשים כקו ההגנה הראשון 2. נויטרופילים יש מספר מנגנונים מיקרוביאלית 3 כולל phagocytosis, ייצור של מיני חמצן תגובתי, שחרורו של אנזימי ממוסס ידי degranulation, וייצור של ציטוקינים מעודדים דלקת 4.5. הנויטרופילים הם תאים קצרי חיים שמקבלים מופעלים במהירות דרך איתות מהקולטנים בתא שטח שונים. למרות נויטרופילים כבר נחשבים תאים סופניים עקב חייו הקצרים שלהם ובגלל שהם עוברים אפופטוזיס אלא אם הופעל במהלך התהליך הדלקתי 6, עכשיו זה ברור שהם יכולים גם לשנות פנוטיפ שלהם על ידי שינוי ברמה של שעתוק של גנים מסוימים. הייצור של ציטוקינים 5 והעיכוב של אפופטוזיס 7,8 הם שתיים אניפונקציות תא הפעלה תלויה mportant מוסדרות ברמה של שעתוק בנויטרופילים. הגורם הגרעיני κB (NF-κB) משתתף בשליטת התעתיק של 4 ייצור ציטוקינים וברגולציה של הישרדות תא ואפופטוזיס 9-11 בסוגי תאים שונים.
את מסלולי האיתות שיובילו להפעלת פקטור גרעינית בדרך כלל נחקרו על ידי מבחני גן כתב או על ידי מבחני משמרת ניידות electrophoretic (EMSA). עם זאת, משום שהנויטרופילים הם תאים קצרי חיים, המחקר של תגובות מוסדרות תעתיק בתאים אלה לא ניתן לבצע עם מבחני גן כתב, שכן יש לא טכניקות יעילות לtransfection נויטרופילים. מבחני EMSA כבר בשימוש בנויטרופילים לחקור הפעלת פקטור גרעינית 12,13, עם זאת, במתודולוגיה זו היא מסובכת ויקרה משום שהיא כרוכה בשימוש בחומר רדיואקטיבי. Nucleofection היא טכניקה נוספת ששמשה successfully לtransfect מונוציטים 14. לפיכך, לפחות בתאוריה, הפעלת פקטור גרעינית יכולה להיות מזוהית בנויטרופילים ידי transfection (למרות יעילות נמוכה). עם זאת, טכניקה זו תהיה יקרה יותר, זמן רב וכנראה פחות כמותית. ניתוח מיקרוסקופי של תאי immunostained גם יכול לשמש כדי לזהות גורמים גרעיניים בגרעין. ואכן, יש לנו זוהיתי טרנסלוקציה NF-κB לתוך הגרעין זו דרך 15. למרבה הצער, טכניקה זו היא גם גוזלת זמן, פחות כמותית, ובכפוף להטיה של הצופה.
כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה המאפשרת זיהוי וכימות גורמים גרעיניים בגרעינים מבודדים וimmunolabeled ידי cytometry זרימה. אנו מתארים טכניקות לבודד הנויטרופילים מדם היקפי אנושי, לעורר התאים האלה באמצעות integrins או קולטנים FC עם נוגדנים כנגד הקולטן, לבודד וגרעיני immunolabel, גרעינים ולנתח ידי cytometry זרימה (F1 igure). השיטה כבר משמש בהצלחה לאיתור 15 NF-κB וElk-1 16 גורמים גרעיניים בגרעיני נויטרופילים. הרגישות של שיטה זו מאפשרת זיהוי של שינויים קטנים ברמות פקטור גרעיניים בגרעין. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לנתח את הרמה של גורמי שעתוק בגרעינים מסוגי תאים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בידוד של נויטרופילים (PMN) מדם אדם
- השתמש כ 20 מיליליטר דם אדם בפרין (10 U / ml) כנוגד קרישה. דם נאסף ממתנדבים בריאים במבוגרי venopuncture. כל הניסויים נעשו במסגרת אישור ועדת ביואתיקה במכון Biomédicas Investigaciones דה - UNAM.
- שים 2 מ"ל של 6% dextran T500 ב PBS לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל ולהוסיף 10 מ"ל של דם. מערבב על ידי היפוך הצינורית פעמים או שלוש ולתת לו לשבת במשך 45 דקות על מנת לאפשר לשקיעת דם.
- בצינור טרי 15 מיליליטר חרוטי צנטריפוגה לשים 5 מ"ל Ficoll-Paque.
- קח פלזמה יקוציט העשירה שנוצרה מעל אריתרוציטים משקעים, ופיפטה אותה בזהירות על גבי Ficoll-Paque יצירת שכבה שנייה. ודא שיש שני שלבים.
- צנטריפוגה ב XG 516 עבור 20 דקות ב 4 ° C. לאחר צנטריפוגה, בשלבי ביניים של פלזמה וFicoll-Paque יש שכבה של תאי mononuclear. Neutrophils נמצא בתחתית של התחתית.
- בטל supernatant, לשבור את תא גלולה על ידי קשה על הצינור כנגד מדפים, וresuspend התאים על ידי הוספת 10 מ"ל של קר (4 ° C) PBS הערה:. Resuspending תאים על ידי pipetting למעלה ולמטה אינו מומלצת, מאחר שזו גם ניזק לתאים.
- להעביר את השעית התא לצינור 50 מיליליטר חרוטי צנטריפוגה וצנטריפוגה XG ב 290 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- לשבור את התא הגלול כמו קודם ולהוסיף 10 מ"ל של קר (4 ° C) פתרון hypotonic (0.2% NaCl, 1% BSA, 20 Hepes מ"מ, pH = 7.4) לlyse אריתרוציטים. מערבב בעדינות מתערבל צינור ביד דקה אחת בדיוק.
- הוסף 10 מ"ל של קר (4 ° C) פתרון hypertonic (1.6% NaCl, 1% BSA, 20 HEPES מ"מ, pH = 7.4), לערבב וספירת התאים באמצעות hemocytometer (בדרך כלל> 95% הם PMN).
שים לב: שמור על הצינור עם השעית התא על קרח בעת לספור את התאים. - צנטריפוגה כמו קודם וresuspend PMN בשעת 107 תאים / מ"ל בקר (4 ° C) PBS. שמור על קרח.
הערה: נויטרופילים להישאר קיימא ותפקודי ב 4 מעלות צלזיוס במשך כ 6-8 שעות.
2. הפעלת PMN
- לשים 100 μl של השעית PMN (1 x 10 7 תאים / מ"ל) לתוך צינור 1.5 מ"ל אפנדורף.
הערה: דוגמיות צריכים להיעשות לפחות בכפילויות. פקדים שליליים רגילים צריכים לכלול נוגדן ראשון בלבד, ונוגדן משני בלבד. - הוסף הנוגדן אנטי המקביל integrin או נגד Fc רצפטור חד השבטי (MAB) בשעת 10 מיקרוגרם / מ"ל ולדגור על קרח במשך 15 דקות.
- שטוף PMN ידי הוספת 1 מ"ל של קר (4 ° C) PBS, צנטריפוגה XG ב 1743 (4500 סל"ד) בmicrocentrifuge, וaspirating supernatant.
- לשבור את תא הגלולה על ידי קשה על התחתית של התחתית כנגד מדפים, להוסיף 1 המ"ל PBS הקר, ולשטוף עוד שתי פעמים כמו בשלב קודם.
הערה: אלה שוטפים להסיר נוגדן מאוגד. - PMN resuspend באותה (ב) הנפח של itial חם (37 מעלות צלזיוס) PBS המכיל 60 מיקרוגרם / מ"ל של F (ab ') 2 עיזים אנטי עכבר IgG.
הערה: נוגדן IgG המשני אנטי העכבר יהיה לאגד את הנוגדן אנטי-1 רצפטור ויגרום crosslinking של הקולטן. - לדגור על 37 מעלות צלזיוס 1 עד 20 דקות, תלויות בגורם הגרעיני של עניין. לNF-κB בדרך כלל 15 דקות, ולאלק-1 בדרך כלל 5 דקות.
הערה: דגירת התאים ב 37 ° C crosslinking גורם קולט, שלא יכול לקחת את המקום ב 4 ° C. - הוסף 1 המ"ל PBS הקר וסרכזת 3 דקות ב1743 XG בmicrocentrifuge.
- הסרת supernatant
- הקפא PMN מייד באמבטית dry-ice/ethanol ולהשאיר אותם שם למשך 10 דקות.
3. בידוד וקיבוע של גרעינים
- Resuspend הקפוא PMN גלול ב קר μl 100 (4 מעלות צלזיוס) חיץ hypotonic (10 HEPES מ"מ, 10 המ"מימ KCl, 1.5 המ"מ MgCl 2, ו 1 mM הטרי מוסף DL-dithiothreitol [DTT], PH = 7.9). מומלץ לקחת את הצינורות שיצאו מאמבטית dry-ice/ethanol אחד אחד, ולנגב לנקות את התחתית של תחתית לפני ההוספה למאגר hypotonic.
- מניח על קרח, ולבדוק את שלמות גרעינים ע"י השאיר aliquot ההשעיה של גרעינים עם trypan כחול. גרעינים נראים עגולים וכחולים. PMN השלם לא מקבל מוכתם, ופסולת תא מופיעה כחלקיקים כחולים של צורה לא סדירה.
הערה: אם השעית גרעינים מכילה תאים שלמים או פסולת רבים, עדיף למחוק ההכנה ולחזור על התהליך עם דוגמה אחרת. - צנטריפוגה גרעינים ב775 XG (3,000 סל"ד) בmicrocentrifuge למשך 10 דקות בתוך חדר קר. בגרעיני נקודה זו טיפול מאוד שביר ונוסף יש לנקוט בשמירה על הדגימות קרות ולא צנטריפוגה בכוחות מוגזמים.
- הסרת supernatant ידי pipetting זהיר מאוד.
- הוסף 100 μl של paraformaldehyde 4% הקרים ב PBS לתקן גרעינים.
הערה: הגלולה מאוד רופפתד הוסיף למאגר הוא מספיק כדי resuspend הגרעינים. Pipetting למעלה ולמטה יש להימנע. - לדגור על קרח למשך 20 דקות.
- גרעיני Immunolabel עבור cytometry זרימה או לשמור אותם לתקופה של עד 24 שעות ב 4 ° C.
4. Immunolabeling גרעינים לניתוח cytometry זרימה
- צנטריפוגה גרעינים ב1743 XG (4500 סל"ד) בmicrocentrifuge ל1 דקות, ולהסיר supernatant ידי pipetting עדין מאוד.
- הוסף 100 μl של קר (4 ° C) 0.1% Triton X-100, paraformaldehyde 4% ב PBS לpermeabilize גרעינים. דגירה בקרח למשך 10 דקות.
- צנטריפוגה permeabilized גרעינים ב1743 XG בmicrocentrifuge ולהסיר את supernatant בזהירות. בשלב זה כדורי גרעינים לא מייחסים גם בתחתית של התחתית. מומלץ סרכזת שוב אם הגלולה מתרופפת.
- גרעיני resuspend ב 500 μl של סרום קר 4% עוברי שור (FBS) ב PBS לחסום אתרי קישור לא ספציפיים, ולדגור על קרח למשך 20 דקות. סרכזתגרעינים ב1743 XG ל3 דקות בmicrocentrifuge ולהסיר את supernatant בזהירות.
- Resuspend גרעינים ב100 μl של PBS הקר המכיל 4% FBS ו 2.5 מיקרוגרם / מ"ל של MAB נגד הגורם הגרעיני של עניין. לדגור על קרח למשך 20 דקות.
הערה: פקדים שליליים רגילים צריכה לכלול נוגדן גורם אנטי גרעיני בלבד, וFITC שכותרתו נוגדן משני בלבד. - שטוף פעמים עם 500 μl של PBS הקר עם 4% FBS וצנטריפוגה XG ב 1743 עבור 3 דקות.
- הסר את supernatant מאוד בזהירות, גרעיני resuspend ב 100 μl של הקור PBS המכיל 4% FBS ו 10 מיקרוגרם / מ"ל של הנוגדן המשני המקביל FITC כותרתו, ולדגור על קרח למשך 20 דקות.
- שטוף פעמים עם גרעינים 500 μl של הקור PBS עם 4% FBS כמו בשלב קודם.
- Resuspend גרעינים ב400 μl של paraformaldehyde 4% הקרים ב PBS.
הערה: גרעינים ממוקמים בparaformaldehyde כדי לאפשר את המדגם כדי להיות מאוחסן במשך מספר ימים ללא זיהוםבעיות שיכולות להתרחש בנוכחות הסרום. - לנתח באופן מיידי על ידי cytometry זרימה או בחנות בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה ימים.
5. ניתוח זרימת cytometry
- נתח גרעיני immunolabeled בcytometer זרימה כגון FACScan (הקיטון דיקינסון; פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי) או מכשיר דומה.
- התאם את גדרות רכישה ל: FSC ביומן בקנה מידה 10-1, SSC ביומן בקנה מידה 196, וגרעינים בשער הדוט עלילה.
- תרכוש 10,000 גרעינים למדגם.
- נתח את הקרינה של גרעינים FITC מוכתמים דרך ערוץ FL-1 (506 ננומטר) המוגדר ביומן בקנה מידה ב 400.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטת הטיהור המתוארת כאן בדרך כלל מספק נויטרופילים unstimulated (PMN) עם טוהר יותר מ 95% (איור 1 א). PMN מבודד אז יכול להיות מגורה על ידי קולטנים מסוימים crosslinking עם נוגדנים חד שבטיים ספציפיים. יש לנו מגורה PMN דרך קולטנים וintegrins FC (1B איור). ברגע מגורה, PMN הם lysed וגרעינים מבודדים עם תשואות גבוהות. אז גרעיני immunolabeled לפקטור גרעיני מסוים, כגון גורם κB הגרעיני (NF-κB), עם נוגדנים ספציפיים (1B איור).
גרעינים יכולים להיות מזוהים בקלות כאוכלוסייה שונה מPMN השלם בcytometer הזרימה עם נקודה לעלילה (איור 2 א). בPMN נח ברמה בסיסית של NF-κB נמצאת בגרעין התא (איור 2 ב '). על ידי גירוי crosslinking β1 integrins, NF-κB הוא translocated לגרעין וזה increm אף אוזן גרון בגרעין NF-κB הוא זוהה כגידול בפלואורסצנטי (איור 2 ב '). באופן דומה, על ידי גירוי של PMN crosslinking β2 integrins נגרם גם הפעלת NF-κB כפי שצוין על ידי גידול בפלואורסצנטי (האיור 2C). הרגישות של שיטה זו מאפשרת זיהוי של שינויים קטנים ברמות פקטור גרעיניים כפי שרואה מעובדה שβ1 integrins, הנקשר לחלבונים תאיים מטריקס כמו פיברונקטין הפעלה, מושרה חזקה NF-κB מβ2 integrins, אשר נקלט על ידי מולקולות דבקות על תאים אחרים (השווה איורים ו2B 2C).
שיטה זו גם שמשה בהצלחה לאיתור 15 NF-κB וElk-1 16 גורמים גרעיניים בגרעינים בודדים לאחר גירוי הקולטן Fc של PMN. שיטה זו היא פשוטה וחסכונית, ובכך זה יכול בקלות להיות שונה כדי לנתח גורמים גרעיניים בתאים מסוגים אחרים.
תוכן "fo: לשמור-together.within עמודים =" תמיד ">
איור 1. ייצוג סכמטי של טיהור נויטרופילים (PMN) מדם, הגירוי של תאים, הבידוד של גרעינים, וimmunolabeling גורמים גרעיניים בגרעינים מבודדים.) דם הפרין טופל מעורבב עם dextran לצטמד אריתרוציטים. לאחר משקע אריתרוציטים, פלזמת יקוציט העשיר היא על גבי תאי הדם האדומים. פלזמת יקוציט עשיר זה מועבר ושכבות על גבי Ficoll-Paque בצינור אחר. לאחר צנטריפוגה, שכבת תאי mononuclear (MNC) נמצאת בשלבי ביניים של פלזמה וFicoll-Paque. PMN נמצאים בחלק התחתון של הצינור. B) המבודד PMN מומרצות על ידי קולטנים crosslinking תא קרום עם נוגדנים חד שבטיים ספציפיים (MAB) (כתום) ונוגדנים משני (ירוק כהה). גורם הגרעיני kappa B (NF-κB) מפריד מIκB וtranslocates מעכבו לתוך הגרעין. אז גרעינים מבודדים, permeabilized וimmunolabeled נגד NF-κB או אחר גורם גרעיני עם MAB ספציפי (צהוב), ונוגדנים משניים FITC מתויגים-(אור הירוק). גרעינים קבועים מנותחים cytometry זרימה (FACS). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. ניתוח של הפעלת NF-κB בנויטרופילים (PMN).) PMN השלם (פנל שמאלי) או גרעינים מבודדים (לוח ימני) מופיע כשתי אוכלוסיות שונות בגרפי cytometry זרימת הדוט עלילה. תאים וגרעינים ניתן לנתח באופן עצמאי על ידייצירת שערים שונים, R1 (אדום) לתאים שלמים, וR2 (כחול) לגרעינים מבודדים.) גרעיני B ו-C המבודדים מPMN היו immunolabeled לNF-κB (P50 מקטע), לפני (קו מקווקו ירוק), או לאחר תאים הופעלו על ידי cross-linking β1 integrins (ב ') עם הנוגדן חד השבטי הספציפי TS2/16 (קו כחול); או β2 integrins (C) עם הנוגדן חד שבטי הספציפי IB4 (קו אדום). התחום האפור הוא פלואורסצנטי הבזליים מהנוגדן המשני FITC כותרתו לבד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת הטיהור המתוארת כאן מאפשרת בידוד של נויטרופילים unstimulated (PMN) עם טוהר יותר מ 95% (הערכה על ידי תצפית מיקרוסקופית), בזמן קצר. לפעמים הנויטרופילים יכולים להיות מזוהמים על ידי אריתרוציטים אם האחרון לא lysed לחלוטין. זה בדרך כלל אינו משפיע על הטכניקה, שכן בקלות ניתן להבחין אריתרוציטים וPMN כאוכלוסיות תאים שונות על ידי cytometry זרימה. PMN מבודד אז יכול להיות מגורה על ידי קולטנים מסוימים crosslinking עם נוגדנים חד שבטיים ספציפיים. למעשה, PMN יכול גם להיות מגורה על ידי אמצעים תרופתיים או על ידי הדבקה על מצעים שונים או תאים אחרים. השיטה שהוצגה כאן יכולה לשמש כדי לנתח מסלולי איתות שמובילים לשינויים של גורמים גרעיניים בגרעיני התאים PMN לאחר שמופעלים על ידי כמעט כל גירוי ביולוגי רלוונטי.
ברגע PMN מומרצים, השיטה המתוארת במאמר זה מאפשרת מהיר וefficiטיהור ent של גרעינים ולזיהוי, בגרעינים אלה של NF-κB ידי immunofluorescence וניתוח cytometry זרימה. לאחר הגירוי של הקולטנים PMN מסוימים, NF-κB בציטופלסמה הוא שוחרר מIκB מעכבו, ולאחר מכן traslocated לתוך הגרעין (האיור 1B). לכן, ברמה של הפעלת NF-κB נקבעת על ידי הכמות נוכחית NF-κB בגרעין. מכיוון ששיטה זו יכולה לזהות ולמדוד את הכמות של NF-κB בגרעין, זה יכול לקבוע בקלות הפעלה של הפקטור הגרעיני הזה. השיטה באופן דומה ניתן לזהות הפעלה של גורמים גרעיניים אחרים, כאשר ההפעלה שלהם היא צמודה לשינויים ברמות גרעיניות. הפעלת שינויים של גורמים גרעיניים יכולה להיות בגלל שינויים בכמות של הווה גורם בגרעין, כפי שהוא במקרה של NF-kB, או שינויים כגון זרחון, במבנה המולקולרי של הפקטור, כפי שהוא במקרה של Elk-1. שיטה זו יכולה לשמש כדי לזהות גhanges של רמות גרעיניות של כל מולקולה שנוגדן ספציפי זמין.
שיטה זו מניבה אוכלוסיית גרעין טהורה בצורה פשוטה ומהירה. תאים מוקפאים וlysed בחיץ hypotonic שפרץ את התאים פתוחים ומשאיר את הגרעינים בשלמותה. PMN השלם או גרעינים מבודדים מופיע בדרך כלל כשתי אוכלוסיות שונות בגרפי cytometry זרימת הדוט עלילה. תאים וגרעינים ניתן לנתח באופן עצמאי על ידי יצירת שערים שונים לתאים שלמים, ולגרעינים מבודדים. במדגם תא שלם שער נוצר מסביב לאזור שבו רוב התאים יופיעו. באופן דומה, עם מדגם גרעיני שער נוצר מסביב לאזור שבו רוב הגרעינים יופיעו. בדרך כלל שני השערים האלה נמצאים במקומות שונים של גרף הדוט העלילה. חלקיקים שאותרו מהשערים האלה לפעמים, הם בדרך כלל תא או פסולת גרעינים, והם יישארו מחוץ לניתוח. אם שערי התא וגרעינים חופפים, זה בדרך כלל אומר שהכנת הגרעינים היא לא CLE. ניתוח של הכנת גרעינים זה לא אמין, ועדיף לחזור על התהליך עם חוצצים טריים.
השיטה פותחה לעבוד עם PMN האנושי, אבל זה גם יושם בהצלחה לשורות תאים שונות של מוצא יקוציט 15. השיטה יכולה בקלות להיות מותאמת לבודד את גרעינים מסוגי תאים שונים. חשוב להתחיל את התהליך עם מינימום של 1 10 x 6 תאים, כדי להשיג מספיק גרעינים לניתוח cytometry זרימה יעילה. אם מספר קטן של גרעינים מתקבלים בסופו של דבר הוא יותר טוב באופן שגרתי, כדי להפעיל את השיטה עם 3 10 x 6 תאים.
במהלך שלב תמוגה, תאים קפואים אסור להפשיר. כתוצאה מכך התשואה נמוכה בשל הידרדרות תא. לכן, מומלץ לקחת את צינור אחד בכל פעם שיצאה מאמבטית dry-ice/ethanol לlyse תאים. כמו כן, חשוב לנגב לנקות את החלק החיצוני של הצינור לפני הוספת תמוגה hypotonicחיץ. כשזה לא נעשה, החיץ לעתים קופא בצינור, נותן תמוגה תא לא יעילה וכתוצאה מהכנות גרעינים כי הם מזוהמים על ידי תאים שלמים. ובכל זאת, זה לא בעיה רצינית בהתחשב בעובדה שברוב מקרי תאים וגרעינים שלמים יכולים להיות מופרדים על ידי cytometry זרימה.
בגלל גרעינים הם מאוד שבירים לפני שהם קבועים, זה חשוב שיש את כל פתרוני החיץ קר ב 4 ° C על ידי שמירה על אותם בקרח. לאחר צנטריפוגה, כדורי גרעינים הם לעתים רופפים בתחתית של התחתית, ולכן טיפול נוסף יש לנקוט בעת הסרת supernatant. זה נעשה טוב יותר עם micropipette מאשר עם שאיפת אבק. בהזדמנות, הצינור יכול להיות centrifuged שוב, אבל כוחות צנטריפוגה המומלצות לא צריכים להיות מוגזמים, כי ניזק זה הגרעינים.
השיטה זוהתה הפעלת NF-κB באמצעות נוגדנים ספציפיים למקטע P50 (איור 2), וalso p65 המקטע 15 של הפקטור הגרעיני הזה. כמו כן, כימות של הפעלה קולטנית-יזמה גרעינית של ERK וElk-1 השיגה גם בהצלחה באמצעות שיטה 16 זה, באמצעות נוגדנים הספציפיים המתאימים נגד מולקולות אלה. בנוסף, את הרגישות של זיהוי שיטה אפשרה זה של שינויים קטנים ברמות גרעיניות NF-κB, עקב גירוי הפרש של PMN על ידי סוגים שונים של integrins (איור 2), וכן בשל עיכוב תרופתי של הקולטן Fc-יזמה מסלולי איתות 16 . שילוב של נוגדן ספציפי טוב ויעיל שכותרת משנית נוגדן-fluorescently מספק רגישות רבה ומאפשר זיהוי של שינויים קטנים בסך של הגורם הגרעיני של ריבית בתוך גרעינים. זה מאפשר השוואת כמותית של רמות הפקטור הגרעיני לפני ואחרי גירוי תנאים שונים. כמו כן, בשיטה זו ניתן לזהות במבודדת נוclei, כמעט כל מולקולה שכנגדו נוגדן ספציפי טוב היא זמין. יתר על כן, חלק immunolabeling ניתן לפשט באמצעות נוגדנים שכותרת ישירות עם fluorochome, אשר בנוסף ישפר רגישות. לבסוף, השיטה מציגה גמישות רבה משום שניתן להשתמש fluorochomes רב ושונים. לכן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרים רבים ושונים אותות transduction שכרוכים בשינויים ברמות חלבון בגרעין.
לסיכום, תחולתו והרגישות הרחבה של השיטה המתוארת במאמר זה, למקם אותו כאופציה פשוטה וחסכונית להעברת אותות מחקרים הכרוכים בשינויים ברמות חלבון בגרעין של מגוון רחב של סוגי תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לננסי מורה לקבלת הסיוע הטכני שלה.
עבודה זו מומנה על ידי מענקי מחקר 48573-M ו168098 מConsejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, מקסיקו, ועל ידי מענקי IN212308 וIN205311-2 מDireccion הגנרל דה Asuntos דל האישי Academico, האוניברסיטה הלאומית האוטונומית של מקסיקו, מקסיקו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur | |
References
- Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Naussef, W. M. How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view. Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).
- Scapini, P., et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).
- Hamilton, T., et al. Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression. J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).
- Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W.
- Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
- Green, D. R. Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge. Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).
- Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival. J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).
- Valente, P., et al. TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB. Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).
- Choi, M., et al. Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis. Blood. 102, 2259-2267 (2003).
- Wang, K., et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways. J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).
- Garcia-Garcia, E., Rosales, C. Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method. J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils. J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).
