Summary
Nøytrofiler er de mest tallrike leukocytter i blod. Nøytrofile har transkripsjonelt regulert funksjoner som produksjon av proinflammatoriske cytokiner og hemming av apoptose. Disse funksjonene kan studeres med metoden som presenteres her, som tillater påvisning og kvantifisering av kjernefysiske faktorer ved flowcytometri i isolerte kjerner
Abstract
Nøytrofiler er de mest tallrike leukocytter i perifert blod. Disse cellene er de første til å vises på nettsteder for betennelse og infeksjon, og ble dermed den første linjen i forsvaret mot invaderende mikroorganismer. Nøytrofiler besitter viktige antimikrobielle funksjoner som fagocytose, frigjøring av lytiske enzymer, og produksjon av reaktive oksygenarter. I tillegg til disse viktige forsvar funksjonene, nøytrofiler utføre andre oppgaver som respons på infeksjon, for eksempel produksjon av proinflammatoriske cytokiner og hemming av apoptose. Cytokiner rekruttere andre leukocytter som hjelper fjerne infeksjonen, og hemming av apoptose lar nøytrofile å leve lenger på stedet av infeksjon. Disse funksjonene er regulert på nivået av transkripsjon. Men fordi nøytrofiler er kortvarige cellene, kan studiet av transkripsjonelt regulert responser i disse celler ikke utføres med konvensjonelle rapportørgen metoder siden det er ingen effektivstrekkelig teknikker for nøytrofile transfeksjon. Her presenterer vi en enkel og effektiv metode som gjør det mulig påvisning og kvantifisering av kjernefysiske faktorer i isolert og immunolabeled kjerner med flowcytometri. Vi beskriver teknikker for å isolere rene nøytrofile granulocytter fra humant perifert blod, stimulere disse cellene med anti-reseptor-antistoffer, isolere og immunolabel atomkjerner, og analysere kjerner ved strømningscytometri. Metoden har blitt brukt til å påvise NF-κB og elg-1 kjernefysiske faktorer i kjerner fra nøytrofile og andre celletyper. Således representerer denne metoden et alternativ for å analysere aktivering av transkripsjonsfaktorer i isolert kjerner fra en rekke celletyper.
Introduction
Nøytrofile er de mest tallrike leukocytter i perifert blod en. Ved betennelse og infeksjon nøytrofile er de første cellene til å vises på den berørte området der de opptrer som den første linjen i forsvaret to. Nøytrofile har flere antimikrobielle mekanismer 3 inkludert fagocytose, produksjon av reaktive oksygenforbindelser, utgivelsen av lytiske enzymer ved degranulation, og produksjon av proinflammatoriske cytokiner 4,5. Nøytrofile er kortlivede celler som blir raskt aktiveres gjennom signalisering fra ulike celleoverflatereseptorer. Selv nøytrofile er vurdert terminal celler på grunn av deres korte levetid og fordi de gjennomgå apoptose mindre aktivert under den inflammatoriske prosessen 6, er det nå klart at de kan også endre deres fenotype ved å endre nivået av transkripsjon av bestemte gener. Produksjonen av cytokiner 5 og inhibering av apoptose 7,8 er to jegmportant aktivering-avhengige cellefunksjoner regulert på nivået av transkripsjon i nøytrofile. Nukleær faktor κB (NF-κB) deltar i den transkripsjonelle kontroll av cytokin produksjon 4 og i reguleringen av celleoverlevelse og apoptose 9-11 i ulike celletyper.
De signalveier som fører til kjernefysisk faktor aktivering er vanligvis studert av reporter genet analyser eller elektroforetiske mobilitet skift analyser (EMSA). Men fordi nøytrofiler er kortvarige cellene, kan studiet av transkripsjonelt regulert responser i disse cellene ikke utføres med rapportørgen assays, siden det er ingen effektiv teknikk for nøytrofil transfeksjon. EMSA assays har blitt brukt i nøytrofile å utforske kjernefysiske faktor aktivering 12,13, men er denne metodikken komplisert og dyrt fordi det innebærer bruk av radioaktivt materiale. Nucleofection er en annen teknikk som har blitt brukt successfully å transfektere monocytter 14. Dermed hvert fall i teorien, kunne kjernefysiske faktor aktivering påvises i nøytrofile etter transfeksjon (til tross for lav effektivitet). Men ville denne teknikken bli dyrere, tidkrevende og trolig mindre kvantitative. Mikroskopisk analyse av immunostained celler kan også brukes til å detektere kjernefysiske faktorer i kjernen. Faktisk har vi oppdaget NF-κB translokasjon inn i kjernen på denne måten 15. Dessverre er denne teknikken også tidkrevende, mindre kvantitative, og underlagt observatørens bias.
Her presenterer vi en enkel og effektiv metode som gjør det mulig påvisning og kvantifisering av kjernefysiske faktorer i isolert og immunolabeled kjerner med flowcytometri. Vi beskriver teknikker for å isolere nøytrofile granulocytter fra humant perifert blod, stimulere disse cellene via integriner eller FC reseptorer med anti-reseptor antistoffer, isolere og immunolabel kjerner, og analysere kjerner med flowcytometri (Figur 1). Metoden har blitt brukt til å påvise NF-κB 15 og elg-1 16 kjernefysiske faktorer i nøytrofile kjerner. Sensitiviteten av denne metoden tillater påvisning av små endringer i nukleære faktor nivåer i kjernen. Denne metoden kan også brukes til å analysere nivået av transkripsjonsfaktorer i kjerner fra andre celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering av nøytrofiler (PMN) fra humant blod
- Bruker ca 20 ml humant blod med heparin (10 U / ml) som antikoagulasjonsmiddel. Blod ble samlet inn fra voksne, friske frivillige ved venopuncture. Alle forsøk ble gjort under godkjenning av bioetikkomité ved Instituto de Investigaciones Biomédicas - UNAM.
- Sette 2 ml 6% dekstran T500 i PBS til en 15 ml konisk sentrifugerør, og tilsettes 10 ml av blod. Bland ved å snu røret to eller tre ganger, og la den sitte i 45 minutter for å tillate senkning.
- I en frisk 15 ml konisk sentrifugerør sette 5 ml Ficoll-Paque.
- Ta leukocytt-rik plasma som dannet ovenfor sedimenteres erytrocytter, og nøye pipetteres den på toppen av Ficoll-Paque danner et andre lag. Pass på at det er to faser.
- Sentrifuger ved 516 xg i 20 min ved 4 ° C. Etter sentrifugering ved interfase av plasma og Ficoll-Paque det er et lag av mononukleære celler. Neutrophils er på bunnen av røret.
- Eliminer supernatant bryte cellepelleten ved å tappe røret mot en reol og resuspender cellene ved tilsetning av 10 ml kald (4 ° C) PBS OBS:. Blanding cellene ved å pipettere opp og ned er ikke anbefalt siden dette er for skadelig for cellene.
- Overfør cellesuspensjonen til en 50 ml konisk sentrifugerør og sentrifuger ved 290 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Bryte cellepelleten som før og tilsett 10 ml kald (4 ° C) hypoton løsning (0,2% NaCl, 1% BSA, 20 mM Hepes, pH = 7,4) for å lysere erytrocytter. Bland av virvlende røret forsiktig for hånd i nøyaktig ett minutt.
- Tilsett 10 ml kald (4 ° C) hyperton oppløsning (1,6% NaCl, 1% BSA, 20 mM HEPES, pH = 7,4), bland og telle cellene ved hjelp av en hemocytometer (vanligvis> 95% er PMN).
Merk: Hold røret med cellesuspensjonen på isen mens telle cellene. - Sentrifuger som før og resuspender PMN ved 107 celle / ml i kald (4 ° C) PBS. Hold på isen.
Merk: Neutrofiler forblir levedyktig og funksjonelle ved 4 ° C i ca 6-8 timer.
2. Aktivering PMN
- Put 100fil PMN suspensjon (1 x 10 7 celler / ml) i et 1,5 ml Eppendorf-rør.
Merk: Prøverør bør gjøres minst i duplikater. Vanlige negative kontroller bør omfatte første antistoff bare, og sekundært antistoff bare. - Til det tilhørende anti-integrin eller anti-Fc-reseptor monoklonalt antistoff (mAb) ved 10 ug / ml og inkuber på is i 15 min.
- Vask PMN ved tilsetning av 1 ml kald (4 ° C) PBS, sentrifugering ved 1743 xg (4.500 rpm) i en mikrosentrifuge, og aspirering av supernatanten.
- Bryte cellepelleten ved å tappe rørbunnen mot en rack, tilsett 1 ml kaldt PBS, og vask to ganger som i tidligere trinn.
Merk: Disse vasker fjerne ubundet antistoff. - Gjensuspender PMN i samme (iitial) volum av varm (37 ° C) PBS inneholdende 60 ug / ml av F (ab ') 2 geit anti-mus IgG.
Merk: Den sekundære anti-mus IgG-antistoff vil binde seg til det første anti-reseptor antistoff og vil forårsake tverrbinding av reseptoren. - Inkuber ved 37 ° C i 1 til 20 min, avhengig kjernefysiske faktor av interesse. På NF-κB vanligvis 15 minutter, og for Elk-1 vanligvis 5 min.
Merk: inkubere cellene ved 37 ° C induserer reseptor tverrbindingen, som ikke kan finne sted ved 4 ° C. - Tilsett 1 ml kaldt PBS og sentrifuger 3 min ved 1743 xg i mikrosentrifuge.
- Fjern supernatant
- Frys PMN umiddelbart i dry-ice/ethanol bad og holde dem der i 10 min.
3. Isolering og Fiksering av Nuclei
- Gjensuspender frossen PMN pellet i 100 pl kald (4 ° C) hypoton buffer (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, og 1 mM fersk-added DL-ditiotreitol [DTT], PH = 7,9). Det anbefales å ta rørene ut av dry-ice/ethanol bad en etter en, og for å tørke av bunnen av røret før tilsetning av hypoton buffer.
- Plasser på isen, og sjekk for kjerner integritet ved farging en delmengde av kjernene suspensjon med trypan blå. Kjerner se runde og blå. Intakt PMN ikke får farget, og celleavfall vises som blå partikler av uregelmessig form.
Merk: Hvis kjerner suspensjon inneholder mange intakte celler og rusk, er det bedre å forkaste forberedelse og gjenta prosedyren med en ny prøve. - Sentrifuger kjerner på 775 xg (3000 rpm) i mikrosentrifuge i 10 min inne i et kaldt rom. På dette punktet kjerner er svært skjøre og ekstra forsiktighet bør utvises i å holde prøvene kaldt og ikke sentrifugering ved overdreven styrker.
- Fjern supernatanten med svært forsiktig pipettering.
- Legg 100 pl kald 4% paraformaldehyd i PBS for å fikse atomkjerner.
Merk: pellet er løs svært end legge buffer er nok til å resuspendere kjerner. Pipettering opp og ned skal unngås. - Inkuber på is i 20 min.
- Immunolabel kjerner for flowcytometri eller holde dem i opptil 24 timer ved 4 ° C.
4. Nuclei Immunolabeling for flowcytometri analyse
- Sentrifuger kjerner på 1743 xg (4500 rpm) i mikrosentrifuge i 1 min, og fjern supernatanten med svært milde pipettering.
- Legg 100 pl kald (4 ° C) 0,1% Triton X-100, 4% paraformaldehyd i PBS for å permeabilize atomkjerner. Inkuber i is i 10 min.
- Sentrifuge permeabilized kjerner på 1743 xg i mikrosentrifuge og forsiktig fjerne supernatant. På dette punktet nuclei pellets ikke fester godt på bunnen av røret. Det anbefales å sentrifuger på nytt hvis pellet blir løs.
- Gjensuspender atomkjerner i 500 ul kald 4% føtalt bovint serum (FBS) i PBS for å blokkere uspesifikke bindingsseter og inkuber på is i 20 min. Sentrifugerkjerner på 1743 xg i 3 min i mikrosentrifuge og fjern forsiktig supernatanten.
- Resuspender atomkjerner i 100 ul kald PBS inneholdende 4% FBS og 2,5 ug / ml av den mAb mot kjernefysiske faktor av interesse. Inkuber på is i 20 min.
Merk: Vanlig negative kontroller bør omfatte anti-kjernefysiske faktor antistoff bare, og FITC-merket sekundært antistoff bare. - Vask to ganger med 500 ul kald PBS med 4% FBS og sentrifugering ved 1743 xg i 3 min.
- Supernatanten fjernes nøye, resuspender atomkjerner i 100 ul kald PBS inneholdende 4% FBS og 10 ug / ml av den tilsvarende FITC-merket sekundært antistoff, og inkuber på is i 20 min.
- Vask to ganger med atomkjerner 500 ul kald PBS med 4% FBS som i forrige trinn.
- Resuspender atomkjerner i 400 ul kald 4% paraformaldehyd i PBS.
Merk: Nuclei plasseres i paraformaldehyd å tillate prøven å bli lagret i flere dager uten kontamineringproblemer som kan oppstå i nærvær av serum. - Analyser umiddelbart ved flowcytometri eller butikk i mørket ved 4 ° C i opptil tre dager.
5. Flowcytometri analyse
- Analysere immunolabeled atomkjerner i et strømningscytometer slikt FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) eller lignende apparat.
- Juster kjøp innstillinger til: FSC på log-skala på 10-1, SSC på log-skala på 196, og gate kjerner i en dot-plot.
- Erverve titusen kjerner per prøve.
- Analyser fluorescens av FITC-farget kjerner gjennom FL-1 kanal (506 nm) satt til log-skala på 400.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rensemetoden beskrives her gir vanligvis ustimulert nøytrofiler (PMN) med renhet større enn 95% (figur 1A). Isolert PMN kan deretter bli stimulert av tverrbindende bestemte reseptorer med spesifikke monoklonale antistoffer. Vi har stimulert PMN gjennom Fc-reseptorer og integriner (figur 1B). Når stimulert, er PMN lysert og kjerner isoleres med høye utbytter. Kjerner deretter immunolabeled for en bestemt kjernefysiske faktor, slik som kjernefysiske faktor κB (NF-κB), med spesifikke antistoffer (figur 1B).
Kjerner kan lett gjenkjennes som en annen befolkning fra intakt PMN i strømningscytometeret med en prikk-plott (figur 2A). I hvile PMN en basal nivå av NF-κB er funnet i cellekjernen (figur 2B). Ved stimulering av crosslinking β1 integriner er NF-κB translocated til kjernen og dette INKREM.GIVER ent i kjernefysiske NF-κB er oppdaget som en økning i fluorescens (figur 2B). Tilsvarende, stimulering av PMN ved kryssbinding β2 integriner også indusert NF-κB aktivering som indikert ved en økning i fluorescens (figur 2C). Sensitiviteten av denne metoden tillater påvisning av små endringer i nukleære faktor nivåer som dokumentert ved at β1 integriner, som binder ekstracellulære matriksproteiner som fibronektin, indusert sterkere NF-κB aktivering enn β2 integriner, som binder til adhesjonsmolekyler på andre celler (sammenlign figurene 2B og 2C).
Denne metoden har også blitt brukt til å påvise NF-κB 15 og elg-1 16 kjernefysiske faktorer i isolerte kjerner etter Fc reseptor stimulering av PMN. Denne metoden er enkel og økonomisk, slik at det lett kan endres for å analysere kjernefysiske faktorer i andre celletyper.
innhold "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figur 1. Skjematisk representasjon av nøytrofile (PMN) rensing fra blod, stimulering av celler, isolering av kjerner, og immunolabeling av kjernefysiske faktorer i isolerte kjerner. A) Heparin-behandlet blod blandes med dekstran å agglutinere erytrocytter. Etter erytrocytter sediment er leukocytt-rik plasma på toppen av de røde cellene. Dette leukocytt-rik plasma overføres og lagvis på toppen av Ficoll-Paque i et annet rør. Etter sentrifugering blir et lag av mononukleære celler (MNC) funnet ved interfase av plasma og Ficoll-Paque. PMN er funnet på bunnen av røret. B) isolert PMN blir stimulert av tverrbindende celle-membranreseptorer med spesifikke monoklonale antistoffer (mAb) (oransje) og en sekundær antistoff (mørkegrønt). Kjernefysiske faktor kappa B (NF-κB) skiller seg fra sin hemmer IκB og translocates inn i kjernen. Kjerner deretter isolert, permeabilized og immunolabeled mot NF-κB eller annen kjernefysiske faktor med en spesifikk mAb (gult), og en FITC-merket sekundært antistoff (lys grønn). Fast kjerner analyseres med flowcytometri (FACS). Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Analyse av NF-κB aktivering i nøytrofile (PMN). A) Intakt PMN (venstre panel) eller isolert kjerner (høyre panel) vises som to forskjellige populasjoner i flowcytometri dot-plot grafer. Celler og kjerner kan analyseres uavhengig avskape ulike porter, R1 (rød) for intakte celler, og R2 (blå) for isolert cellekjerner. B og C) Nuclei isolert fra PMN ble immunolabeled på NF-κB (P50 subenhet), før (grønn stiplet linje), eller etter celler ble aktivert ved kryssbinding β1 integriner (B) med det spesifikke monoklonale antistoff TS2/16 (blå linje), eller β2 integriner (C) med det spesifikke monoklonale antistoff IB4 (rød linje). Det grå området er basal fluorescens fra FITC-merket sekundært antistoff alene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rensemetoden beskrives her tillater isolering av ustimulert nøytrofiler (PMN) med renhet større enn 95% (vurdert ved mikroskopisk observasjon), i en kort tid. Iblant nøytrofiler kan være forurenset av erytrocytter dersom sistnevnte ikke lyseres helt. Dette påvirker vanligvis ikke teknikken, siden erytrocytter og PMN lett kan identifiseres som egne cellepopulasjoner ved flowcytometri. Isolert PMN kan deretter bli stimulert av tverrbindende bestemte reseptorer med spesifikke monoklonale antistoffer. Faktisk kan PMN også stimuleres ved farmakologiske metoder eller ved adhesjon til forskjellige substrater eller andre celler. Metoden presenteres her kan brukes til å analysere signalveier som fører til endringer av kjernefysiske faktorer i PMN kjerner etter celle blir aktivert ved praktisk talt en hvilken som helst relevant biologisk stimulans.
Når PMN blir stimulert, tillater metoden beskrevet i denne papir for den raske og effektivient rensing av kjerner og for påvisning, i disse kjerner av NF-κB ved immunfluorescens og strømningscytometri analyse. Etter PMN stimulering av visse reseptorer, er NF-κB i cytoplasma løslatt fra inhibitor IκB og deretter traslocated inn i kjernen (figur 1B). Således, er nivået av NF-κB aktivering bestemt av mengden av NF-κB tilstede i kjernen. Fordi denne metoden kan oppdage og måle mengden av NF-κB i kjernen, kan det lett fastslå aktivering av denne kjernefysiske faktor. Fremgangsmåten kan på lignende måte detektere aktivering av andre nukleære faktorer, når deres aktivering er knyttet til endringer i kjernefysiske nivåer. Aktivering endringer av nukleære faktorer kan være grunnet endringer i mengden av faktor tilstede i kjernen, som det er tilfelle for NF-kB, eller endringer som fosforylering, i molekylstrukturen av faktor, som det er tilfelle for elg-1. Denne metoden kan brukes til å oppdage cHanges kjernefysiske nivåer av ethvert molekyl som et spesifikt antistoff er tilgjengelig.
Denne metoden gir en ren kjerner befolkning på en enkel og rask måte. Cellene er frosset og lyseres i en hypoton buffer som brast cellene åpen og etterlater intakt kjerner. Intakt PMN eller isolert kjerner vanligvis vises som to forskjellige populasjoner i flowcytometri dot-plot grafer. Celler og kjerner kan analyseres uavhengig ved å lage ulike porter for intakte celler, og for isolerte kjerner. I en intakt celleprøve en gate er skapt rundt det området hvor flest celler vises. Tilsvarende med en atomkjerner prøve en gate er opprettet rundt området der de fleste kjerner vises. Normalt disse to portene er på forskjellige steder i dot-plot grafen. Partikler som er noen ganger oppdaget av disse portene, er vanligvis celle eller atomkjerner rusk, og de er utelatt av analysen. Hvis cellen og kjerner porter overlapper, betyr det vanligvis at kjernene forberedelse er ikke cleen. Analyse av denne atomkjerner preparatet ikke er pålitelig, og det er bedre å gjenta prosedyren med ferske buffere.
Metoden ble utviklet for bruk med menneskelig PMN, men det har også blitt brukt til forskjellige cellelinjer av leukocytt opprinnelse 15. Fremgangsmåten kan lett tilpasses for å isolere kjerner fra ulike celletyper. Det er viktig å starte prosedyren med et minimum av 1 x 10 6 celler, til å skaffe nok atomkjerner for en effektiv strømningscytometri analyse. Hvis små mengder atomkjerner oppnås på slutten, er det bedre å rutinemessig starte metoden med 3 x 10 6 celler.
Under lysis skritt, bør frosne celler ikke få lov til å tine. Dette resulterer i lavt utbytte på grunn av celle degradering. Således, er det anbefalt å ta ett rør av gangen ut av dry-ice/ethanol badekaret å lysere celler. Dessuten er det viktig å tørke av utsiden av røret før utlegging av hypoton lysisbuffer. Når dette ikke er gjort, fryser bufferen iblant i røret, noe som gir en ineffektiv cellelyse og resulterer i nuclei preparater som er forurenset av intakte celler. Likevel, dette er ikke et alvorlig problem gitt at i de fleste tilfeller intakte celler og kjerner kan separeres ved flowcytometri.
Fordi atomkjerner er svært skjøre før de blir fast, er det viktig å ha alle bufferoppløsninger kaldt ved 4 ° C ved å holde dem i is. Etter sentrifugering, atomkjerner pellets er iblant løs ved bunnen av røret, bør så ekstra forsiktighet utvises når fjerning av supernatanten. Dette er bedre gjøres med en mikropipette enn med vakuumaspirasjon. Noen ganger kan røret sentrifugeres igjen, men de anbefalte sentrifugering styrker bør ikke være overdreven fordi dette skader kjerner.
Metoden oppdaget NF-κB aktivering ved hjelp av antistoffer spesifikke for P50 subenhet (figur 2), og also P65-subenheten 15 i denne kjernefysiske faktor. Også, ble kvantifisering av reseptor-initiert kjernefysiske aktivering av ERK og Elk-1 også med hell oppnådd gjennom denne metoden 16, ved hjelp av de tilsvarende spesifikke antistoffer mot disse molekylene. I tillegg, følsomheten av denne metoden tillot påvisning av små endringer i NF-κB kjernefysiske nivåer, grunnet differensial stimulering av PMN ved ulike typer integriner (figur 2), og også på grunn av hemming av farmakologiske Fc reseptor-initiert signalveier 16 . Kombinasjonen av en god spesifikt antistoff og et effektivt fluorescently-merket sekundært antistoff gir stor følsomhet og gir mulighet for påvisning av små endringer i mengden av den kjernefysiske faktor av interesse inne atomkjerner. Dette tillater en kvantitativ sammenligning av nivåene av de kjernefysiske faktor før og etter forskjellige stimulering forhold. Også, kan denne metoden påvise i isolerte nuclei, talt alle molekyl mot hvilken en god spesifikt antistoff er tilgjengelig. Videre kan immunolabeling delen bli forenklet ved hjelp av en antistoff direkte merket med fluorochome, som i tillegg vil forbedre følsomhet. Til sist viser metoden stor fleksibilitet fordi mange forskjellige fluorochomes kan brukes. Dermed kan denne metoden brukes til mange forskjellige signaltransduksjon studier som medfører endring av proteinnivåer i kjernen.
Konklusjonen er at brede anvendelighet og sensitivitet av metoden beskrevet i dette papir, plasseres det som et enkelt og økonomisk alternativ for signaltransduksjon studier som medfører endring av proteinnivåer i kjernen av en rekke celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Nancy Mora for henne teknisk assistanse.
Dette arbeidet ble finansiert av forskningsmidler 48573 M og 168 098 fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, Mexico, og med tilskudd IN212308 og IN205311-2 fra Direccion General de Asuntos del Personal Academico, Universidad Nacional Autónoma de Mexico, Mexico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur | |
References
- Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Naussef, W. M. How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view. Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).
- Scapini, P., et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).
- Hamilton, T., et al. Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression. J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).
- Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W.
- Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
- Green, D. R. Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge. Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).
- Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival. J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).
- Valente, P., et al. TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB. Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).
- Choi, M., et al. Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis. Blood. 102, 2259-2267 (2003).
- Wang, K., et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways. J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).
- Garcia-Garcia, E., Rosales, C. Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method. J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils. J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).
