Summary
न्यूट्रोफिल रक्त में सबसे प्रचुर मात्रा में leukocytes हैं. न्यूट्रोफिल transcriptionally विनियमित proinflammatory साइटोकिन्स और apoptosis के निषेध के उत्पादन के रूप में इस तरह के कार्यों के अधिकारी. इन कार्यों को यहाँ प्रस्तुत विधि है, जो प्रवाह cytometry द्वारा पृथक नाभिक में पता लगाने और परमाणु कारकों की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है के साथ अध्ययन किया जा सकता है
Abstract
न्यूट्रोफिल परिधीय रक्त में सबसे प्रचुर मात्रा में leukocytes हैं. इन कोशिकाओं को सूजन और संक्रमण की साइटों पर प्रदर्शित करने के लिए पहली बार कर रहे हैं, इस प्रकार हमलावर सूक्ष्मजीवों के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति बनने. न्यूट्रोफिल phagocytosis lytic एंजाइमों की रिहाई, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन के रूप में महत्वपूर्ण antimicrobial कार्यों के अधिकारी. इन महत्वपूर्ण बचाव कार्यों के अलावा, neutrophils proinflammatory साइटोकिन्स और apoptosis के निषेध के उत्पादन के रूप में इस तरह के संक्रमण के जवाब में अन्य कार्य. साइटोकिन्स अन्य leukocytes कि संक्रमण को स्पष्ट करने में मदद की भर्ती, और apoptosis के निषेध न्युट्रोफिल अब संक्रमण के स्थल पर रहने के लिए अनुमति देता है. इन कार्यों प्रतिलेखन के स्तर पर विनियमित रहे हैं. हालांकि, क्योंकि neutrophils अल्पकालिक कोशिकाओं, इन कोशिकाओं में transcriptionally विनियमित प्रतिक्रियाओं का अध्ययन पारंपरिक रिपोर्टर जीन के तरीकों के साथ नहीं किया जा प्रदर्शन के बाद से वहाँ कोई effi हैं कर सकते हैंन्युट्रोफिल अभिकर्मक के लिए cient तकनीक. यहाँ, हम एक सरल और कारगर तरीका है कि पता लगाने और प्रवाह cytometry द्वारा पृथक और immunolabeled नाभिक में परमाणु कारकों की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है वर्तमान. हम तकनीक का वर्णन करने के लिए मानव परिधीय रक्त से शुद्ध neutrophils अलग, विरोधी रिसेप्टर एंटीबॉडी के साथ इन कोशिकाओं को प्रोत्साहित करने, अलग और immunolabel नाभिक, और प्रवाह cytometry द्वारा नाभिक का विश्लेषण. विधि सफलतापूर्वक किया गया है neutrophils और अन्य प्रकार की कोशिकाओं से नाभिक में NF-κB और Elk 1 परमाणु कारकों का पता लगाने के लिए किया जाता है. इस प्रकार, इस विधि पृथक नाभिक में सेल प्रकार की एक किस्म से प्रतिलेखन कारकों की सक्रियता का विश्लेषण करने के लिए एक विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है.
Introduction
न्यूट्रोफिल परिधीय 1 रक्त में सबसे प्रचुर मात्रा में leukocytes हैं. सूजन और संक्रमण neutrophils के दौरान 1 कोशिकाओं प्रभावित स्थल पर दिखाई देते हैं, जहां वे 2 रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में कार्य कर रहे हैं. न्यूट्रोफिल phagocytosis, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन, lytic एंजाइमों के degranulation द्वारा जारी, और proinflammatory 4,5 साइटोकिन्स का उत्पादन सहित कई रोगाणुरोधी 3 तंत्र के अधिकारी. न्यूट्रोफिल अल्पकालिक कोशिकाओं कि विभिन्न सेल सतह रिसेप्टर्स से संकेत के माध्यम से तेजी से सक्रिय हो रहे हैं. हालांकि neutrophils टर्मिनल उनके छोटे जीवन के कारण कोशिकाओं किया गया माना जाता है और क्योंकि वे apoptosis गुजरना जब तक भड़काऊ 6 की प्रक्रिया के दौरान सक्रिय है, अब यह स्पष्ट है कि वे भी विशेष जीन के ट्रांसक्रिप्शन के स्तर को बदलकर उनके phenotype संशोधित कर सकते हैं. मैं 5 साइटोकिन्स और 7,8 apoptosis के निषेध का उत्पादन दो हैंmportant सक्रियण निर्भर सेल कार्यों neutrophils में प्रतिलेखन के स्तर पर विनियमित. परमाणु कारक κB (NF-κB) cytokine उत्पादन 4 के transcriptional नियंत्रण में और सेल अस्तित्व और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में 9-11 apoptosis विनियमन में भाग लेता है.
संकेत दे रास्ते है कि परमाणु कारक सक्रियण नेतृत्व आमतौर पर रिपोर्टर जीन assays या electrophoretic गतिशीलता बदलाव assays (EMSA) द्वारा अध्ययन कर रहे हैं. हालांकि, क्योंकि neutrophils अल्पकालिक कोशिकाओं रहे हैं, इन कोशिकाओं में transcriptionally विनियमित प्रतिक्रियाओं का अध्ययन रिपोर्टर जीन assays के साथ नहीं किया जा प्रदर्शन कर सकते हैं, के बाद से वहाँ न्युट्रोफिल अभिकर्मक के लिए कोई कारगर तकनीक हैं. EMSA assays neutrophils में इस्तेमाल किया गया है परमाणु कारक 12,13 सक्रियण का पता लगाने, लेकिन, इस पद्धति जटिल और महंगी है क्योंकि यह रेडियोधर्मी सामग्री का उपयोग शामिल है. Nucleofection एक और तकनीक है कि सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया हैlly 14 monocytes transfect. इस प्रकार, कम से कम सिद्धांत रूप में, परमाणु कारक सक्रियण अभिकर्मक द्वारा neutrophils में पता लगाया जा सकता है (कम क्षमता के बावजूद). हालांकि, इस तकनीक को और अधिक महंगा है, और समय लेने वाली और शायद कम मात्रात्मक होगा. Immunostained कोशिकाओं के सूक्ष्म विश्लेषण भी नाभिक में परमाणु कारकों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दरअसल, हम इस 15 तरह नाभिक में NF-κB स्थानान्तरण का पता चला है. दुर्भाग्य से, इस तकनीक को भी समय लेने वाली, कम मात्रात्मक और पर्यवेक्षक पूर्वाग्रह के अधीन है.
यहाँ, हम एक सरल और कारगर तरीका है कि पता लगाने और प्रवाह cytometry द्वारा पृथक और immunolabeled नाभिक में परमाणु कारकों की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है वर्तमान. हम मानव परिधीय रक्त से neutrophils को अलग करने के लिए तकनीक का वर्णन है, विरोधी रिसेप्टर एंटीबॉडी के साथ integrins या एफसी रिसेप्टर्स के माध्यम से इन कोशिकाओं को उत्तेजित को अलग और immunolabel नाभिक, और प्रवाह cytometry द्वारा नाभिक का विश्लेषण (Figure 1). विधि सफलतापूर्वक किया गया है 15 NF-κB और Elk 1 न्युट्रोफिल नाभिक में 16 परमाणु कारकों का पता लगाने के लिए किया जाता है. इस विधि की संवेदनशीलता नाभिक में परमाणु कारक के स्तर में छोटे परिवर्तन का पता लगाने की अनुमति देता है. इस विधि को भी अन्य प्रकार की कोशिकाओं से नाभिक में प्रतिलेखन कारकों के स्तर का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Protocol
1. मानव रक्त से neutrophils के अलगाव (PMN)
- Anticoagulant रूप हेपरिन (10 यू / मिलीलीटर) के साथ के बारे में 20 मिलीलीटर मानव रक्त का प्रयोग करें. रक्त वयस्क स्वस्थ स्वयंसेवकों से venopuncture द्वारा एकत्र की गई थी. UNAM - सभी प्रयोगों में Instituto Investigaciones डे Biomédicas जैवनैतिकता समिति के अनुमोदन के तहत किया गया था.
- एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में पीबीएस में 6% dextran T500 के 2 मिलीलीटर रखो और खून की 10 मिलीलीटर जोड़ें. Inverting ट्यूब से दो या तीन बार मिक्स और यह 45 मिनट के लिए बैठ एरिथ्रोसाइट अवसादन के लिए अनुमति देने के लिए.
- एक ताजा 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में 5 मिलीलीटर Ficoll Paque डाल दिया.
- ल्युकोसैट अमीर प्लाज्मा कि sedimented एरिथ्रोसाइट्स ऊपर का गठन ले लो, और ध्यान से यह एक दूसरी परत बनाने Ficoll - Paque के शीर्ष पर विंदुक. सुनिश्चित करें कि वहाँ दो चरणों.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 516 XG पर अपकेंद्रित्र Centrifugation के बाद, प्लाज्मा और Ficoll Paque अंतरावस्था में वहाँ mononuclear कोशिकाओं की एक परत है. Neutrophils ट्यूब के नीचे हैं.
- तैरनेवाला हटा दें, एक रैक के खिलाफ ट्यूब दोहन द्वारा सेल गोली तोड़ने, और ठंड की 10 मिलीलीटर (4 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस नोट जोड़कर कोशिकाओं resuspend: pipetting द्वारा कोशिकाओं resuspending और नीचे के बाद से यह भी नहीं है की सिफारिश की है. कोशिकाओं को नुकसान पहुँचाए.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र और 290 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र सेल निलंबन स्थानांतरण
- पहले के रूप में सेल गोली तोड़ने और ठंड के 10 मिलीग्राम (4 डिग्री सेल्सियस) hypotonic (0.2% NaCl, 1% BSA, 20 मिमी HEPES, 7.4 पीएच =) समाधान के लिए एरिथ्रोसाइट्स lyse. जोड़ने ट्यूब धीरे ठीक एक मिनट के लिए हाथ से घूमता द्वारा मिक्स.
- ठंड के 10 मिलीग्राम (4 ° C) hypertonic समाधान (1.6% NaCl, 1% BSA, 20 मिमी HEPES, पीएच = 7.4), मिश्रण और कोशिकाओं गिनती एक hemocytometer का उपयोग (आमतौर पर 95% PMN हैं).
नोट: सेल निलंबन के साथ बर्फ पर ट्यूब जबकि कक्षों गिनती रखें. - अपकेंद्रित्र पहले के रूप में और 10 में PMN resuspendठंड में 7 सेल / मिलीलीटर (4 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस. बर्फ पर रखें.
नोट: न्यूट्रोफिल 4 में व्यवहार्य और कार्यात्मक रहना ° सी के बारे में 6 से 8 घंटे के लिए.
2. PMN सक्रिय कर रहा है
- PMN निलंबन के 100 μl (1 x 10 7 / सेल मिलीलीटर) एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में. रखो
नोट: नमूना ट्यूबों डुप्लिकेट में कम से कम किया जाना चाहिए. हमेशा की तरह नकारात्मक नियंत्रण पहले ही एंटीबॉडी, और माध्यमिक एंटीबॉडी ही शामिल करना चाहिए. - 10 ग्राम / मिलीलीटर इसी विरोधी Integrin या विरोधी एफसी रिसेप्टर मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) जोड़ें और 15 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
- धोने के ठंड के 1 मिलीग्राम (4 ° C) PBS, एक microcentrifuge में 1743 XG (4,500 rpm) पर centrifuging, और सतह पर तैरनेवाला aspirating. जोड़कर PMN
- एक रैक के खिलाफ ट्यूब के नीचे दोहन द्वारा सेल गोली तोड़, 1 मिलीग्राम ठंड पीबीएस जोड़ने के लिए, और पिछले चरण में दो से अधिक बार धो लो.
नोट: ये अनबाउंड एंटीबॉडी को दूर washes. - उसी में Resuspend (PMNगर्म के itial मात्रा) (37 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस 60 ग्राम / एफ के मिलीलीटर (अब ') 2 बकरी आईजीजी विरोधी माउस युक्त.
नोट: माध्यमिक विरोधी माउस आईजीजी एंटीबॉडी 1 एंटीबॉडी विरोधी रिसेप्टर के लिए बाध्य और रिसेप्टर के crosslinking कारण होगा. - 1 से 20 मिनट, ब्याज की परमाणु कारक पर निर्भर करता है के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. NF-κB आमतौर पर 15 मिनट के लिए, और आमतौर पर Elk 1 5 मिनट के लिए.
नोट: 37 पर कोशिकाओं Incubating डिग्री सेल्सियस लाती रिसेप्टर crosslinking, ° जो 4 में जगह नहीं ले जा सकते हैं. - 1 मिलीलीटर ठंड पीबीएस जोडें और microcentrifuge में 1743 XG पर 3 मिनट अपकेंद्रित्र.
- तैरनेवाला निकालें
- रुक dry-ice/ethanol स्नान में तुरंत PMN और उन्हें 10 मिनट के लिए वहाँ रहते हैं.
3. अलगाव और नाभिक के फिक्सेशन
- Resuspend 100 μl ठंड में जमे हुए PMN गोली (4 डिग्री सेल्सियस) hypotonic बफर (10 मिमी HEPES, 10 मिमी KCl, 1.5 मिमी 2 MgCl, और 1 मिमी हौसले वर्धित डीएल dithiothreitol [डीटीटी], = पीएच 7.9). यह ट्यूबों dry-ice/ethanol एक स्नान के बाहर ले एक के द्वारा, और hypotonic बफर जोड़ने से पहले पोंछ ट्यूब के नीचे साफ करने के लिए सिफारिश की है.
- बर्फ पर रखें, और trypan नीले रंग के साथ नाभिक निलंबन की एक अशेष भाजक धुंधला नाभिक अखंडता के लिए जाँच. नाभिक गोल और नीले देखो. बरकरार PMN नहीं दाग करते हैं और सेल मलबे अनियमित आकार के नीले कणों के रूप में प्रकट होता है.
नोट: यदि नाभिक निलंबन कई कोशिकाओं बरकरार या मलबे होता है, यह बेहतर है तैयारी त्यागने और अन्य नमूने के साथ प्रक्रिया को दोहराने. - 775 XG (3000 आरपीएम) में एक ठंडे कमरे के अंदर 10 मिनट के लिए microcentrifuge में नाभिक अपकेंद्रित्र. इस बिंदु नाभिक बहुत नाजुक है और अतिरिक्त देखभाल नमूने ठंड और अत्यधिक बलों पर नहीं centrifuging रखने में लिया जाना चाहिए.
- बहुत सावधान pipetting द्वारा तैरनेवाला निकालें.
- पीबीएस में ठंड 4% paraformaldehyde के 100 μl जोड़ें करने के नाभिक को ठीक करने के लिए.
नोट: गोली एक बहुत ढीला हैd बफर जोड़ने नाभिक resuspend करने के लिए पर्याप्त है. Pipetting और नीचे से बचा जाना चाहिए. - 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
- प्रवाह cytometry के लिए Immunolabel नाभिक या 24 घंटे के लिए उन्हें 4 में रखने के लिए डिग्री सेल्सियस
4. प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए नाभिक Immunolabeling
- नाभिक १७४३ XG (4500 आरपीएम) में 1 मिनट के लिए microcentrifuge में, अपकेंद्रित्र और बहुत ही सौम्य pipetting द्वारा तैरनेवाला हटाने.
- ठंड के 100 μl (4 ° C) 0.1% X-100 ट्राइटन पीबीएस में 4% paraformaldehyde करने के नाभिक permeabilize. 10 मिनट के लिए बर्फ में सेते हैं.
- अपकेंद्रित्र microcentrifuge में 1743 XG पर नाभिक permeabilized और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला को हटा दें. इस बिंदु पर नाभिक छर्रों अच्छी तरह से ट्यूब के नीचे नहीं देते हैं. यह फिर से अपकेंद्रित्र है अगर गोली ढीला हो जाता है की सिफारिश की है.
- पीबीएस में ठंड 4% भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम nonspecific बाध्यकारी साइटों को ब्लॉक करने के लिए, और 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं 500 μl में Resuspend नाभिक. अपकेंद्रित्रmicrocentrifuge में 3 मिनट के लिए १७४३ में नाभिक XG और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने के.
- ठंड पीबीएस के 100 μl 4% FBS और 2.5 ग्राम / mAb ब्याज की परमाणु कारक के खिलाफ मिली युक्त नाभिक Resuspend. 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
नोट: हमेशा की तरह नकारात्मक नियंत्रण परमाणु विरोधी कारक एंटीबॉडी ही शामिल करना चाहिए, और केवल FITC लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी. - ठंड पीबीएस के 500 μl के साथ 4% FBS और 3 मिनट के लिए 1743 XG centrifuging के साथ दो बार धो लें.
- तैरनेवाला बहुत सावधानी से निकालें, ठंड पीबीएस के 100 μl 4% FBS और इसी FITC लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के 10 ग्राम / मिलीलीटर युक्त में resuspend नाभिक, और 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
- नाभिक ठंड पीबीएस के 500 μl के साथ दो बार पिछले चरण में धो 4% FBS साथ.
- पीबीएस में ठंड 4% paraformaldehyde के 400 μl में नाभिक Resuspend.
नोट: नाभिक paraformaldehyde में रखा जाता है नमूना संदूषण के बिना कई दिनों के लिए जमा की अनुमतिसमस्याओं का है कि सीरम की उपस्थिति में हो सकता है. - तुरंत प्रवाह cytometry या अंधेरे में दुकान में 4 डिग्री सेल्सियस से तीन दिन तक के लिए विश्लेषण.
5. प्रवाह cytometry विश्लेषण
- या इसी तरह के उपकरण, एक प्रवाह cytometer (Franklin Lakes, NJ Becton Dickinson) FACScan में immunolabeled नाभिक का विश्लेषण.
- FSC लॉग पैमाने पर 10-1, 196 में लॉग पैमाने पर, एसएससी, गेट और एक डॉट साजिश में नाभिक: करने के लिए अधिग्रहण सेटिंग्स समायोजित करें.
- नमूना प्रति दस हजार नाभिक मोल.
- FL एक चैनल (506 एनएम) 400 पर लॉग पैमाने पर सेट के माध्यम से विश्लेषण FITC दाग नाभिक की प्रतिदीप्ति.
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Representative Results
शोधन विधि यहाँ वर्णित आमतौर पर 95% (चित्रा 1 ए) की तुलना में अधिक से अधिक शुद्धता के साथ unstimulated neutrophils (PMN) प्रदान करता है. पृथक PMN तो विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ crosslinking विशेष रिसेप्टर्स द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. हम PMN एफसी रिसेप्टर्स और integrins (चित्रा 1 बी) के माध्यम से प्रेरित किया है. एक बार उत्तेजित PMN lysed और नाभिक उच्च पैदावार के साथ अलग कर रहे हैं. नाभिक तो परमाणु कारक (NF-κB) κB, विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ (चित्रा 1 बी) के रूप में एक विशेष परमाणु कारक, के लिए immunolabeled हैं.
नाभिक प्रवाह cytometer में एक भूखंड डॉट (2A चित्रा) के साथ बरकरार PMN से एक अलग आबादी के रूप में आसानी से पहचाना जा सकता है. NF-κB एक बेसल स्तर आराम कर PMN सेल नाभिक (चित्रा 2B) में पाया जाता है. Β1 integrins crosslinking द्वारा उत्तेजना होने पर, NF-κB नाभिक और इस increm translocated है परमाणु NF-κB में ent प्रतिदीप्ति (चित्रा 2B) में वृद्धि के रूप में पाया जाता है. इसी तरह, PMN β2 integrins crosslinking द्वारा उत्तेजना भी NF-κB सक्रियण प्रेरित प्रतिदीप्ति (चित्रा 2C) में वृद्धि से संकेत के रूप में. इस विधि की संवेदनशीलता परमाणु कारक के स्तर में छोटे परिवर्तन के रूप में इस तथ्य से सबूत का पता लगाने की अनुमति देता है कि β1 integrins, जो बाँध fibronectin, β2 integrins, जो अन्य कोशिकाओं पर आसंजन अणुओं के लिए बाध्य से प्रेरित मजबूत सक्रियण NF-κB के रूप में बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन (आंकड़े 2B 2C और तुलना).
इस विधि को भी दिया गया है सफलतापूर्वक एफसी PMN रिसेप्टर उत्तेजना के बाद 15 NF-κB और Elk 1 पृथक नाभिक में 16 परमाणु कारकों का पता लगाने के लिए किया जाता है. इस विधि को सरल और किफायती है, इस प्रकार यह आसानी से अन्य प्रकार की कोशिकाओं में परमाणु कारकों का विश्लेषण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
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चित्रा 1. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व न्युट्रोफिल शुद्धि (PMN) के खून से, कोशिकाओं की उत्तेजना, नाभिक के अलगाव, और अलग नाभिक में परमाणु कारकों की immunolabeling) रक्त हेपरिन इलाज. Dextran साथ मिलाया जाता है एरिथ्रोसाइट्स संश्लिष्ट. एरिथ्रोसाइट्स तलछट के बाद, प्लाज्मा ल्युकोसैट अमीर लाल कोशिकाओं के शीर्ष पर है. यह प्लाज्मा ल्युकोसैट अमीर तबादला और एक और ट्यूब में Ficoll Paque के शीर्ष पर स्तरित. Centrifugation के बाद, mononuclear कोशिकाओं (एमएनसी) के एक परत प्लाज्मा और Ficoll Paque अंतरावस्था में पाया जाता है. PMN ट्यूब के नीचे पाया जाता है बी) पृथक PMN crosslinking विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ सेल झिल्ली रिसेप्टर्स (एमएबी) (नारंगी) और एक माध्यमिक एंटीबॉडी (गहरे हरे रंग से प्रेरित हैं.). परमाणु कारक रूई बी (NF-κB) नाभिक में इसकी अवरोध करनेवाला IκB और translocates से अलग करती है. नाभिक तो अलग कर रहे हैं permeabilized और NF-κB या एक विशिष्ट MAB (पीला) के साथ एक और परमाणु कारक, और एक FITC लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी (हल्के हरे रंग की) के खिलाफ immunolabeled. फिक्स्ड नाभिक प्रवाह cytometry (FACS) का विश्लेषण कर रहे हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2 (PMN) neutrophils में NF-κB सक्रियण का विश्लेषण.) बरकरार PMN (बाएं पैनल) या अलग नाभिक (सही पैनल) प्रवाह cytometry डॉट साजिश ग्राफ में दो अलग - अलग आबादी के रूप में दिखाई देते हैं. कोशिकाओं और नाभिक द्वारा स्वतंत्र रूप से विश्लेषण कर सकते हैंविभिन्न फाटकों बनाने बरकरार कोशिकाओं के लिए (लाल) R1, और पृथक नाभिक के लिए R2 (नीला) बी और सी) PMN से अलग नाभिक NF κB (p50 सबयूनिट) के लिए immunolabeled रहे थे, इससे पहले (हरी धराशायी लाइन), या कोशिकाओं के बाद द्वारा सक्रिय गया पार से जोड़ने की विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ (बी) TS2/16 (नीली रेखा) β1 integrins, विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी IB4 (लाल रेखा) के साथ या β2 integrins (सी). ग्रे क्षेत्र FITC लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी से अकेले बेसल प्रतिदीप्ति है.
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Discussion
शोधन विधि यहाँ वर्णित unstimulated neutrophils 95 (सूक्ष्म अवलोकन द्वारा मूल्यांकन)%, की तुलना में एक कम समय में अधिक से अधिक शुद्धता के साथ (PMN) अलगाव की अनुमति देता है. कभी कभी neutrophils एरिथ्रोसाइट्स से दूषित किया जा सकता है और अगर बाद पूरी तरह से नहीं lysed कर रहे हैं. यह आमतौर पर तकनीक को प्रभावित नहीं करता है, के बाद से एरिथ्रोसाइट्स और PMN प्रवाह cytometry द्वारा आसानी से अलग सेल आबादी के रूप में कर सकते हैं प्रतिष्ठित किया जा. पृथक PMN तो विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ crosslinking विशेष रिसेप्टर्स द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. वास्तव में, PMN भी औषधीय माध्यम से या आसंजन द्वारा विभिन्न substrates या अन्य कोशिकाओं को प्रेरित किया जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत पद्धति संकेत दे रास्ते कि PMN नाभिक में परमाणु कारकों के परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व के बाद कोशिकाओं को व्यावहारिक रूप से किसी भी प्रासंगिक जैविक प्रोत्साहन द्वारा सक्रिय कर रहे हैं का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
एक बार PMN प्रेरित कर रहे हैं, तो इस पत्र में वर्णित विधि तेजी से और effici के लिए अनुमति देता हैनाभिकों की और पता लगाने के लिए ent immunofluorescence और प्रवाह cytometry विश्लेषण NF-κB की इन नाभिक में, शुद्धि. PMN कुछ रिसेप्टर्स की उत्तेजना के बाद, cytoplasm में NF-κB अपने अवरोध करनेवाला IκB से जारी की है, और फिर नाभिक (चित्रा 1 बी) में traslocated. इस प्रकार, NF-κB सक्रियण के स्तर नाभिक में NF-κB वर्तमान की राशि से निर्धारित किया जाता है. क्योंकि इस विधि का पता लगाने और नाभिक में उपाय कर सकते हैं NF-κB की राशि, यह आसानी से इस परमाणु कारक के सक्रियण निर्धारित कर सकते हैं. विधि एक समान तरीके में अन्य परमाणु कारकों की सक्रियण पता लगाने के लिए जब उनके सक्रियण परमाणु स्तर में परिवर्तन करने के लिए जुड़ा हुआ है. सक्रिय परमाणु कारकों में से एक परिवर्तन नाभिक में मौजूद कारक की राशि में परिवर्तन की वजह से हो सकता है, के रूप में यह NF-kB के लिए मामला है, या phosphorylation के रूप में इस तरह के कारक की आणविक संरचना में परिवर्तन के रूप में यह के लिए मामला है एल्क-1. इस विधि के लिए ग का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैकिसी भी अणु के परमाणु स्तर के hanges जिसके लिए एक विशिष्ट एंटीबॉडी उपलब्ध है.
इस पद्धति का एक सरल और तेज तरीके में एक शुद्ध नाभिक जनसंख्या पैदावार. कोशिकाओं को स्थिर और एक hypotonic बफर कि कोशिकाओं को खुला फट और बरकरार नाभिक पत्तियों में lysed. बरकरार PMN या पृथक नाभिक आमतौर पर प्रवाह cytometry डॉट साजिश ग्राफ में दो अलग - अलग आबादी के रूप में दिखाई देते हैं. कोशिकाओं और नाभिक बरकरार कोशिकाओं के लिए, और अलग नाभिक के लिए विभिन्न फाटकों बनाने के द्वारा स्वतंत्र रूप से विश्लेषण कर सकते हैं. एक अक्षुण्ण कोशिका नमूने में एक गेट क्षेत्र है जहां सबसे कोशिकाओं प्रदर्शित के आसपास बनाया है. इसी तरह, एक नाभिक नमूना के साथ एक गेट क्षेत्र है जहां सबसे नाभिक दिखाई देते हैं के आसपास बनाया है. आम तौर पर इन दो फाटकों डॉट साजिश ग्राफ के विभिन्न स्थानों में हैं. कण कि कभी कभी इन फाटकों के बाहर का पता चला है, आम तौर पर सेल या नाभिक मलबे कर रहे हैं, और वे विश्लेषण के बाहर छोड़ दिया जाता है. यदि सेल और नाभिक फाटकों ओवरलैप करते हैं, यह आम तौर पर मतलब है कि नाभिक तैयारी cle नहीं हैएक. इस नाभिक तैयारी का विश्लेषण विश्वसनीय नहीं है, और यह ताजा बना buffers के साथ प्रक्रिया को दोहराने के लिए बेहतर है.
विधि मानव PMN के साथ काम करने के लिए विकसित किया गया था, लेकिन यह भी सफलतापूर्वक ल्युकोसैट 15 मूल के विभिन्न सेल लाइनों के लिए लागू किया गया है. विधि आसानी से विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं से नाभिक को अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. यह महत्वपूर्ण है कि 1 x 10 6 कोशिकाओं की एक न्यूनतम के साथ प्रक्रिया शुरू करने के लिए एक कुशल प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए पर्याप्त नाभिक प्राप्त. यदि नाभिक की छोटी संख्या के अंत में प्राप्त कर रहे हैं, यह बेहतर है के लिए नियमित रूप से 3 x 10 6 कोशिकाओं के साथ विधि शुरू.
Lysis चरण के दौरान, जमे हुए कोशिकाओं पिघलना नहीं की अनुमति दी जानी चाहिए. कम सेल गिरावट के कारण उपज में यह परिणाम है. इस प्रकार, यह एक समय में dry-ice/ethanol स्नान के बाहर एक ट्यूब कोशिकाओं lyse लेने की सिफारिश की है. इसके अलावा, यह hypotonic lysis जोड़ने से पहले पोंछ ट्यूब के बाहर साफ करने के लिए महत्वपूर्ण हैबफर. जब ऐसा नहीं किया है, बफर कभी कभी ट्यूब में जमा देता है, एक अक्षम सेल देने और नाभिक तैयारी है कि कोशिकाओं बरकरार द्वारा दूषित कर रहे हैं में जिसके परिणामस्वरूप. फिर भी, यह एक गंभीर समस्या यह देखते हुए कि ज्यादातर मामलों में बरकरार कोशिकाओं और नाभिक प्रवाह cytometry द्वारा अलग किया जा सकता है नहीं है.
क्योंकि नाभिक बहुत कमजोर कर रहे हैं इससे पहले कि वे तय करने के लिए है, यह महत्वपूर्ण है उन्हें बर्फ में रखने से 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर समाधान ठंड है. Centrifugation के बाद, नाभिक छर्रों ट्यूब के नीचे कभी कभी ढीली कर रहे हैं, तो अतिरिक्त देखभाल जब तैरनेवाला को हटाने लिया जाना चाहिए. यह बेहतर वैक्यूम आकांक्षा के साथ तुलना में एक micropipette के साथ किया जाता है. इस अवसर पर, ट्यूब फिर centrifuged किया जा सकता है, लेकिन अत्यधिक की सिफारिश की centrifugation बलों नहीं होना चाहिए क्योंकि इस हर्जाना नाभिक.
विधि NF-κB p50 सबयूनिट (2 चित्रा) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर सक्रियण, और ALS का पताp65 सबयूनिट इस परमाणु कारक के 15 ओ. इसके अलावा, रिसेप्टर शुरू ERK और Elk-1 के परमाणु सक्रियण की मात्रा का ठहराव भी सफलतापूर्वक किया गया था इस पद्धति के माध्यम से 16 हासिल की है, इन अणुओं के खिलाफ इसी विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग. इसके अलावा, NF-κB परमाणु स्तर में छोटे परिवर्तन, integrins के विभिन्न प्रकार के (2 चित्रा) PMN के अंतर उत्तेजना के कारण, और भी एफसी के औषधीय अवरोध के कारण इस विधि की अनुमति का पता लगाने की संवेदनशीलता के संकेत दे रास्ते 16 रिसेप्टर शुरू . एक अच्छा विशिष्ट एंटीबॉडी और एक कुशल fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के संयोजन महान संवेदनशीलता प्रदान करता है और नाभिक के अंदर ब्याज की परमाणु कारक की राशि में छोटे परिवर्तन का पता लगाने के लिए अनुमति देता है. इस से पहले और बाद में विभिन्न उत्तेजना की स्थिति परमाणु कारक के स्तर की एक मात्रात्मक तुलना परमिट. इसके अलावा, इस विधि पृथक परमाणु में पता लगा सकते हैंCLEI, वस्तुतः किसी भी अणु के खिलाफ जो एक अच्छा विशिष्ट एंटीबॉडी उपलब्ध है. इसके अलावा, immunolabeling हिस्सा एक सीधे fluorochome है, जो इसके अलावा में संवेदनशीलता में सुधार होगा साथ लेबल एंटीबॉडी का उपयोग करके सरल किया जा सकता है. अंत में, विधि महान लचीलापन प्रस्तुत करता है क्योंकि कई अलग अलग fluorochomes इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रकार, इस विधि के कई अलग अलग संकेत पारगमन अध्ययन है कि प्रोटीन के स्तर के नाभिक में परिवर्तन को शामिल करने के लिए लागू किया जा सकता है.
अंत में, व्यापक और इस पत्र में वर्णित विधि की प्रयोज्यता संवेदनशीलता, यह संकेत पारगमन अध्ययन है कि प्रोटीन के स्तर के सेल प्रकार की एक किस्म के नाभिक में परिवर्तन को शामिल करने के लिए एक सरल और किफायती विकल्प के रूप में जगह है.
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Disclosures
लेखक का घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.
Acknowledgments
लेखकों के लिए नैन्सी मोरा उसे तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.
यह काम Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, मैक्सिको, 48,573 एम और 168098 से अनुसंधान अनुदान द्वारा और IN212308 अनुदान और IN205311-2 की पेशकश करेगा से जनरल डी Asuntos डेल पर्सनल Academico, Universidad Nacional ऑटोनोमा डी मेक्सिको, मेक्सिको के द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur | |
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