Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تصميم وتحليل سلوك تفضيل درجة الحرارة وإيقاعها Circadian في Drosophila

Published: January 13, 2014 doi: 10.3791/51097
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1The Visual Systems Group, Division of Pediatric Ophthalmology, Cincinnati Childrens Hospital Medical Center, 2PRESTO, JST

Summary

حددنا مؤخرا رواية إخراج Drosophila circadian ، إيقاع تفضيل درجة الحرارة (TPR) ، حيث ترتفع درجة الحرارة المفضلة في الذباب خلال النهار وتنخفض أثناء الليل. وينظم TPR بشكل مستقل عن آخر الناتج circadian، النشاط الحركي. هنا نحن نصف تصميم وتحليل TPR في Drosophila.

Abstract

الساعة circadian ينظم العديد من جوانب الحياة، بما في ذلك النوم، والنشاط الحركي، ودرجة حرارة الجسم (BTR)إيقاعات 1،2. حددنا مؤخرا رواية Drosophila circadian الناتج ، ودعا إيقاع تفضيل درجة الحرارة (TPR) ، الذي ترتفع درجة الحرارة المفضلة في الذباب خلال النهار وتنخفض خلال الليل 3. والمثير للدهشة، يتم التحكم في TPR والنشاط الحركي من خلال الخلايا العصبية circadian متميزة3. Drosophila النشاط الحركي هو نتاج سلوكي circadian معروفة وقدمت مساهمات قوية لاكتشاف العديد من الجينات على مدار الساعة circadian الثدييات المحفوظة وآليات4. ولذلك، فإن فهم TPR يؤدي إلى تحديد آليات circadian الجزيئية والخلوية غير معروفة حتى الآن. هنا، نقوم بوصف كيفية إجراء وتحليل المقايسة TPR. هذه التقنية لا تسمح فقط لتشريح الآليات الجزيئية والعصبية من TPR، ولكن أيضا يوفر رؤى جديدة في الآليات الأساسية لوظائف الدماغ التي تدمج إشارات بيئية مختلفة وتنظيم السلوكيات الحيوانية. وعلاوة على ذلك، تشير بياناتنا المنشورة مؤخرا إلى أن ذبابة TPR تشترك في ميزات مع الثدييات BTR3. الدروزوفيلا هي ectotherms ، حيث يتم تنظيم درجة حرارة الجسم عادة سلوكيا. لذلك ، TPR هي استراتيجية تستخدم لتوليد درجة حرارة الجسم الإيقاعي في هذه الذباب5-8. ونحن نعتقد أن المزيد من الاستكشاف من Drosophila TPR سوف تسهل توصيف الآليات الكامنة وراء التحكم في درجة حرارة الجسم في الحيوانات.

Introduction

درجة الحرارة هي إشارة بيئية في كل مكان. الحيوانات تظهر مجموعة متنوعة من السلوكيات من أجل تجنب درجات الحرارة الضارة والبحث عن تلك مريحة. Drosophila يحمل سلوك تفضيل درجة الحرارةقوية 6,7. عندما يتم تحرير الذباب في درجة حرارة الانحدار من 18-32 درجة مئوية، والذباب تجنب كل من درجات الحرارة الدافئة والباردة وأخيرا اختيار درجة حرارة مفضلة من 25 درجة مئوية في الصباح3. أجهزة استشعار درجة الحرارة الدافئة هي مجموعة من الخلايا العصبية الحرارية الحسية، والخلايا العصبية AC، والتي تعبر عن Drosophila مستقبلات عابرة المحتملة (TPR) قناة، TRPA16،9. وتقع أجهزة استشعار درجة الحرارة الباردة في شرائح الهوائي الثالث، حيث أن تأليه شرائح الهوائي الثالث يسبب عدم تجنب درجة الحرارة الباردة6. في الآونة الأخيرة، تم التعرف على البروتين TRPP بريفيدو (Brv)10. منذ يتم التعبير عن Brv في شرائح الهوائي الثالث ويتوسط الكشف عن البرد، Brv هو جزيء استشعار البرد ممكن، وهو أمر بالغ الأهمية لسلوك تفضيل درجة الحرارة. وباختصار، يستخدم الذباب جهازي استشعار درجة الحرارة هذين لتجنب درجات الحرارة الدافئة والباردة والعثور على درجة حرارة مفضلة.

في حين تولد الثدييات الحرارة لتنظيم درجة حرارة الجسم ، فإن ectotherms تكيف بشكل عام درجات حرارة جسمها مع درجة الحرارة المحيطة11. ومن المعروف أن بعض ectotherms لعرض سلوك TPR اليومية التي يعتقد أن تكون استراتيجية لectotherms لتنظيم BTR12بهم . لتحديد ما إذا كان الذباب عرض TPR، كررنا التحليل السلوكي تفضيل درجة الحرارة في نقاط مختلفة خلال فترة 24 ساعة. وجدنا أن Drosophila معرض TPR اليومية، والتي هي منخفضة في الصباح وعالية في المساء ويتبع نمط مماثل لتلك التي من BTR في البشر13.

في Drosophila، هناك ~ 150 ساعة الخلايا العصبية في الدماغ. تسمى الخلايا العصبية على مدار الساعة التي تنظم النشاط الحركي م وE مذبذبات. ومع ذلك، من المثير للاهتمام، M و E مؤشرات التذبذب لا تنظم TPR، بدلا من ذلك، أظهرنا أن الخلايا العصبية على مدار الساعة DN2 في الدماغ تنظيم TPR ولكن ليس النشاط الحركي. وتشير هذه البيانات إلى أن TPR ينظم بشكل مستقل عن النشاط الحركي. وتجدر الإشارة إلى أن الثدييات BTR يتم تنظيمها بشكل مستقل من النشاط الحركي. دراسات الاستئصال في الفئران تبين أن يتم التحكم BTR من خلال الخلايا العصبية SCN محددة التي تستهدف مجموعة فرعية مختلفة من الخلايا العصبية المنطقة دون البطينية من تلك التي تتحكم في النشاط الحركي14. لذلك ، تنظر بياناتنا في إمكانية الحفاظ على BTR الثدييات و TPR الذبابةتطوريا 3، لأن كلا من TPR الذبابة والثدييات BTR تظهر إيقاعات درجة الحرارة المعتمدة على مدار الساعة ، والتي يتم تنظيمها بشكل مستقل من النشاط الحركي.

هنا، ونحن نصف تفاصيل كيفية تحليل المقايسة السلوكية TPR في Drosophila. تسمح هذه الطريقة بالتحقيق ليس فقط في الآلية الجزيئية والدوائر العصبية ل TPR ، ولكن أيضا في كيفية دمج الدماغ للإشارات البيئية المختلفة والساعات البيولوجية الداخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الذباب

  1. تجارب الظلام الفاتح (LD)
    1. رفع الذباب في الحاضنات (25 درجة مئوية/40-60٪ الرطوبة النسبية (RH)) تحت ضوء 12 ساعة / الظلام 12 ساعة (LD) دورات. شدة الضوء من الحاضنات هو ~ 500-1000 لوكس.
    2. حاضنتان ضروريتان لإكمال فحوصات السلوك على مدار 24 ساعة. يجب أن يكون لكل من الحاضنات ضوء قابل للبرمجة مع وظائف ON OFF. وينبغي أن يكون لها أيضا الأبواب الصلبة التي لا نفاذية للضوء(أي لا الزجاج أو زجاج شبكي).
      ملاحظة: يجب تعيين حاضنة واحدة حاضنة "نهارية" وتعيينها إلى دورة LD من ضوء 12 ساعة و 12 ساعة مظلمة. وينبغي تعيين الحاضنة الثانية حاضنة "ليلية" وتعيينها إلى عكس الحاضنة الأولى مع حلول الظلام 12 ساعة يليها ضوء 12 ساعة. يجب وضع الحاضنة الليلية في الغرفة التي يمكن الوصول إليها في الظلام ، بطريقة يمكن بها الوصول بسهولة إلى الذباب الذي يعاني من ظروف ليلية للتجارب.
    3. ضع قنينات الذبابة إما في حاضنات نهارية أو ليلية. جمع الذباب فقست حديثا في قارورة جديدة، 20-30 لكل المقايسة والحفاظ في نفس الحاضنة لمدة 2-3 أيام.
    4. بعد 2-3 أيام، استخدم الذباب لل المقايسة السلوكية تفضيل درجة الحرارة.
      1. لليوم (Zeitgeber الوقت (ZT) 0-12) التجارب، وجمع الذباب من حاضنة اليوم.
      2. قبل التجارب السلوكية مباشرة، أخرج قنينات الذباب المجمعة من حاضنة اليوم.
      3. لليلة (ZT 13-24) التجارب، وجمع الذباب من حاضنة الليل.
      4. قبل التجارب السلوكية مباشرة، أخرج قنينات الذباب المجمعة من حاضنة الليل، ولفها بورق الألومنيوم ووضعها في صندوق في الغرفة المظلمة تحت مصباح أحمر.
        ملاحظة: نظرا لأن الفحص السلوكي لتفضيل درجة الحرارة يتم تحت الظلام للتجارب الليلية ، فيجب منع التعرض للضوء للذباب حتى نهاية التجارب السلوكية.
        ملاحظة: لا ينبغي أن يتعرض الذباب لثاني أكسيد الكربون في اليوم الذي ستجري فيه التجارب.
  2. تجارب الظلام المستمر (DD)
    1. يوم DD
      1. من الضروري إنشاء حاضنة إضافية للتجارب النهارية ل DD، والتي نشير إليها كحاضنة "انتقالية" لبقية المخطوطة. يجب وضع حاضنة الانتقال في الغرفة التي يمكن الوصول إليها في الظلام ، بطريقة يمكن بها الوصول بسهولة إلى الذباب الذي يعاني من ظروف DD للتجارب. مثال على ذلك جدول زمني ضوء لحاضنة الانتقال سيكون ضوء ON من 1 بعد الظهر -7 مساء وضوء قبالة في 7 مساء-1 بعد الظهر(الشكل 1).
      2. جمع الذباب التي أثيرت في حاضنة اليوم. ضع قنينات الذباب في حاضنة الانتقال بين الساعة 1 ظهرا و7 مساء، عندما يكون الضوء قيد تشغيل. وبهذه الطريقة، يتعرض الذباب للضوء بشكل صحيح حتى الساعة 7 مساء، وفي ذلك الوقت يتم إيقاف تشغيل الضوء.
      3. في اليوم التالي، قبل الساعة الواحدة ظهرا، في ظل ظروف مظلمة، أخرج قنينات الذباب من حاضنة الانتقال، ولفها بورق الألومنيوم ووضعها في صندوق. احتفظ بالصندوق في أي حاضنة ليوم آخر.
    2. DD ليلة
      1. جمع الذباب التي أثيرت في حاضنة الليل في الظلام تحت مصباح أحمر. أو بالإضافة إلى ذلك جمع الذباب عندما يكون ضوء الحاضنة الليلية على.
      2. التفاف قوارير جمعت مع رقائق الألومنيوم في الظلام في أي وقت الأضواء هي إيقاف ووضع قوارير في مربع. احتفظ بالمربع في أي حاضنة لمدة يومين آخرين(الشكل 1B).
        ملاحظة: نظرا لأن الفحص السلوكي لتفضيل درجة الحرارة يتم تحت الظلام للتجارب الليلية ، فيجب منع التعرض للضوء للذباب حتى نهاية التجارب السلوكية.
  3. تجارب الضوء الثابت (LL)
    1. يوم LL
      1. حاضنة إضافية ضرورية للتجارب يوم LL. تحافظ هذه الحاضنة على حالة LL (25 درجة مئوية، 800 لوكس)، مع تشغيل الضوء باستمرار.
      2. جمع الذباب التي أثيرت في حاضنة اليوم. ضع قنينات الذباب في حاضنة LL في أي وقت خلال "يومها".
    2. LL ليلة
      1. جمع الذباب التي أثيرت في حاضنة الليل. نقل قنينات الذباب من الحاضنة الليلية إلى حاضنة LL خلال الوقت الذي يكون فيه الضوء في الحاضنة الليلية ON.
        ملاحظة: على سبيل المثال، يتم إيقاف تشغيل الضوء في الساعة 7 صباحا في الحاضنة الليلية. نقل قنينات الذباب من الحاضنة الليلية إلى حاضنة LL قبل الساعة 7 صباحا والحفاظ على القنينات في حاضنة LL لمدة 4 أيام أخرى.
        ملاحظة: في اليوم 4 في LL الظروف، يتم إلغاء تذبذب النشاط الحركي15،16،في حين لا يزال يستمر TPR 3.

2. جهاز للتفضيل درجة الحرارة المقايسة السلوكية

  1. ضع غطاء زجاج شبكي (29 سم × 19.2 سم)(الشكل 4)على لوحة من الألومنيوم.
  2. مراقبة درجة حرارة الهواء بين لوحة والغطاء. يتم إرفاق ستة مسابير درجة الحرارة في مواقع مختلفة على داخل الغطاء داخل أحد الممرات (الشكل 2).
    ملاحظة: تأكد من أن المسابير لا تلمس لوحة الألومنيوم أو غطاء زجاج شبكي. يجب تعيين درجة حرارة الهواء إلى تدرج من 18-32 درجة مئوية.
  3. ضع الجهاز في غرفة بيئية صيانتها عند 25 درجة مئوية/65-75٪ RH. هذه الغرفة يجب أن تكون مغلقة من أي ضوء خارجي عادة ما تكون الغرفة البيئية مجهزة بموا مراوح للحفاظ على درجة حرارة ورطوبة معينة.
    ملاحظة: من المرجح أن الهواء من المروحة يزعج تدرج درجة الحرارة المستقر على الجهاز. لمنع ذلك، نستخدم ورقة شفافة تغطي المنطقة المحيطة بالجهاز.
  4. إعداد ميزان الحرارة ومقياس الرطوبة للتحقق من درجة الحرارة والرطوبة في الغرفة البيئية.
    ملاحظة: الضوء يؤثر على درجة الحرارة تفضيل Drosophila3. وينبغي توفير نفس كثافة الضوء على الجهاز بشكل موحد. شدة أضواء غرفتنا البيئية ~ 800 لوكس.
    ملاحظة: عند إجراء التجارب السلوكية، ضع أنبوبا متصلا بخزان CO2 أو تموين بالقرب من ثقب الجزء العلوي من الجهاز من أجل تخدير الذباب والتخلص منه.

3. إعداد جهاز للاستخدام

  1. بدوره على الجهاز لمدة 30 دقيقة على الأقل من أجل تحديد درجة الحرارة الانحدار بشكل صحيح على سطح لوحة (الشكل 3).
  2. قم بتغطية غطاء جهاز السلوك بطارد الماء لمنع الذباب من تسلق جدران أو سقف الغطاء. مسح طارد المياه الزائدة قبالة وترك الغطاء لمدة 25-30 دقيقة لتجف.
  3. إزالة أي تكثيف على لوحة الألومنيوم. ضع غطاء زجاج شبكي على لوحة الألومنيوم وآمن مع ستة المشابك C(الشكل 2).
    ملاحظة: من المهم جدا أن الغطاء مختومة بشكل جيد، إذا لزم الأمر يمكن استخدام الشريط عصا مزدوجة.
  4. اترك الغطاء لمدة 15 دقيقة على الأقل. يتم إنشاء تدرج درجة حرارة الهواء بين لوحة الألومنيوم والغطاء من 18-32 درجة مئوية.

4. درجة الحرارة تفضيل السلوك المقايسة

  1. تحميل الذباب في الفضاء بين لوحة الألومنيوم وغطاء زجاج شبكي للجهاز من خلال ثقوب صغيرة في وسط كل حارة من الغطاء (الشكلين 2 و 4). تغطية الثقوب مع زلات الغطاء لمنع الذباب من الهرب.
  2. للظروف المظلمة، أطفئ جميع الأضواء في الغرفة البيئية. يمكن استخدام مصباح أحمر عندما يتم وضع الذباب في الجهاز. تأكد من عدم تعرض الذباب لأي أضواء باستثناء مصباح أحمر حتى يتم إجراء التجارب السلوكية.
  3. لكل تجربة، استخدم ذبابة بالغة من 20 إلى 25 ذبابة، والتي لا يمكن إعادة استخدامها في التجارب اللاحقة. يتم إجراء الفحص السلوكي لمدة 30 دقيقة. التقاط بعض الصور مع أو بدون فلاش. يجب الحرص على عدم إحداث الكثير من الضوضاء أو أي حركات مفاجئة أثناء التجارب.
  4. سجل درجة حرارة جميع المسابير الستة على الجهاز. يحيط علما بدرجة حرارة الغرفة وكذلك الرطوبة.
  5. تخدير الذباب في الجهاز مع غاز ثاني أكسيد الكربون ، وتخفيف المشابك ، وإزالة غطاء زجاج شبكي ، وإزالة الذباب من اللوحة. بعد كل تجربة، يتم التخلص من الذباب. مسح أي تكثيف أو رطوبة من لوحة. استبدال الغطاء على لوحة وتشديد مع المشابك استعدادا للتجربة القادمة.
  6. من أجل الحصول على تمثيل لتفضيل درجة الحرارة طوال اليوم ، يتم تقسيم فترة 24 ساعة إلى ثماني مناطق زمنية ، أربع خلال النهار وأربعة في الليل. على سبيل المثال، نستخدم هذه ZT أو CT 1-3، 4-6، 7-9، 10-12، 13-15، 16-18، 19-21 و 22-24.
    ملاحظة: نظرا لأن الاختلافات الظاهرية الناتجة عن تأثيرات الإخفاء متوقعة مباشرة بعد تشغيل الضوء (ZT0) أو OFF (ZT12)، فإننا لا ندرس سلوك تفضيل درجة الحرارة خلال هذه الأوقات (ZT أو CT 0-1 و11.5-13 و23.5-24). يجب إجراء خمس تجارب على الأقل في كل منطقة زمنية لكي تكون النتائج سليمة إحصائيا.

5. تحليل البيانات

  1. حساب درجة الحرارة الانحدار على النحو التالي: تحديد حيث يتم وضع مسابير درجة الحرارة على أساس اثنين من الحكام التي يتم وضعها على الجانب العلوي والسفلي من غطاء زجاج شبكي على طول حواف(الشكل 2A).
  2. ويقدر تدرج درجة الحرارة بين مسابير درجة الحرارة لتكون خطية. استنادا إلى مواقع المسابير درجة الحرارة، فضلا عن درجات الحرارة المسجلة المقابلة لها، رسم خطوط تمثل كل درجة من درجات الحرارة في الموقف المناسب على الصور. عد عدد الذباب الموجود في كل فاصل درجة. استبعاد أي الذباب على الجدران أو سقف الغطاء.
  3. حساب النسبة المئوية للذباب في كل نطاق درجة حرارة من كل حارة. يتم حساب متوسط درجة الحرارة المفضلة عن طريق تلخيص منتجات النسبة المئوية لكل فاصل زمني من الذباب ودرجة الحرارة، كما هو موضح أدناه:
    ٪ من الذباب × 18.5 درجة مئوية + ٪ من الذباب × 19.5 درجة مئوية + ٪ من الذباب × 20.5 درجة مئوية ....+ ٪ من الذباب × 31.5 درجة مئوية + ٪ من الذباب × 32.5 درجة مئوية.
  4. حساب متوسط درجة الحرارة المفضلة في كل منطقة زمنية: يتم تنفيذ سلوك تفضيل درجة الحرارة >5 مرات خلال كل منطقة زمنية (ZT 1-3 و 4-6 و 7-9 و 10-12 و 13-15 و 16-18 و 19-21 و 22-24). لحساب متوسط درجة الحرارة المفضلة في كل منطقة زمنية، يتم متوسط متوسط درجة الحرارة المفضلة لكل تجربة معا. أشرطة الخطأ s.e.m. تساوي الخطأ بين التجارب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يظهر مثال على إيقاع تفضيل درجة الحرارة في الشكل 5. إذا تم إجراء السلوك بنجاح ، يجب أن يحمل الذباب TPR حيث يفضل درجة حرارة منخفضة في الصباح ودرجة حرارة أعلى في المساء. وينبغي ملاحظة ~ 1-1.5 درجة مئوية خلال النهار في تفضيل درجة الحرارة خلال النهار، بغض النظر عن الخلفية الوراثية، حيث أظهرنا أن ث1118، yw وكانتون S الذباب يحمل تفضيل درجة حرارة مماثلة خلال النهار3.

Figure 1
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 تخطيطي لإعداد الذبابة في يوم DD. (أ)مثال على تجربة نهارية DD. الضوء على من 1:00 حتي 7:00 والضوء هو OFF من 7:00 حتي 1:00 في حاضنة الانتقال. جمع الذباب التي أثيرت في حاضنة اليوم. ضع قنينات الذباب في حاضنة الانتقال في وقت ما بين الساعة 1 ظهرا و7 مساء. في اليوم التالي قبل الساعة 1 ظهرا، أخرج قنينات الذباب من حاضنة الانتقال في الظلام، ولفها بورق الألومنيوم ووضعها في صندوق. (ب)مثال على تجربة ليلية DD. جمع الذباب التي أثيرت في حاضنة ليلية إما في الظلام خلال 7am إلى 7pm أو في ضوء خلال 7pm إلى 7am. أخرج قنينات الذباب من الحاضنة الليلية في الظلام بين الساعة 7 صباحا و7 مساء، ولفها بورق الألومنيوم ووضعها في صندوق

Figure 2
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم درجة الحرارة تفضيل الجهاز السلوكي. (أ) العرض العلوي. يتم وضع غطاء زجاج شبكي على لوحة الألومنيوم مع ستة المشابك C. يتم إرفاق ستة مسابير درجة الحرارة في مواقف مختلفة على داخل الغطاء داخل أحد الممرات. يتم وضع اثنين من الحكام على أعلى وأسفل غطاء زجاج شبكي على طول الحواف لتحديد تدرج درجة الحرارة. (ب) عرض جانبي. يتم وضع أربعة أجهزة بلتيير تحت لوحة الألومنيوم (44 سم × 22 سم). يتم توصيل كل جهاز بلتيير إلى وحدات التحكم في درجة الحرارة التي تولد درجات الحرارة الباردة أو الساخنة. لمنع Peltiers من ارتفاع درجة الحرارة ، يتم توصيل نظام تبريد الكمبيوتر بأنابيب المياه ومراوح تبريد الهواء وإمدادات الطاقة. يتم تضمين مسابير درجة الحرارة في حافة لوحة الألومنيوم وترتبط وحدات التحكم في درجة الحرارة للتحكم مباشرة في درجات الحرارة على لوحة الألومنيوم. لجهازنا الحالي، يتم تعيين الجانبين الباردة والساخنة في 12 درجة مئوية و 36 درجة مئوية، على التوالي.

Figure 3
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن رسم تخطيطي للجهاز. وتستخدم المسابير درجة الحرارة كتحكم التغذية المرتدة قراءة درجة الحرارة على لوحة الألومنيوم. وترتبط أجهزة بلتيير إلى وحدات تحكم درجة الحرارة. لمنع ارتفاع درجة حرارة بلتيير، يتم وضع مبردات السائل مباشرة تحت Peltiers. يتم توصيل مبردات السائل الأربعة بواسطة أنابيب المياه التي تتصل بالمضخة والمبرد. المبرد اثنين من المراوح التي تبرد درجة حرارة الماء. يتم توصيل المضخة والمبرد إلى إمدادات الطاقة.

Figure 4
الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال خطة غطاء زجاج شبكي. هذه هي خطة لتغطية التي هي مصنوعة من زجاج شبكي. يحتوي الغطاء على أربعة ممرات مقسومة على ثلاثة فواصل سمكها 0.2 سم ، ويقع ثقب قطره 0.7 سم في وسط اللوحة العلوية في كل حارة(الشكل 2A).

Figure 5
الشكل 5 - الأرقام 5- الأرقام التي تم مثال على البيانات السلوكية TPR. TPR من ث1118 الذباب أكثر من 24 ساعة. تم حساب درجات الحرارة المفضلة باستخدام توزيع الذباب في تجارب سلوك تفضيل درجة الحرارة. تظهر البيانات على أنها متوسط درجة الحرارة المفضلة في كل منطقة زمنية. تمثل الأرقام عدد المقايسات. ANOVA، P < 0.0001. اختبار Tukey-Kramer مقارنة ب ZT1-3 أو *** P < 0.001 أو ** P < 0.01 أو * P < 0.05. هذا الرقم من النمط الظاهري TPR مقتبس من Kaneko وآخرون. 3 بإذن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، نوضح تفاصيل الجهاز السلوكي تفضيل درجة الحرارة وتحليل سلوك TPR. Drosophila المعرض ملامح بارزة وقوية وقابلة للاستنساخ من TPR التي تسيطر عليها على مدار الساعة. ومع ذلك ، تشير بياناتنا إلى أن هناك عاملين على الأقل ، الضوء المحيط والعمر ، يزعجان بشكل كبير الأنماط الظاهرية السلوكية ل TPR.

نلاحظ أن الضوء يؤثر بشكل كبير على تفضيل درجة الحرارة في Drosophila. وهو يتسق مع حقيقة أن الذباب ث1118 أبقى في LD تفضل درجات حرارة أعلى خلال النهار من تلك التي تبقى في DD، على الرغم من أن التغيرات الإيقاعية لدرجة الحرارة المفضلة لا تزال تحافظ تحت LD و DD3. لذلك ، يؤثر الضوء على تفضيل درجة حرارة الذبابة بشكل مستقل عن الساعة الإيقاعية. نظرا لأنه ليس من الواضح مقدار كثافة الضوء المطلوبة وما هي الآليات التي تنظم تفضيل درجة الحرارة المعتمد على الضوء ، فإننا نستخدم نفس كثافة الضوء (~ 500-1000 لوكس) خلال التجارب للحصول على نتائج قابلة للاستنساخ.

كما تؤثر أعمار الذباب على تفضيل درجة الحرارة. نتجنب استخدام الذباب في اليوم الأول لأن الأنماط الظاهرية ل TPR في اليوم الأول من الذباب (بعد يوم واحد من الفقس) متغيرة. على الرغم من أن الذباب في اليوم الرابع وكبار السن يظهر سلوكا ثابتا في TPR ، إلا أنهم يفضلون درجات حرارة أقل من الذباب القديم لمدة يومين أو ثلاثة أيام. لذلك ، من المهم جدا عدم خلط الذباب ذو الأعمار الواسعة. نحن نستخدم اليوم 2-3 الذباب أو اليوم 4-5 مجموعة الذباب حسب الضرورة.

في طريقة سلوك TPR الحالية ، ندرس فقط سلوكيات تفضيل درجة الحرارة لمدة 30 دقيقة. والسبب في ذلك هو أن الذباب أبقى >1 ساعة في درجة الحرارة التدرج تميل إلى تفضيل انخفاض درجة الحرارة. ربما هذا بسبب نقص الغذاء والماء في الجهاز. لذلك، نحن تجاهل الذباب بعد كل تجربة سلوكية 30 دقيقة. سيكون ميزة كبيرة إذا كان يمكن قياس سلوك TPR بشكل مستمر لمدة 24 ساعة على الأقل ، من الناحية المثالية ~ 15 يوما. في هذه الحالة ، سيتم إجراء فحص سلوك TPR بسهولة دون نقل قوارير الذبابة إلى الحاضنات المختلفة. والأهم من ذلك، أن الأنماط الظاهرية ل TPR ستكون أكثر كفاءة مقارنة بالسلوكيات الإيقاعية الأخرى مثل النشاط الحركي.

الحيوانات حساسة جدا للتغيرات الصغيرة في البيئة. أظهرنا أن سلوك تفضيل درجة حرارة الذباب لا ينظمه عقارب الساعة فحسب ، بل يتأثر بشدة بالضوء. قد يكون TPR الناتج السلوكي الذي يتم دمجه من قبل جميع الإشارات البيئية والدول الداخلية. Drosophila هو نظام نموذج متطور لتشريح الآليات الأساسية لوظائف الدماغ باستخدام مجموعة متنوعة من الأدوات الوراثية ، وبنية الدماغ البسيطة نسبيا والمقاايسات السلوكية متعددة الاستخدامات. لذلك ، يمكن لدراسة اختبارات سلوك تفضيل درجة الحرارة تسليط الضوء على الآليات الأساسية لكيفية دمج الدماغ لمعلومات مختلفة لإنتاج السلوكيات المثلى.

وعلاوة على ذلك، تشير بياناتنا المنشورة مؤخرا إلى أن ذبابة TPR تشترك في ميزات مع الثدييات BTR3. لأن الآليات التي تتحكم في النوم في الذباب مماثلة لتلك التي تتحكم في نوم الثدييات17-20، نعتقد أن المزيد من استكشاف Drosophila TPR سيسهم في فهم أكبر للإيقاع الإيقاعي وسلوك النوم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا يوجد شيء للكشف عنه.

Acknowledgments

نحن ممتنون للدكتورين أرافينتهان صامويل ومارك غيرشو اللذين ساعدا في تطوير النسخة الأولية من الجهاز السلوكي وماثيو باتي الذي قام بتعديل الجهاز السلوكي. وقد دعم هذا البحث من قبل الأمين غرانت من مستشفى سينسيناتي للأطفال، JST/PRESTO، مارس من الدايمات والمعاهد الوطنية للصحة R01 GM107582 إلى F.N.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bright Lab Jr. Safelight Amazon #B00013J8UY Red light for dark rooms
Rain X SOPUS products Water repellent: Apply the plexiglass cover
C-Clamp Home Depot
Temperature/hygrometer Fisher 15-077-963
Peltier devices TE Technology, Inc. HP-127-1.4-1.15-71P
Thermometer Fluke Fluke 52II
Bench top controller Oven Industries 5R6-570-15R and 5R6-570-24R
Temperature sensor probe Oven Industries TR67-32
Generic 480 Watt ATX power supply computer cooling system
MCR220-QP-RES Dual 120 mm Radiator with reservoir  Swiftech computer cooling system
MCP350 In-Line 12V DC pump Swiftech computer cooling system
MCW50 graphics Card liquid cooler Swiftech computer cooling system
Scythe Kaze-Jyuni SY1225SL12SH fan Crazy PC computer cooling system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krauchi, K. The thermophysiological cascade leading to sleep initiation in relation to phase of entrainment. Sleep Med. Rev. 11, 439-451 (2007).
  2. Krauchi, K. The human sleep-wake cycle reconsidered from a thermoregulatory point of view. Physiol. Behav. 90, 236-245 (2007).
  3. Kaneko, H., et al. Circadian Rhythm of Temperature Preference and Its Neural Control in Drosophila. Curr. Biol. 22, 1851-1857 (2012).
  4. Allada, R., Chung, B. Y. Circadian organization of behavior and physiology in Drosophila. Annu. Rev. Physiol. 72, 605-624 (2010).
  5. Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis in C. elegans and Drosophila. Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).
  6. Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, 217-220 (2008).
  7. Hong, S. T., et al. cAMP signalling in mushroom bodies modulates temperature preference behaviour in Drosophila. Nature. 454, 771-775 (2008).
  8. Dillon, M. E., Wang, G., Garrity, P. A., Huey, R. B. Review: Thermal preference in Drosophila. J. Therm. Biol. 34, 109-119 (2009).
  9. Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and. Nature. 423, 822-823 (2003).
  10. Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the Drosophila brain. Cell. 144, 614-624 (2011).
  11. Stevenson, R. D. The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms. Am. Nat. 126 (3), (1985).
  12. Refinetti, R., Menaker, M. The circadian rhythm of body temperature. Physiol. Behav. 51, 613-637 (1992).
  13. Duffy, J. F., Dijk, D. J., Klerman, E. B., Czeisler, C. A. Later endogenous circadian temperature nadir relative to an earlier wake time in older people. Am. J. Physiol. 275, 1478-1487 (1998).
  14. Saper, C. B., Lu, J., Chou, T. C., Gooley, J. The hypothalamic integrator for circadian rhythms. Trends Neurosci. 28, 152-157 (2005).
  15. Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behaviour associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
  16. Qiu, J., Hardin, P. E. per mRNA cycling is locked to lights-off under photoperiodic conditions that support circadian feedback loop function. Mol. Cell Biol. 16, 4182-4188 (1996).
  17. Crocker, A., Sehgal, A. Genetic analysis of sleep. Genes Dev. 24, 1220-1235 (1220).
  18. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
  19. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287, 1834-1837 (2000).
  20. Parisky, K. M., et al. PDF cells are a GABA-responsive wake-promoting component of the Drosophila sleep circuit. Neuron. 60, 672-682 (2008).

Tags

علم الأحياء، العدد 83، Drosophila،الساعة الإيقاعية، درجة الحرارة، إيقاع تفضيل درجة الحرارة، النشاط الحركي، إيقاعات درجة حرارة الجسم
تصميم وتحليل سلوك تفضيل درجة الحرارة وإيقاعها Circadian في <em>Drosophila</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goda, T., Leslie, J. R., Hamada, F.… More

Goda, T., Leslie, J. R., Hamada, F. N. Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila. J. Vis. Exp. (83), e51097, doi:10.3791/51097 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter